專利名稱：一種合成含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物單元的多肽的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種在多肽固相合成中制備序列中含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物 [Asp-Arg(X)]單元的多肽的新方法，尤其適用于由于精氨酸或精氨酸衍生物的存在導(dǎo)致合成中易發(fā)生天冬酰亞胺副反應(yīng)的多肽序列，和用這種方法得到的產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計劃的完成，人類基因的注釋與確認已成為生命科學(xué)面臨的最重要任務(wù)之一。而蛋白質(zhì)是生命活動的功能執(zhí)行體，人類基因組中絕大部分基因及其功能有待于在蛋白質(zhì)水平上的揭示與闡述。所以蛋白質(zhì)組研究已成為21世紀(jì)生命科學(xué)的焦點之一，它將全景式地揭示生命活動的本質(zhì)，特別是人體健康與疾病的機制，將直接關(guān)系到未來整個生物技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展空間和市場份額，是國際生物科技的戰(zhàn)略制高點。在人類后基因組即蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，將需要合成大量的多肽和蛋白質(zhì)，其市場前景不可低估。多肽是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的一類化合物，其分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質(zhì)。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結(jié)構(gòu)；設(shè)計新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；為多肽生物合成反應(yīng)機制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。并且，從動物、植物和微生物等生物體中分離提取多肽極受來源的限制，多肽的化學(xué)合成則具有更光明的工業(yè)化前景。多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，合成一般從羧基端向氨基端合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的，但自從1963年Merrif ield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)， 表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點。其基本原理是先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)(縮合一洗滌一去保護一洗滌一下一輪縮合)操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用Boc (叔丁氧羰基)保護的稱為Boc固相合成法，α -氨基用Fmoc (9_芴甲氧羰基)保護的稱為Fmoc固相合成法。天冬酰亞胺的形成是固相合成中最常見的副反應(yīng)之一，其發(fā)生機理是α -酰胺鍵中的氮原子與側(cè)鏈β-羧基之間的關(guān)環(huán)反應(yīng)。在目前廣泛采用的Fmoc/tBu合成策略中這個問題尤其嚴(yán)重，這是因為在合成過程中去除氨基的保護基Fmoc時要頻繁使用六氫吡啶(PIPE)，而PIPE是一種仲胺分子，其堿性能促進此副反應(yīng)的發(fā)生。形成的五元環(huán)天冬酰亞胺分子在堿性條件下非常容易發(fā)生消旋，而且其它親核試劑也可進攻酰胺鍵發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，從而產(chǎn)生多種副反應(yīng)產(chǎn)物。例如，水分子進攻天冬酰亞胺產(chǎn)生β-天冬氨酸多肽；而 PIPE導(dǎo)致的開環(huán)反應(yīng)則產(chǎn)生α-和β-六氫吡啶多肽分子。