專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分離純化達(dá)托霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及達(dá)托霉素的制備方法，具體的說(shuō)涉及一種采用陶瓷膜過(guò)濾、樹(shù)脂層析以及結(jié)晶技術(shù)制備高純度達(dá)托霉素的方法。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的發(fā)展及抗生素的濫用，病原菌對(duì)抗生素的耐藥性是當(dāng)今社會(huì)面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。除了控制抗生素濫用外，目前尋找一種有效的對(duì)抗耐藥菌的抗生素成了解決這一問(wèn)題的最佳途徑，萬(wàn)古霉素曾被認(rèn)為是對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌的最后一道防線，但現(xiàn)在全世界臨床已發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的耐此藥菌。
達(dá)托霉素(Daptomycin)是由LillyGL^)公司最初研究,Cubist制藥公司開(kāi)發(fā)的一環(huán)脂肽類(lèi)抗生素。應(yīng)病人對(duì)新型耐藥抗生素的迫切需求，2003年底，美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)經(jīng)過(guò)快速審理程序批準(zhǔn)注射用達(dá)托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治療由一些革蘭氏陽(yáng)性敏感菌株引起的并發(fā)性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染，如膿腫、手術(shù)切口感染和皮膚潰瘍。達(dá)托霉素的作用機(jī)制與其他抗生素不同，它通過(guò)擾亂細(xì)胞膜對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成，改變細(xì)胞質(zhì)膜的性質(zhì)；另外，它還能通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，使其內(nèi)容物外泄而達(dá)到殺菌的目的，因此細(xì)菌對(duì)達(dá)托霉素產(chǎn)生耐藥性可能會(huì)比較困難。達(dá)托霉素雖然已經(jīng)在美國(guó)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但在中國(guó)并未實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，其主要原因在于沒(méi)有能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化的提取技術(shù)。現(xiàn)有的達(dá)托霉素提取方法，例如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200910058577. 7所描述的達(dá)托霉素提取方法，僅采用大孔樹(shù)脂分離純化達(dá)托霉素，所得的達(dá)托霉素色譜純度僅為80% -90%，不但不能滿(mǎn)足制藥需求，而且因?yàn)槠涑杀靖甙憾鵁o(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200910085837. X雖然采用離子交換樹(shù)脂方法獲得高純度的達(dá)托霉素，但是因存在達(dá)托霉素被嚴(yán)重破壞的問(wèn)題而無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離純化達(dá)托霉素的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉同時(shí)又能制得高純度達(dá)托霉素的制備方法。其包括如下步驟I)將達(dá)托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH2. 0-4. 5后，用膜孔徑為O. 01 μ m_0. I μ m的陶瓷膜進(jìn)行過(guò)濾，然后用pH2. 0-4. O的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜,棄濾液，再用pH8-10的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達(dá)托霉素濾液；2)將步驟I)所得達(dá)托霉素濾液調(diào)節(jié)pH4. 5-7. O,經(jīng)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂吸附、洗脫后得到達(dá)托霉素解吸液；3)將步驟2)所得達(dá)托霉素解吸液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂吸附、解吸脫色后得達(dá)托霉素脫色液；4)將步驟3)所得達(dá)托霉素脫色液經(jīng)截留分子量為50-500的納濾膜系統(tǒng)濃縮，得到達(dá)托霉素濃縮液；5)將步驟4)所得達(dá)托霉素濃縮液調(diào)節(jié)pH5. 0-7. 0，然后加入無(wú)機(jī)鈣鹽和醇類(lèi)溶劑進(jìn)行結(jié)晶，晶體過(guò)濾干燥后得到固體達(dá)托霉素。上述步驟I)中，首先將發(fā)酵液pH調(diào)至2. 0-4. 5，由于達(dá)托霉素等電點(diǎn)為PI3. 5，在pH2. 0-4. 5的條件下，達(dá)托霉素形成分子量很大的膠束，不會(huì)透過(guò)陶瓷膜。洗滌所用的PH2. 0-4. O酸性水溶液可以采用磷酸溶液，其用量通常是發(fā)酵液體積的1-2倍；所述堿性水溶液可以是PH8-10的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，其用量以發(fā)酵液體積的4-5倍為宜。洗滌完后，達(dá)托霉素的收率在92%以上。上述步驟2)采用弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離系統(tǒng)分離純化達(dá)托霉素，優(yōu)選D301樹(shù)脂，D301樹(shù)脂價(jià)格便宜，成本低，而且它對(duì)達(dá)托霉素的選擇性較強(qiáng)。D301樹(shù)脂的裝填內(nèi)徑和高度比一般為I : 5 I : 7，優(yōu)選為I : 6。洗脫液可采用pH5. 5-6. O的NaCl溶液。 上述步驟3)采用大孔樹(shù)脂分離系統(tǒng)進(jìn)一步分離純化達(dá)托霉素，優(yōu)選為HZ20樹(shù)月旨，這種樹(shù)脂價(jià)格便宜，顆粒較粗，不易造成堵塞。HZ20樹(shù)脂的裝填內(nèi)徑和高度比一般為
