專利名稱：一種新的純化無頜類脊椎動物血清天然蛋白-intelectin的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ftOtein G親和層析法在無頌類脊椎動物血清蛋白intelectin純化中的應(yīng)用。屬蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
凝集素(lectin)是一種從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白。它因能使紅細(xì)胞或其他細(xì)胞凝集故名凝集素。其最大的特點(diǎn)是能夠識別糖蛋白和糖肽，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)。一種凝集素具有對某一種特異性糖基專一性的結(jié)合能力。因此凝集素可以作為一種探針來研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。凝集素也因其能夠識別僅在病原中發(fā)現(xiàn)或是無法進(jìn)入宿主細(xì)胞的糖類而在免疫系統(tǒng)中扮演重要的角色。Intelectin(ITLN)是lectin家族中發(fā)現(xiàn)的較新的一類基因。它能夠結(jié)合多種細(xì)菌表面的糖結(jié)構(gòu)。當(dāng)有機(jī)體受到這些細(xì)菌感染時，intelectin能夠輔助吞噬細(xì)胞清除細(xì)菌。研究表明，在許多物種中，intelectin具有潛在的抵抗外界抗原的功能，并因此參與免疫反應(yīng)。htelectin的這些功能使其在制藥及科學(xué)研究中都具有深遠(yuǎn)的意義。然而天然活性蛋白的分離純化仍是一個比較復(fù)雜的工藝。因此，仍需要經(jīng)濟(jì)有效的方法分離純化大然 intelectin。Protein G是一種來自G類str印tococci細(xì)菌的細(xì)胞壁蛋白，它屬于第三類的Fc 受體蛋白，能夠同IgG上的Fc區(qū)域特異性的結(jié)合。使用ftOtein G Agarose純化抗體的原理正是基于這種高度的親和能力。Protein G能夠廣泛的結(jié)合來自真核生物的各種抗體，是在實(shí)驗(yàn)室水平純化抗體的很好的選擇。但至今沒有用ftOtein G Agarose純化其他蛋白的實(shí)例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種經(jīng)濟(jì)有效的日本七鰓鰻intelectin天然蛋白的純化方法，即通過日本七鰓鰻血清與ftOtein G Agarose孵育結(jié)合并沉淀獲得。該過程可通過以下步驟達(dá)到(a)日本七鰓鰻血清的制備泄殖腔下方斷尾采集新鮮日本七鰓鰻血液，2-8°C孵育lh，8000rpm離心8-15min。 取上清，獲得日本七鰓鰻血清。將血清用緩沖液A(0.02mol/L PB，pH7. 4士0. 1)稀釋10-15 倍，經(jīng)孔徑不大于0. 45 μ m的濾膜過濾準(zhǔn)備上樣。(b) Intelectin 蛋白用 Protein G Agarose 層析介質(zhì)進(jìn)行純化Protein G Agarose層析介質(zhì)(購自GE公司)用緩沖液A平衡不少于10倍柱體積，流速為2-aiil/min，紫外檢測至基線；
將日本七鰓鰻血清樣品以不高于lml/min的速度通過層析介質(zhì)；然后用緩沖液A以2-3ml/min的速度清洗上樣后的層析柱，用量不少于10倍體積，紫外檢測至基線；再用緩沖液B(0. lmol/L Gly-HCl, pH 2. 7士0· 1)以 3-4ml/min 的速度洗脫層析介質(zhì)并收集洗脫峰。洗脫時應(yīng)邊洗脫邊用緩沖液C(lmol/L Tris-HCl, pH 9.0士0.1)中和至pH 7-8，洗脫液洗脫每1或2滴中和一次。洗脫后的蛋白立即透析于pH 7.2-7.4的 0. 01mol/L PBS緩沖液中，2_8°C透析8-16小時。本發(fā)明將純化所得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在66kD和40kD處得到兩個特
異性條帶。本發(fā)明將洗脫的蛋白進(jìn)行雙向電泳。經(jīng)由等電聚焦，垂直SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍(lán)R250染色，結(jié)果分別在66kD和40kD處得到特異性的點(diǎn)。選取這兩個點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示兩種分子量的蛋白分別為intelectin的兩個亞型。本發(fā)明從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得無頌類脊椎動物intelectin序列和高等動物免疫球蛋白Fc段序列，用生物軟件GeneDoc進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)二者具有同源性。這為本發(fā)明的順利實(shí)施奠定了理論基礎(chǔ)。