圖1給出了天冬酰亞胺副反應(yīng)的發(fā)生機理以及產(chǎn)生的多種副產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通常來說，在常規(guī)多肽固相合成中天冬酰亞胺產(chǎn)物的形成比例比較低，在優(yōu)化條件(如去除Fmoc時使用的PIPE溶液中添加1_羥基苯并三唑)中一般都可以制備得到正確的目標(biāo)多肽。但在合成中我們發(fā)現(xiàn)，含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物單元的多肽分子在合成過程中會遇到很大的困難，得到粗肽的純度較低，天冬酰亞胺相關(guān)的副產(chǎn)物嚴(yán)重干擾反相高效液相色譜的純化，不能制備出純度高的目標(biāo)多肽產(chǎn)物，如采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc/tBu固相多肽合成法合成多肽 KH-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-G In-As^IArKiMelJ-Arg-Glu-Arg-Pro-Tyr-OH)時，粗肽質(zhì)譜圖(圖 2)上除了正確的分子離子峰外，還出現(xiàn)了含量很高的分子量較理論分子量大67D的組分。這種情況有時會非常嚴(yán)重時，得到的是完全錯誤的產(chǎn)物，如合成多肽2(H-Gly-ASD-「Arg(Me)2l-Gly-Gly-Phe-G lyPro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-Arg-Arg-Glu-Arg-Pro-Tyr -OH)時，得到的粗肽的分子量比理論分子量小18D，質(zhì)譜圖見圖3，未出現(xiàn)正確產(chǎn)物的離子峰。這些都是典型的與天冬酰亞胺相關(guān)的副產(chǎn)物。這種現(xiàn)象是由精氨酸的側(cè)鏈胍基具有的堿性引起的，其與堿性的PIPE分子共同作用極大程度的促進合成過程中在相鄰天冬氨酸上發(fā)生天冬酰亞胺副反應(yīng)的可能，從而導(dǎo)致整個合成的徹底失敗。這種情況下，就需要一種合成含有這類天冬氨酸-精氨酸及衍生物單元的有效方法，以最大程度的壓制天冬酰亞胺副反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明的一個目的就是針對這類特殊序列提供一種簡單可行的合成策略，提高這類多肽分子的合成成功率。本發(fā)明的進一步的目的是提高粗品純度，以提供具有更高純度(> 95% )的最終多肽產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明關(guān)于一種在多肽固相合成中制備含有精氨酸以及精氨酸及衍生物單元的多肽的新方法，尤其適用于由于精氨酸或精氨酸衍生物的存在導(dǎo)致合成過程中易發(fā)生天冬酰亞胺副反應(yīng)的多肽序列，和用這種方法得到的產(chǎn)物。此方法包括一種，在樹脂上分別合成以精氨酸以及精氨酸衍生物為分割點的兩段序列，而后將此兩段序列連接而成制備目標(biāo)多肽的的策略，在這種方法中，分段合成使得天冬氨酸殘基徹底避免了同時接觸堿性的精氨酸胍基側(cè)鏈和PIPE的環(huán)境，有效壓制了天冬酰胺副反應(yīng)的產(chǎn)生，提高這類多肽的合成成功率。此種制備含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物[Asp-Arg(X)]單元的多肽的方法如圖 4所示，1)其特征在于，該方法依次包括下列步驟①將多肽序列在Asp-Arg(X)處分為兩段，一段以Asp作為羧基端，標(biāo)記為片段A ；另一段以Arg(X)作為氨基端，標(biāo)記為片段B ；片段A在對酸高度敏感的2-氯三苯基氯(CTC)樹脂上采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法進行合成，弱酸性條件下切割制備得到全保護的片段，在這種切割條件下，連接在氨基端氨基上的基團以及側(cè)鏈基團的保護基均不受影響。②采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法合成片段B，采用25體積％六氫吡啶(PIPE) / 二甲基甲酰胺(DMF)處理去除Arg(X)的α -氨基的Fmoc 保護基。③將片段A的羧基進行活化，與片段B的氨基端氨基進行縮合，從而完成整個序列的合成。④使用三氟乙酸切割條件將肽鏈從樹脂上切割下來，在此酸性條件下氨基酸側(cè)鏈保護基也均被去除，利用反相高效液相色譜儀對粗肽進行純化，制備得到目標(biāo)多肽純品。2) 本方法的特征在于，將多肽序列在Asp-Arg (X)處分為兩段分別進行合成?