I: 5 I : 7，優(yōu)選為I : 6。用大孔樹(shù)脂吸附達(dá)托霉素后，可先用15%-20%乙醇溶液清洗大孔樹(shù)脂,再用30% -35%的乙醇溶液將達(dá)托霉素洗脫下來(lái)。上述步驟4)納濾膜的截留分子量?jī)?yōu)選為100-200。上述步驟5)無(wú)機(jī)鈣鹽的加入量以濃縮液中所含達(dá)托霉素質(zhì)量的30% 50%為宜，所述無(wú)機(jī)鈣鹽例如氯化鈣、乙酸鈣。所述醇類(lèi)溶劑常用的有乙醇和異丙醇，其加入量通常是濃縮液體積的3-6倍。上述各步驟，一般的，采用磷酸、乙酸和氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH。在本發(fā)明方法中，達(dá)托霉素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)陶瓷膜系統(tǒng)、弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離系統(tǒng)和大孔樹(shù)脂分離系統(tǒng)分離純化和脫色處理后，收集純度85%以上組分再經(jīng)過(guò)納濾膜系統(tǒng)濃縮至濃度20%左右，加醇類(lèi)溶劑結(jié)晶，晶體過(guò)濾干燥后得到的達(dá)托霉素固體其色譜純度在98%以上。該方法簡(jiǎn)單易行，成本低廉，適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例所用實(shí)驗(yàn)材料均為達(dá)托霉素發(fā)酵液，其為pH7. O左右的較粘稠料液。實(shí)施例I將達(dá)托霉素發(fā)酵液用磷酸調(diào)節(jié)至pH3. O后，經(jīng)過(guò)孔徑O. 05 μ m的陶瓷膜過(guò)濾除去達(dá)托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，然后用原料液1-2倍體積的pH3. O的磷酸水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜(濾液棄去)，再用原料液4-5倍體積的pH9. O的氫氧化鈉溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)ρΗ5· 5過(guò)D301樹(shù)脂，水洗D301樹(shù)脂，然后在ρΗ5· 5-6. O用300mM的NaCl溶液洗脫。所得洗脫物用稀乙酸調(diào)節(jié)pH4. 0-4. 5并加入料液體積10%的乙醇后過(guò)HZ20樹(shù)脂(上海華震公司生產(chǎn)的大孔吸附樹(shù)脂)，用15% -20%乙醇溶液(注乙醇溶液的百分濃度指體積百分濃度，下同)清洗HZ20樹(shù)脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脫。洗脫物經(jīng)過(guò)截留分子量為100-200的納濾膜納濾濃縮，濃縮后達(dá)托霉素濃度在20% (w/w)。將所得濃縮液用稀乙酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6. 0，加入該濃縮液中達(dá)托霉素質(zhì)量含量40 %左右的乙酸鈣，加入濃縮液4倍體積的95 %乙醇，冰箱放置15h，過(guò)濾干燥，得到的固體達(dá)托霉素。采用高效液相色譜法(檢測(cè)條件與歐洲專(zhuān)利“PROCESS FOR THE PURIFICATION0FDAPT0MYCIN”(EP I 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)檢測(cè)達(dá)托霉素純度，其純度在99%以上。實(shí)施例2將達(dá)托霉素發(fā)酵液用磷酸調(diào)節(jié)至pH3. 5后，經(jīng)過(guò)孔徑O. 05 μ m的陶瓷膜過(guò)濾除去達(dá)托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，然后用原料液1-2倍體積的pH3. O的磷酸水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜(濾液棄去)，再用原料液4-5倍體積的pHIO的氫氧化鈉溶液 循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。 將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)ρΗ5· 5過(guò)D301樹(shù)脂，水洗D301樹(shù)脂，然后在ρΗ5· 5-6. O用300mM的NaCl溶液洗脫。所得洗脫物用稀乙酸調(diào)節(jié)pH4. 0-4. 5并加入料液O. I倍體積的乙醇后過(guò)HZ20樹(shù)月旨，用15% -20%乙醇溶液清洗HZ20樹(shù)脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脫。洗脫物經(jīng)過(guò)截留分子量為100-200的納濾膜納濾濃縮，濃縮后達(dá)托霉素濃度在20% (w/w)。將所得濃縮液用稀乙酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6. 0，加入該濃縮液中達(dá)托霉素質(zhì)量含量40 %左右的乙酸鈣，加入濃縮液4倍體積的95 %乙醇，冰箱放置15h，過(guò)濾干燥，得到的固體達(dá)托霉素，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，其純度在99%以上。實(shí)施例3將達(dá)托霉素發(fā)酵液用磷酸調(diào)節(jié)至pH3. O后，經(jīng)過(guò)孔徑O. 05 μ m的陶瓷膜過(guò)濾除去達(dá)托霉素發(fā)酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物質(zhì)，然后用原料液O. 5-1倍體積的pH3. O的磷酸水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜(濾液棄去)，再用原料液2-3倍體積的pHIO. O的氫氧化鈉溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜得到陶瓷膜濾液，所得濾液澄清透明，且顏色為紅黃色。將濾液用稀乙酸調(diào)節(jié)pH6. 