專利名稱：一種從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從連翹葉中提取分離連翹苷和連翹酯苷的方法。
背景技術(shù)：
連翹為木犀科連翹屬落葉灌木，是中藥中最常見的藥材之一，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，連翹具有抗菌、抗病毒、解熱抗炎、抗氧化、保肝等多種藥理作用。我國連翹資源豐富，南北部均有分布，以河南、山西、陜西產(chǎn)量最大。連翹的化學(xué)成分主要有三大類木脂素類(如連翹苷、連翹酯苷等)、三萜酸類(如齊墩果酸、熊果酸等)和揮發(fā)油類。據(jù)研究，連翹屬植物葉子與果實(shí)的成分有較好的一致性，并且葉子中的有效成分如連翹苷、連翹酯苷的含量均比果實(shí)中的含量高。果實(shí)中連翹苷的含量在0.7%左右，連翹酯苷含量在洲左右，而葉中連翹苷和連翹酯苷的含量均在4%左右。傳統(tǒng)中醫(yī)藥以連翹果實(shí)入藥，大量的連翹葉被廢棄不用，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。連翹苷溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，溶于熱水但難溶于水，是連翹的主要成分之一，也是國家藥典所規(guī)定的連翹質(zhì)量控制指標(biāo)成分，具有抗菌、降血脂及減肥功能。連翹酯苷為咖啡酸衍生物，分子結(jié)構(gòu)中具有酯鍵和糖苷鍵，在弱酸條件下穩(wěn)定，遇堿、強(qiáng)酸和高溫條件均易分解，是連翹抗病毒的主要有效成分，除此之外其對金黃色葡萄球菌等十一種致病菌有極強(qiáng)的抑制作用，兼具抑制磷酸二酯酶、抑制真菌及抗氧化作用，兩者在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域作為天然藥物、天然防腐劑及天然抗氧化劑均具有廣泛的應(yīng)用前景。目前提取連翹酯苷和連翹苷均是采用從連翹果實(shí)或葉中提煉的，如中國專利 01122779. 6,200610148179. 0,200810054428. 9采用水提或乙醇提取、大孔樹脂分離得到 20% - 40%的連翹酯苷。中國專利201010535334. 0采用(X)2超臨界萃取、多級逆流萃取、大孔吸附樹脂純化得連翹酯苷。中國專利2010102357 . 9公開了一種從連翹葉中提取連翹苷的方法，其通過堿水提取、樹脂吸附、氧化鋁柱純化和重結(jié)晶等制備連翹苷，方法中使用堿水提取，在獲得連翹苷的同時(shí)破壞了其中的連翹酯苷?，F(xiàn)有方法存在的不足(1)現(xiàn)有方法中的水提取多是采用將連翹葉與水混合浸泡后再加熱提取，而這種傳統(tǒng)的采用浸泡加熱的提取方法會(huì)導(dǎo)致連翹葉中某些有效成分如連翹苷等的水解破壞；(2)連翹葉的現(xiàn)有提取方法僅針對連翹酯苷或連翹苷，不能同時(shí)得到連翹苷和連翹酯苷兩種有效成分，而且操作復(fù)雜、成本較高。目前尚未見到有從連翹葉中同時(shí)提取分離連翹苷和連翹酯苷的相關(guān)報(bào)道。針對所存在的問題，我們提出了一種工藝方法簡單、原料利用率高的從連翹葉中同時(shí)提取分離連翹苷和連翹酯苷的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種從連翹葉中提取分離連翹苷和連翹酯苷的方法，該方法能有效提高連翹葉中有效成分的利用率，操作工藝簡單，所得產(chǎn)品純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，該方法包括如下步驟
①提取在40- 90°C的水中直接加入連翹葉進(jìn)行提取，每次提取時(shí)間0. 5 -池，提取 2 - 4次，連翹葉和水的重量比為1 :6 — 20 (此處的提取除可用前述的常規(guī)熱提取外，還可以使用超聲提取)；