；帽痉椒ǖ奶?br> 4征在于，片段A在對酸高度敏感的CTC樹脂上進行合成以制備全保護的片段。4)本方法的特征在于，多肽序列中的Arg (X)包括但不僅限于精氨酸Arg，單甲基化精氨酸Arg (Me)，雙甲基化精氨酸Arg (Me)2和三甲基化精氨酸Arg(Me)3。5)本方法的特征在于，合成過程中的 Asp的羧基保護基包括但不僅限于叔丁氧基(OtBu)，烯丙氧基(OAll)，芐氧基(OBzl)，甲氧基(OMe)。6)本方法的特征在于，包含天冬氨酸-精氨酸及衍生物單元，但不僅限于一個天冬氨酸-精氨酸及衍生物單元。需要指出的是，此方法采用兩段序列分別合成的方式，能夠大幅提高多肽的合成速度；另外在多肽固相合成中由于某些二級結(jié)構(gòu)的形成會包埋反應(yīng)位點，導(dǎo)致合成難度增大，而這種片段縮合法能阻止這些二級結(jié)構(gòu)的形成，從而明顯降低了合成難度，這也是傳統(tǒng)方法所不具備的重要優(yōu)勢。


圖1是多肽固相合成中天冬酰亞胺副反應(yīng)的發(fā)生機理以及產(chǎn)生的多種副產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2是多肽1采用常規(guī)固相合成法得到粗品的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MQ圖。理論分子量^03D，測得分子量為和^72D，前者對應(yīng)產(chǎn)物的分子離子峰，后者為天冬酰亞胺副反應(yīng)產(chǎn)生的PIPE加合物。圖3是多肽2采用常規(guī)固相合成法得到粗品的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。理論分子量 3045D，測得分子量為30 ,對應(yīng)為天冬酰亞胺副反應(yīng)產(chǎn)生的脫水產(chǎn)物。圖4是本專利描述的新方法用于制備含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物 [Asp-Arg(X)]單元的多肽的流程圖。圖5是多肽3采用新方法合成得到的粗品的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。理論分子量 3272D，測得分子量為3273D，對應(yīng)為目標(biāo)多肽的分子離子峰。圖6是多肽3采用新方法制備得到純品的RP-HPLC檢測圖。最終的產(chǎn)品純度達到了 95%以上。流動相為水與乙腈的混合體系，檢測波長為220nm，濃度lmg/ml。圖7是多肽4采用新方法合成得到的粗品的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。理論分子量 3272D，測得分子量為3272D，對應(yīng)為目標(biāo)多肽的分子離子峰。圖8是多肽4采用新方法制備得到純品的RP-HPLC檢測圖。最終的產(chǎn)品純度達到了 98%以上。流動相為水與乙腈的混合體系，檢測波長為220nm，濃度lmg/ml。
具體實施例方式將多肽序列在Asp-Arg(X)處分為兩段一段以Asp作為羧基端，標(biāo)記為片段A ；另一段以Arg(X)作為氨基端，標(biāo)記為片段B。兩個片段的合成均采用手動固相Fmoc/tBu法，從羧基端向氨基端方向合成。25體積％六氫吡啶/DMF浸泡樹脂兩次以去除氨基的Fmoc保護基使氮基端成為自由氨基，第一次時長8分鐘，第二次時長10分鐘。而后，用3倍當(dāng)量氨基酸/1-羥基苯并三唑(HOBt)/N， N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)與樹脂進行接枝引入C端第二個氨基酸殘基。如此反復(fù)依次連接各個氨基酸殘基以完成整條多肽的合成。以上每步反應(yīng)后都需用二甲基甲酰胺洗滌樹脂八次以上，并且都通過Kaiser Test檢測來對反應(yīng)進行控制，若某個氨基酸縮合反應(yīng)不完全，重復(fù)縮合一次，直至得到所需的目標(biāo)肽段。兩個片段A和B的合成不同之處在于，其中片段A是在對酸高度敏感的2-氯三苯基氯(CTC)樹脂上進行合成，完成本片段的整個序列后，最后一個氨基酸的氨基保護基 Fmoc保留在多肽序列中；弱酸性條件1體積％三氟乙酸/ 二氯乙烷中切割1小時，濾液加入到10倍量石油醚/無水乙醚(1 1, ν/ν)中使多肽沉淀析出，離心后干燥，即得到片段 A的粗品。在此切割條件下連接在氨基端氨基上的以及所有氨基酸側(cè)鏈的保護基均不受影響，制備得到的是全保護的片段。