0-7. O過(guò)D301樹(shù)脂，水洗D301樹(shù)脂，然后在pH6. 0-7. O用300mM的NaCl溶液洗脫。所得洗脫物用稀乙酸調(diào)節(jié)pH4. 0-4. 5并加入料液0. I倍體積的乙醇后過(guò)HZ20樹(shù)月旨，用15% -20%乙醇溶液清洗HZ20樹(shù)脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脫。洗脫物經(jīng)過(guò)截留分子量為100-200的納濾膜納濾濃縮，濃縮后達(dá)托霉素濃度在20% (w/w)左右。將所得濃縮液用稀乙酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH6. 5-7. O,加入該濃縮液中達(dá)托霉素質(zhì)量含量40%左右的乙酸鈣，加入濃縮液5倍體積的95%乙醇，冰箱放置15h，過(guò)濾干燥，得到的固體達(dá)托霉素，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，其純度在98 %以上。本發(fā)明所用膜在使用后均要用膜清洗劑清洗，必要時(shí)用0. 5%亞硫酸氫鈉溶液浸泡保存，以達(dá)到膜的重復(fù)利用。本發(fā)明綜合采用膜、層析技術(shù)及結(jié)晶手段提供一種生產(chǎn)可行、成本低廉的制備高純度達(dá)托霉素的工藝技術(shù)。雖然本文已經(jīng)對(duì)該發(fā)明進(jìn)行了詳盡的描述，但可以理解，在不違背本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以做一些修改或變動(dòng)，這些修改或變動(dòng)均在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi) 。
權(quán)利要求
1.一種分離純化達(dá)托霉素的方法，包括下述步驟 1)將達(dá)托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)PH2.0-4. 5后，用膜孔徑為O. 01 μ m-0. I μ m的陶瓷膜進(jìn)行過(guò)濾，然后用PH2. 0-4. O的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，棄濾液，再用PH8-10的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達(dá)托霉素濾液； 2)將步驟I)所得達(dá)托霉素濾液調(diào)節(jié)pH4.5-7.0，經(jīng)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂吸附、洗脫后得到達(dá)托霉素解吸液； 3)將步驟2)所得達(dá)托霉素解吸液經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附、解吸脫色后得達(dá)托霉素脫色液； 4)將步驟3)所得達(dá)托霉素脫色液經(jīng)截留分子量為50-500的納濾膜系統(tǒng)濃縮，得到達(dá)托霉素濃縮液； 5)將步驟4)所得達(dá)托霉素濃縮液調(diào)節(jié)pH5.0-7. 0，然后加入無(wú)機(jī)鈣鹽和醇類(lèi)溶劑進(jìn)行結(jié)晶，晶體過(guò)濾干燥后得到固體達(dá)托霉素。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中洗滌所用的pH2.0-4. O酸性水溶液米用磷酸溶液，其用量是發(fā)酵液體積的1_2倍。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述堿性水溶液為氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，其用量為發(fā)酵液體積的4-5倍。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)所述弱堿性陰離子交換樹(shù)脂為D301樹(shù)脂，其裝填內(nèi)徑和高度比為I : 5 I : 7。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)采用pH5.5-6. O的NaCl溶液將達(dá)托霉素從弱堿性陰離子交換樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟3)所述大孔樹(shù)脂為HZ20樹(shù)脂，其裝填內(nèi)徑和高度比為I : 5 I : 7。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟3)用大孔樹(shù)脂吸附達(dá)托霉素后，先用15% -20%乙醇溶液清洗大孔樹(shù)脂，再用30% -35%的乙醇溶液將達(dá)托霉素洗脫下來(lái)。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟4)所用納濾膜的截留分子量為100-200。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟5)中無(wú)機(jī)鈣鹽的加入量是濃縮液中所含達(dá)托霉素質(zhì)量的30% 50% ;醇類(lèi)溶劑的加入量為濃縮液體積的3-6倍。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟5)中所述無(wú)機(jī)鈣鹽是下列鈣鹽中的一種或多種乙酸鈣和氯化鈣；所述醇類(lèi)溶劑為乙醇或異丙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分離純化達(dá)托霉素的方法，該方法使達(dá)托霉素形成膠束，經(jīng)陶瓷膜系統(tǒng)過(guò)濾后，再采用弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離系統(tǒng)和大孔樹(shù)脂分離系統(tǒng)進(jìn)行分離純化和脫色處理，最后結(jié)晶，獲得色譜純度大于98％的達(dá)托霉素固體。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，成本低廉，適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102875652SQ20111019474
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者趙燕, 趙德, 肖祖梅 申請(qǐng)人:北大方正集團(tuán)有限公司, 北大國(guó)際醫(yī)院集團(tuán)重慶大新藥業(yè)股份有限公司, 北大國(guó)際醫(yī)院集團(tuán)有限公司