②分離合并所得提取液，固液分離棄去殘?jiān)?，濾液減壓濃縮后室溫靜置，分離沉淀和水層，沉淀為連翹苷粗提物(其中連翹苷含量為50%以上)，水層為連翹酯苷粗提液(其中連翹酯苷含量為10%以上)。較好的，步驟①中水溫以60 - 85°C為宜?，F(xiàn)有的常規(guī)操作是把原料加入水中或浸泡一段時(shí)間，然后慢慢升溫加熱提取，這樣使得連翹葉的有效成分在浸泡過程中易于水解， 提取率偏低。本發(fā)明采用將連翹葉直接加入熱水中提取，這樣能夠有效降低原料連翹葉中的某些水解酶等因素對有效成分的破壞，從而大大提高了提取液中有效成分的含量。為取得好的提取效果，可以將連翹葉按比例加入熱水中進(jìn)行提取，提取結(jié)束后過濾分離；所得濾渣再次加水提取，提取結(jié)束后過濾分離；如此重復(fù)，合并每次所得提取液進(jìn)行下一工序。較好的，步驟②中減壓濃縮的程度取決于能使連翹苷和連翹酯苷獲得最大程度的分離，濃縮前后濾液的體積比以7—15 1為宜，此時(shí)大量的連翹酯苷保留在濃縮液中，而大部分連翹苷從濃縮液中沉淀出來，分離連翹苷粗提物，其中連翹苷含量可達(dá)50%左右，更利于下一步的精制純化。步驟②中的室溫靜置時(shí)間以10 - 48h為佳，此靜置過程利于連翹苷和連翹酯苷能被充分分離開來。步驟②中的分離可以采用常壓過濾分離、減壓過濾分離或離心分離等。進(jìn)一步的，所得連翹苷粗提物按如下方法將連翹苷粗提物烘干，然后把烘干的連翹苷粗提物與乙酸乙酯按重量比1 :2 — 8混合后回流提取2 - 4次，合并提取液，減壓濃縮至干，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶1 一 4次即得白色針狀連翹苷晶體，HPLC檢測純度高達(dá)99%。其中， 所述回流提取時(shí)間為20 - 60min (回流溫度一般在40 — 80°C )，使用的乙醇優(yōu)選無水乙醇或體積濃度90% - 99%的乙醇。所得連翹酯苷粗提液按如下方法精制將連翹酯苷粗提液用水飽和的正丁醇溶液萃取，棄去水層，合并有機(jī)層，有機(jī)層經(jīng)減壓濃縮干燥后得純度大于40%的連翹酯苷粗品。 其中在下述條件操作時(shí)效果較好萃取時(shí)水飽和的正丁醇溶液添加量為連翹酯苷粗提液體積的0. 4 — 1. 2倍；萃取次數(shù)為1 一 3次，合并每次萃取所得有機(jī)層，該有機(jī)層先減壓濃縮至相對密度為1. 3 — 1. 5，然后干燥得連翹酯苷粗品。所得連翹酯苷粗品可以用正相硅膠層析、反相硅膠層析或重結(jié)晶方法進(jìn)一步純化，得到連翹酯苷成品，純度可達(dá)90%以上。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)將連翹葉直接放入熱水中進(jìn)行提取，避免有效成分的破壞 連翹葉中的連翹苷易水解，傳統(tǒng)中藥提取采用的先浸泡、后加熱提取方法易于促進(jìn)連翹苷的水解，為此本發(fā)明方法廢棄浸泡、加熱等工序，將連翹葉直接加入到熱水中進(jìn)行提取，有效地降低了原料中水解酶等因素對連翹苷等有效成分的破壞，大大提高了提取液中有效成分的含量。(2)工藝簡單、生產(chǎn)成本低①本發(fā)明利用連翹苷、連翹酯苷在熱水中溶解度的差異，采用簡單的濃縮、靜置、沉淀的方法即可實(shí)現(xiàn)連翹苷和連翹酯苷較大程度的分離，同時(shí)得到純度較高的連翹苷粗提物和連翹酯苷粗提液，其中連翹苷粗提物中連翹苷的純度可達(dá)50% ；
②連翹苷粗提物在后續(xù)的精制過程中無需使用大孔樹脂、氧化鋁、硅膠等柱層析方法， 僅需使用少量乙酸乙酯提取及乙醇重結(jié)晶即可得到純度高達(dá)99%的連翹苷產(chǎn)品，工藝簡單可行，產(chǎn)品品質(zhì)好，生產(chǎn)周期大大縮短；
③連翹酯苷粗提液采用水飽和正丁醇萃取的方法進(jìn)行精制，得到純度40%以上的連翹酯苷粗品，不用大孔樹脂等柱層析方法即可達(dá)到柱層析的效果，方法更簡單；而正丁醇還可回收利用，有機(jī)溶劑的用量大大減少，生產(chǎn)周期大大縮短。此外，本發(fā)明方法顯著降低連翹苷和連翹酯苷的生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。(3)充分利用天然植物資源傳統(tǒng)中醫(yī)藥以連翹果實(shí)入藥，而連翹葉中的有效成分連翹苷、連翹酯苷的含量均比果實(shí)中的含量高。大量的連翹葉被廢棄不用，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。現(xiàn)有技術(shù)中僅單一提取連翹苷或連翹酯苷一種，制備方法缺乏應(yīng)用的綜合利用。本發(fā)明方法從連翹葉一次同時(shí)提取分離精制連翹苷和連翹酯苷兩種產(chǎn)品，最大限度利用了資源，對植物資源保護(hù)具有重要意義。


圖1為連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相圖譜；