片段B的合成完成后不進行切割，使整個片段仍接枝在樹脂上；而去除最后末端氨基的Fmoc保護基后，其氨基端以自由氨基形式存在，。得到的片段A粗品純度很高，不用進一步的純化即可直接用于合成。用DIC/HOBt 法對其羧基端活化后與在樹脂上的片段B發(fā)生酰胺化反應(yīng)，此過程通過Kaiser Test進行監(jiān)測，若縮合反應(yīng)不完全，重復(fù)縮合一次。反應(yīng)完成后得到的序列即為目標(biāo)多肽的全部序列。使用切割試劑(三氟乙酸1，2_乙二硫醇苯甲硫醚苯酚水三異丙基硅烷= 68.5 10 10 5 3.5 1，ν/ν)將目標(biāo)多肽從樹脂上裂解下來并除去側(cè)鏈保護基 (30°C下切割3小時)。濾液加入到10倍量冷的無水乙醚中使多肽沉淀析出，離心去除乙醚。用乙醚洗滌多肽粗品三次，分別離心后干燥。采用HPllOO型(美國安捷倫公司)反相高效液相色譜儀對粗品進行純化。多肽濃度為5mg/ml，色譜柱型號=Daiso C18 (10 μ m，100 A, 50 X 250mm)。色譜操作條件流動相 A為含0. 05體積％三氟乙酸，2體積％乙腈的水溶液，流動相B為90體積％乙腈水溶液，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測波長220nm。收集對應(yīng)的組分，凍干溶劑后即得蓬松狀態(tài)的多肽純品。其化學(xué)結(jié)構(gòu)由基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)進行表征，而其純度則由分析型高效液相色譜儀(Kromasi 1C18-10X250mm，流速每分鐘1毫升，檢測波長220納米)給出。本發(fā)明也提供了用本發(fā)明提供的方法得到的多肽制品。從這些結(jié)果可以看到，用這種方法合成序列中含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物[Asp-Arg(X)]單元的多肽時，避免了天冬酰亞胺副反應(yīng)導(dǎo)致的雜質(zhì)的產(chǎn)生，經(jīng)RP-HPLC純化后均得到高純度的目標(biāo)多肽分子， 無論從收率還是純品純度上來說，此方法都是傳統(tǒng)多肽合成法不可比擬的。這些例子都是為了說明本專利，而在任何方面都不能理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例1多肽3 的序列為 Biotin-Gly-Asp-[Arg (Me) J-Gly-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-L ys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-Arg-Arg-Glu-Arg-Pro-Tyr-OHo 由于 Asp-[Arg (Me)2]單元的存在，使得Asp殘基上極其容易發(fā)生形成天冬酰胺的副反應(yīng)，導(dǎo)致采用傳統(tǒng)方法不能制備目標(biāo)多肽分子。在CTC樹脂上采用固相合成序列Biotin-Gly-Asp，1 體積％三氟乙酸/ 二氯乙烷中切割1小時，濾液加入到10倍量石油醚/無水乙醚(1 1， ν/ν)中使多肽沉淀析出，離心后干燥，即得到Biotin-Gly-Asp (OtBu)-OH的粗品。將此片段與 H- [Arg (Me) 2]-G1y-G1y-Phe-G1y-Pro-G1y-Lys(Boc)-Met-Asp (OtBu)-Ser(tBu)-Arg (Pb f)-Gly-Glu(OtBu)-His (Trt)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Asp (OtBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(0 tBu) -Arg (Pbf) -Pro-Tyr (tBu)-王樹脂進行片段縮合，得到整條目標(biāo)多肽的序列。切割后得到粗肽產(chǎn)物，經(jīng)RP-HPLC純化即得目標(biāo)多肽純品。實施例2