圖1是日本七鰓鰻血清與ftOtein G Agarose孵育結(jié)合，沉淀所得的蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果。其中，1 沉淀前的七鰓鰻血清；2 裂解的ftx)tein G Agarose ；3 用ftOtein G Agarose沉淀下來的條帶；4 沉淀時的七鰓鰻血清洗滌液。圖2是對沉淀下來的血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析的結(jié)果。圖3是無頌類脊椎動物intelectin與高等動物免疫球蛋白Fc段序列比對結(jié)果。圖4是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)流程。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明已經(jīng)成功用ftOtein G Agarose凝膠對七鰓鰻血清進(jìn)行了沉淀反應(yīng)。并通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析，得到沉淀的蛋白為intelectin。將無頌類脊椎動物與高等動物免疫球蛋白Fc段進(jìn)行序列比對，分析結(jié)果表明二者具有同源性。這為本發(fā)明的成功實(shí)施提供了理論依據(jù)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動都將落入本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1 日本七鰓鰻htelectin蛋白用ftx)tein G Agarose層析介質(zhì)進(jìn)行純化日本七鰓鰻泄殖腔下方斷尾采集新鮮血液，4°C孵育lh，8000rpm離心lOmin，取上清，即為血清。將血清稀釋10倍，0.45μπι濾器過濾，作為待純化的樣品。純化過程如下(1)灌膠將保存于20%乙醇中的ftOtein G Agarose層析介質(zhì)(購自GE公司) 上層乙醇去除，用三蒸水重懸介質(zhì)，緩慢灌入層析柱，避免氣泡產(chǎn)生，開至最大流速，使介質(zhì)壓實(shí)；(2)平衡用緩沖液A以2-3ml/min的速度流經(jīng)層析介質(zhì)，平衡不少于10倍柱體積，紫外檢測至基線；(3)上樣待純化血清樣品以不高于lml/min速度上樣；(4)洗滌用緩沖液A清洗上樣后的凝膠介質(zhì)，流速為2-3ml/min，清洗不少于10 倍柱體積，紫外檢測至基線；(5)洗脫用緩沖液B以3-^il/min的速度洗脫，邊洗脫邊用緩沖液C及時中和至 PH7-8，紫外檢測洗脫峰并收集，洗脫液在0. 01mol/L PBS中2_8°C透析8_16小時。結(jié)果沉淀反應(yīng)后得到兩條特異性條帶，分子量分別為66kD和40kD(圖1)。實(shí)施例2 沉淀產(chǎn)物的鑒定1.雙向凝膠電泳第一向等電聚焦電泳，沉淀蛋白樣品以水化液(8mol/L尿素+質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% CHAPS+0. 065mol/L DTT+體積分?jǐn)?shù)0. 2% Bio-Lyte+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 001 %溴酚藍(lán))充分溶解后，沿聚焦盤中槽邊緣自左向右線性加入樣品，避免氣泡產(chǎn)生。待樣品加入聚焦盤中后，用鑷子輕輕去除IPG膠條上的保護(hù)層，膠面朝下置于聚焦盤樣品溶液上，使膠條正極對應(yīng)于聚焦盤正極。在膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止液體蒸發(fā)。設(shè)置聚焦程序，開始聚焦。聚焦結(jié)束的膠條立即在平衡緩沖液I (6mol/L尿素+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SDS+0. 375mol/L Tirs-HCl， PH8. 8+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% DTT+體積分?jǐn)?shù)20%甘油+痕量溴酚藍(lán))中平衡15min，然后再在平衡緩沖液 II(6mol/L 尿素 + 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2% SDS+0. 375mol/L Tirs-HCl，pH8. 8+質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2. 5% 碘乙酰胺+體積分?jǐn)?shù)20%甘油+痕量溴酚藍(lán))中平衡15min。第二向垂直板SDS-PAGE電泳，將平衡后的IPG膠條移至15% SDS-PAGE連續(xù)膠上端，并在其酸性端的外側(cè)加上SDS-PAGE蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以瓊脂糖封固。于 20°C循環(huán)水恒溫，先以5mA/gel進(jìn)樣，再以30mA/gel恒流電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)距膠底邊 0. 5-lcm處停止電泳，取出凝膠，考馬斯亮藍(lán)R250染色。