圖2為采用本發(fā)明方法制得的連翹苷晶體的高效液相圖譜； 圖3為采用本發(fā)明方法制得的連翹苷晶體的核磁共振圖譜； 圖4為連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相圖譜； 圖5為采用本發(fā)明方法制得的連翹酯苷產(chǎn)品的高效液相圖譜； 圖6為采用本發(fā)明方法制得的連翹酯苷產(chǎn)品的核磁共振圖譜。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例1
一種從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，該方法包括如下步驟
①提取把5kg連翹葉加入到80°C的水(水量50kg)中超聲提取lh，超聲功率20KHz， 提取2次；
②分離合并兩次所得提取液，過濾分離棄去殘?jiān)瑸V液減壓濃縮(濃縮前后濾液的體積比為8 :1)后室溫靜置15h，然后常壓過濾分離沉淀和水層，沉淀為連翹苷粗提物，水層為連翹酯苷粗提液；
③精制連翹苷將連翹苷粗提物烘干，然后把烘干的200g連翹苷粗提物與乙酸乙酯按重量比1 :6混合后55°C回流提取2次，每次40min，合并乙酸乙酯提取液，減壓濃縮至干，再經(jīng)體積濃度95%的乙醇重結(jié)晶2次即得白色針狀連翹苷晶體Mg，用高效液相HPLC檢測純度為99% ；
④精制連翹酯苷將連翹酯苷粗提液用水飽和的正丁醇溶液室溫萃取2次，水飽和的正丁醇溶液添加量為連翹酯苷粗液體積的0. 8倍，棄去水層，合并每次萃取所得正丁醇有機(jī)層，該有機(jī)層先減壓濃縮至相對密度為1. 3，經(jīng)干燥得純度41%的連翹酯苷粗品350g。所得連翹酯苷粗品用正相硅膠層析進(jìn)一步純化，得到純度為92%的淡黃色連翹酯苷成品89g。實(shí)施例2
一種從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，該方法包括如下步驟
①提取把IOkg連翹葉加入到55°C的水(水量160kg)中進(jìn)行提取，每次提取1.證，提取3次；
②分離合并三次所得提取液，常壓過濾分離棄去殘?jiān)?，濾液減壓濃縮(濃縮前后濾液的體積比為12 :1)后室溫靜置48h，然后3000r/min高速離心機(jī)離心分離沉淀和水層，沉淀為連翹苷粗提物，水層為連翹酯苷粗提液；
③精制連翹苷將連翹苷粗提物烘干，然后把烘干的380g連翹苷粗提物與乙酸乙酯按重量比1 :4混合后60°C回流提取2次，每次30min，合并乙酸乙酯提取液，減壓濃縮至干，再用無水乙醇重結(jié)晶一次得白色針狀連翹苷晶體50g，用高效液相HPLC檢測純度為99% ；
④精制連翹酯苷將連翹酯苷粗提液用水飽和的正丁醇溶液室溫萃取2次，水飽和的正丁醇溶液添加量為連翹酯苷粗液體積的0. 5倍，棄去水層，合并每次萃取所得正丁醇有機(jī)層，該有機(jī)層先減壓濃縮至相對密度為1.5，經(jīng)干燥得純度43%的連翹酯苷粗品。所得連翹酯苷粗品用反相硅膠層析進(jìn)一步純化，得到純度94%的淡黃色連翹酯苷成品190g。連翹苷的鑒定采用本發(fā)明方法提取分離得到的連翹苷為白色針狀晶體，分子式 C27H34O11,分子量534，分別通過高效液相色譜和核磁共振譜進(jìn)行鑒定。(1)高效液相色譜(HPLC)取少量連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品(購自中國生物制品檢定所，編號 0821-9602)和實(shí)施例1所得連翹苷晶體分別用甲醇溶解，進(jìn)行HPLC分析并比較。HPLC測定條件儀器型號=Waters 600型高效液相色譜儀，Waters2489型紫外檢測器，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站，色譜柱:Sunfire TMC18 (5. Oum，4. 6mmX 150mm)，流動(dòng)相乙腈水(25:75)， 流速lml/min，檢測波長277nm，溫度室溫。連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為9. 03& η，譜圖結(jié)果見圖1 ；制得的連翹苷晶體保留時(shí)間為9. 015min，譜圖結(jié)果見圖2，兩者基本一致。實(shí)施例2制得的連翹苷產(chǎn)品的高效液相色譜結(jié)果與實(shí)施例1相同。(2)核磁共振譜將實(shí)施例制得的連翹苷成品作碳(13C)核磁共振分析，譜圖結(jié)果見圖3。用Bruker DPX_400MHz核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)。"C-NMR的工作頻率為 100.577 MHz，DMS0為溶劑。使用5mm NMR探頭，NMR實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。