多肽 4 的序列為 Biotin-Gly-Asp-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp- [Arg (Me) 2] -ArgGlu-Arg-Pro-Tyr-OH0 由于 Asp- [Arg (Me) 2]單元的存在，使得Asp殘基上極其容易發(fā)生形成天冬酰胺的副反應(yīng)，采用傳統(tǒng)方法不能制備目標(biāo)多肽分子。在CTC樹脂上采用固相合成序列Biotin-Gly-Asp-Arg-Gly -Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-OH, 1 體積 ％三氟乙酸/ 二氯乙烷中切割1小時，濾液加入到10倍量石油醚/無水乙醚(1 l,v/v)中使多肽沉淀析出，離心后干燥，即得到 Biotin-Gly-Asp (OtBu) -Arg (Pbf) -Gly-Gly-Phe-Gly-P ro-Gly-Lys(Boc)-Met-Asp (OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Glu(OtBu)-His (Trt)-Arg (Pb f) -Gln (Trt) -Asp (OtBu) -OH 的粗品。將此片段與 H- [Arg (Me) 2] -Arg (Pbf) -Glu (OtBu) -Arg (Pbf) -Pro-Tyr (tBu)-王樹脂進行片段縮合，完成整條目標(biāo)多肽的序列合成。切割后得到粗肽產(chǎn)物，經(jīng)RP-HPLC純化即得目標(biāo)多肽純品。
權(quán)利要求
1.一種制備含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物[Asp-Arg(X)]單元的多肽的方法，其特征在于，該方法依次包括下列步驟a)將多肽序列在Asp-Arg(X)處分為兩段，一段以Asp作為羧基端，標(biāo)記為片段A ；另一段以Arg(X)作為氨基端，標(biāo)記為片段B;片段A在對酸高度敏感的2-氯三苯基氯(CTC)樹脂上采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法進行合成，弱酸性條件1體積％三氟乙酸/ 二氯甲烷下切割制備得到全保護的片段，在這種切割條件下，連接在氨基端氨基上的基團以及側(cè)鏈基團的保護基均不受影響；b)采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法合成片段B，采用25體積％六氫吡啶/二甲基甲酰胺溶液處理去除Arg(X)的α -氨基的Fmoc保護基；c)將片段A的羧基進行活化，與片段B的氨基端氨基進行縮合，從而完成整個序列的合成；d)使用三氟乙酸切割條件將肽鏈從樹脂上切割下來，在此酸性條件下氨基酸側(cè)鏈保護基也均被去除，利用反相高效液相色譜儀純化粗肽，制備得到目標(biāo)多肽的純品。
2.如權(quán)利1所述的方法，其特征在于，將多肽序列在Asp-Arg(X)處分為兩段分別進行合成。
3.如權(quán)利1所述方法，其特征在于，片段A在對酸高度敏感的CTC樹脂上進行合成以制備全保護的片段。
4.如權(quán)利1所述方法，其特征在于，多肽序列中的精氨酸及衍生物Arg(X)包括但不僅限于精氨酸Arg，單甲基化精氨酸Arg (Me)，雙甲基化精氨酸Arg (Me) 2和三甲基化精氨酸 Arg(Me)3O
5.如權(quán)利1所述方法，其特征在于，合成過程中的Asp的側(cè)鏈羧基保護基包括但不僅限于叔丁氧基(OtBu)，烯丙氧基(OAll)，芐氧基(OBzl)，甲氧基(OMe)。
6.如權(quán)利1所述方法，其特征在于，包含天冬氨酸-精氨酸及衍生物單元，但不僅限于一個天冬氨酸-精氨酸及衍生物單元。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于一種制備含有天冬氨酸-精氨酸衍生物[Asp-Arg(X)]單元的多肽的新策略，尤其適用于由于精氨酸或精氨酸衍生物在合成過程中會促進天冬酰亞胺副反應(yīng)的多肽序列，和用這種方法得到的產(chǎn)物。此方法包括一種利用片段縮合法優(yōu)化多肽合成條件的策略，在這種策略中，多肽序列在Asp-Arg(X)處被分為兩段且分別合成，其中包含Asp殘基的一段在對酸高度敏感的2-氯三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂)上進行合成，制備得到的全保護片段(氮端以及側(cè)鏈均被保護)偶聯(lián)到另一片段的Arg(X)的氨基上從而完成整個序列的合成。切割得到的粗肽通過常規(guī)的高效液相色譜法進行純化，最終得到目標(biāo)多肽的純品。此方法有效壓制了Arg(X)的堿性胍基側(cè)鏈對天冬酰亞胺副反應(yīng)的促進效應(yīng)，極大提高了此類多肽的合成成功率以及最終產(chǎn)物的純度。
文檔編號C07K1/04GK102304167SQ20111020321
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者張文濤, 張新軍 申請人:北京中科亞光生物科技有限公司