結(jié)果分別在66kD和40kD處得到特異性的點(diǎn)。2.質(zhì)譜技術(shù)分別選取66kD和40kD處的點(diǎn)作為質(zhì)譜1號和2號樣品，切膠置于1. 5mlEppendorf 管(已硅化)中，處理成Imm左右的膠片。由布魯克質(zhì)譜測序儀進(jìn)行質(zhì)譜測序。結(jié)果質(zhì)譜測序的結(jié)果顯示，沉淀得到的兩種蛋白均為intelectin (圖2)，為兩個不同亞型。實(shí)施例3 蛋白序列比對從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得無頌類脊椎動物intelectin兩個亞型序列以及高等動物免疫球蛋白Fc段序列。利用GeneDoc生物軟件進(jìn)行同源性序列比對。結(jié)果無頌類脊椎動物intelectin與高等動物抗體Fc段具有同源性(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種無頌類脊椎動物血清蛋白intelectin的提取純化方法，其特征在于，該方法按照以下步驟進(jìn)行(1)泄殖腔下方斷尾采集日本七鰓鰻新鮮血液，2-8°C孵育lh，8000rpm離心8-15min， 取上清即為血清；將血清用緩沖液A稀釋10-15倍，經(jīng)孔徑不大于0. 45 μ m的濾膜過濾，準(zhǔn)備上樣；(2)Protein G Agarose層析介質(zhì)(購自GE公司)用緩沖液A平衡不少于10倍柱體積，流速為2-aiil/min，紫外檢測至基線；(3)將血清樣品緩緩加入ftOteinG Agarose層析介質(zhì)中，以不高于lml/min的速度上樣；(4)待樣品完全上完后，再用緩沖液A清洗層析介質(zhì)至基線，不少于10倍柱體積，流速為2-3ml/min，紫外檢測至基線；(5)用緩沖液B洗脫上樣之后的層析介質(zhì)，流速為3-^il/min，邊洗脫邊用緩沖液C及時中和至pH7-8，每1或2滴中和一次，收集洗脫峰；(6)洗脫后的蛋白立即用pH7. 2-7. 4的0. 01mol/L PBS緩沖液在2_8°C透析8-16小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，利用ftOteinG Agarose層析介質(zhì)進(jìn)行純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(2)和(4)中，緩沖液的用量不少于10 倍柱體積，紫外檢測確保介質(zhì)已平衡清洗至基線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟( 和中，緩沖液的流速均為 2-3ml/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(3)中，其上樣的流速為不高于Iml/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(5)中，洗脫流速為3-^il/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(5)中，洗脫時每1或2滴中和一次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(5)中，洗脫時用緩沖液C中和洗脫液至 PH7-8。
9.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征是，所用緩沖液A為0.02mol/LPB，pH 7. 4 士 0. 1。
10.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征是，所用緩沖液Imol/ LGly-HCl，pH 2.7士0. 1。
11.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征是，所用中和緩沖液C為lmol/L Tris-HCl, pH 9.0士0. 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及Protein G親和層析法純化無頜類脊椎動物血清中的天然蛋白-intelectin。包括提取新鮮的日本七鰓鰻血清，將其與Protein GAgarose進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，電泳檢測得到兩條特異性條帶，分子量分別為66kD和40kD。沉淀得到的蛋白進(jìn)行雙向電泳后經(jīng)質(zhì)譜分析表明均為intelectin。序列比對顯示intelectin與高等動物免疫球蛋白Fc段具有同源性，這為其能與Protein G Agarose共沉淀提供了證據(jù)。Intelectin是一種重要的免疫抗菌分子，本發(fā)明為實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究及生物制藥提供了一種操作快速簡便且經(jīng)濟(jì)有效的無頜類脊椎動物天然蛋白intelectin的純化方法。
文檔編號C07K14/435GK102399278SQ201110195298
公開日2012年4月4日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者馮波, 吳芬芳, 李慶偉 申請人:遼寧師范大學(xué)