13C-WR的譜寬為 25 000 Hz，數(shù)據(jù)點(diǎn)為 32 000，弛豫延遲為 2s。測定結(jié)果為δ 135. 4 (C-1)，110. 5 (C-2)，14 9. 1 (C-3), 146. 1 (C-4), 115. 3 (C-5)，118. 3 (C-6), 86. 9 (C-7), 49. 5 (C-8), 69. 8 (C-9), 131. 4 (C-I' ),109.5 (C-2' ), 148. 6 (C-3‘ ), 147. 8(C-4‘ ), 111. 6(C-5' ),117. 7(C_6' ),48. 8 (C-7' ),48. 8 (C-8' ), 69. 2 (C-9 ' ), 100. 2 (C-1" ), 73. 4 (C-2 " ),77. 1(C_3〃 ),70.5( C-4" ), 77. 2 (C-5" ), 60. 9(C-6" ),55. 8, 55.6,54.3 (OMe)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Ming DS, Yu DQ, Yu SS. A new compound from Forsythia suspense. JANPR, 1999，(3) :221-226. ) 艮道的連翹苷數(shù)據(jù)一致，可確定本品為連翹苷。連翹酯苷的鑒定采用本發(fā)明方法提取分離得到的連翹酯苷為淡黃色粉末，分子式=C29H36O15,分子量624，通過高效液相色譜和核磁共振譜進(jìn)行鑒定。(1)高效液相色譜(HPLC)取少量連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)品(購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司)和實(shí)施例1所得連翹酯苷成品分別用甲醇溶解，進(jìn)行HPLC分析并比較。HPLC測定條件儀器型號=Waters 600型高效液相色譜儀，Waters2489型紫外檢測器，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站，色譜柱Sunf ireTMC18 (5. Oum, 4. 6謹(jǐn)X 150mm)，流動(dòng)相乙腈水醋酸 (15:85:0. 2)，流速2ml/min，檢測波長332nm，溫度室溫。連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為 15. 52;3min，譜圖結(jié)果見圖4 ；制得的連翹酯苷產(chǎn)品主峰保留時(shí)間為15. 898min，譜圖結(jié)果見圖5，兩者基本一致。實(shí)施例2制得的連翹酯苷產(chǎn)品的高效液相色譜結(jié)果與實(shí)施例1相同。(2)核磁共振譜將實(shí)施例制得的連翹酯苷成品作碳(13C)核磁共振分析，譜圖結(jié)果見圖6。用Bruker DPX_400MHz核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)。"C-NMR的工作頻率為 100.577 MHz, OT3OD為溶劑。使用5mm NMR探頭，NMR實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。13C-WR的譜寬為25 000 Hz，數(shù)據(jù)點(diǎn)為32 000，弛豫延遲為k。測定結(jié)果為δ 131. 4 (C-I)，116. 4 (C-2 )，146. 1 (C-3), 144. 7(C-4)，117. 1 (C_5)，121. 3 (C_6)，36. 7 (C_7)，72. 4 (C_8)，127. 7 (C-I') ,115. 2 (C-2‘ )，146. 9 (C-3‘ ),149. 8 (C_4' ),116. 5 (C_5' ),123. 1(C_6' ),114. 8 (C_8 '),168. 3(C-9' )，104.5(C-1〃 ),75. 2(C-2" ),75.9(0-3" ),74.8(0-4" )，74.0(C_5〃 ),67.6( C-6〃)，102. 36(C-l〃 ' ),72.4(0-2" ' ), 72. 3(C-3" ' )，72.0(C_4〃 ' ),69.9(0-5"')， 18. 0(C-6"')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kitagawa S, Tsukamoto H, Hisada S et al. Studies on the Chinese drug "Forsythia Fructus”VII:a new caffeyol glycoside from Forsythia viridissima. Chem Pharm Bull, 1984，12(3) :1209-1213.)報(bào)道的連翹酯苷數(shù)據(jù)一致，可確定本品為連翹酯苷。最后應(yīng)說明的是以上實(shí)施例僅用以說明，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，包括如下步驟①提取在40- 90°C的水中直接加入連翹葉進(jìn)行提取，每次提取時(shí)間0. 5 -池，提取 2 - 4次，連翹葉和水的重量比為1 :6 — 20 ；②分離合并所得提取液，固液分離棄去殘?jiān)瑸V液減壓濃縮后室溫靜置，分離沉淀和水層，沉淀為連翹苷粗提物，水層為連翹酯苷粗提液。
2.根據(jù)權(quán)利1所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，步驟①中水溫為60 — 85°C。
3.根據(jù)權(quán)利1所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，步驟②中減壓濃縮前后濾液的體積比為7 - 15 :1，室溫靜置時(shí)間為10 - 48h。
4.根據(jù)權(quán)利1所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，步驟②中分離采用常壓過濾分離、減壓過濾分離或離心分離。
5.根據(jù)權(quán)利1所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，所得連翹苷粗提物按如下方法精制將連翹苷粗提物烘干，然后把烘干的連翹苷粗提物與乙酸乙酯按重量比1 :2 — 8混合后回流提取2 - 4次，合并提取液，減壓濃縮至干，再經(jīng)乙醇重結(jié)晶 1- 4次即得白色針狀連翹苷晶體。
6.根據(jù)權(quán)利1所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，所得連翹酯苷粗提液按如下方法精制將連翹酯苷粗提液用水飽和的正丁醇溶液萃取，棄去水層，有機(jī)層經(jīng)減壓濃縮、干燥后得連翹酯苷粗品。
7.根據(jù)權(quán)利5所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，所述回流提取時(shí)間為20 - 60min，所用乙醇為無水乙醇或體積濃度90% — 99%乙醇。
8.根據(jù)權(quán)利6所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，在萃取時(shí)水飽和的正丁醇溶液添加量為連翹酯苷粗提液體積的0. 4 — 1. 2倍；萃取次數(shù)為1 一 3次， 合并每次萃取所得有機(jī)層，該有機(jī)層先減壓濃縮至相對密度為1. 3 — 1. 5，然后干燥得連翹酯苷粗品。
9.根據(jù)權(quán)利6或8所述從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，其特征在于，將得到的連翹酯苷粗品用正相硅膠層析、反相硅膠層析或重結(jié)晶方法純化得連翹酯苷成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及從連翹葉中提取連翹苷和連翹酯苷的方法，該方法以連翹葉為原料，先通過熱水提取、濃縮、分離獲得連翹苷粗提物和連翹酯苷粗提液；然后連翹苷粗提物經(jīng)乙酸乙酯提取、乙醇重結(jié)晶得到純度高達(dá)99%的連翹苷產(chǎn)品；而連翹酯苷粗提液經(jīng)水飽和的正丁醇溶液萃取、濃縮、干燥后得到純度大于40%的連翹酯苷粗品，經(jīng)進(jìn)一步純化純度可大于90%。本發(fā)明方法工藝簡單，原料利用率高，所得產(chǎn)品純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07H1/08GK102219813SQ20111020973
公開日2011年10月19日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者于立芹, 張培林, 張海燕, 李倩, 李曉, 范毅, 董建軍, 趙天增, 郭唯, 陳玲, 魏悅 申請人:河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司