專利名稱：一種山萵苣素和山萵苣苦素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用高速逆流色譜法從毛菊苣中分離山萵苣素和山萵苣苦素的制備方法。
背景技術(shù)：
毛菊苣為菊科菊苣屬一年生草本植物，系維吾爾族習(xí)用藥材，以地上部分入藥，具有清熱解毒，利尿消腫，健胃消食的功效，用于肝炎食少，腎炎水腫，胃脘疼痛等，近來發(fā)現(xiàn)毛菊苣根提取物具有保肝，降血糖，降血脂等作用，種子提取物具有抗肝毒性作用。近幾十年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)菊苣屬植物化學(xué)研究的不斷深入，國內(nèi)外學(xué)者的研究主要都集中在菊苣(Cichoriumi intybus L.)上，化學(xué)研究表明其主要成分包括各種萜類成分，黃酮類成分及苯丙素類(主要為香豆素)等，而對(duì)毛菊苣(Cichorium glandulosum Boiss. et Huet.)的研究較少，作為同屬植物，毛菊苣與其它菊科植物具有相似的化學(xué)成分，通過對(duì)菊苣葉、種子、根莖的研究與分析，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)毛菊苣中除含有具有多種生物活性的倍半萜內(nèi)酯類成分之外還有香豆素類、黃酮類、有機(jī)酸、生物堿、三萜、糖類等。毛菊苣中倍半萜類成分豐富多樣，這些化合物味苦，是菊苣苦味的來源，菊苣全草中含山萵苣苦素， 山萵苣素，11 β-13二氫山萵苣素，lactupicrin methyl ester等，是該植物的代表性成分， 也是保肝降糖等主要活性成分之一。高速逆流色譜是近年發(fā)展起來的一種連續(xù)無任何固體支持物的高效、快速液、液分配色譜技術(shù)，它避免了固體支持物或載體帶來的各種問題如樣品被吸附、損耗和變性， 使用其他液相色譜進(jìn)行制備分離時(shí)，其分配效率會(huì)明顯降低，容積消耗量大，HSCCC分離時(shí)， 分離量大，樣品無損失、回收率高分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。逆流色譜儀能直接進(jìn)大量粗體樣品，分離結(jié)果達(dá)到較高的純度，甚至能直接接質(zhì)譜等儀器，已廣泛用于極性物質(zhì)如生物堿、黃酮苷等的制備和純化。已見報(bào)道用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5 4 2.5 6) 和乙酸乙酯-甲醇-水OO 2 20)體系從毛菊苣根分離了山萵苣素和山萵苣苦素等倍半萜成分，但用這些溶劑系統(tǒng)時(shí)仍存在一些問題，首先固定相保留的不好，而且重復(fù)性差， 其次毛菊苣根提取物的乙酸乙酯部位在這些溶劑系統(tǒng)里的溶解性不好，導(dǎo)致上樣量較少， 對(duì)儀器的損害性比較大，所以要找出提高溶解性或幫助溶解性的溶劑系統(tǒng)或溶劑是很重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供一種山萵苣素和山萵苣苦素的制備方法，該方法采用高速逆流色譜法從毛菊苣中得到山萵苣素和山萵苣苦素，該方法分離量大，樣品無損失、回收率高，分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。采用逆流色譜儀能直接連續(xù)、大量進(jìn)樣，分離結(jié)果達(dá)到較高的純度。該方法適用于山萵苣素和山萵苣苦素粗品的純化。本發(fā)明所述的山萵苣素和山萵苣苦素的制備方法，采用高速逆流色譜的方法從毛菊苣中得到山萵苣素和山萵苣苦素，具體操作按下列步驟進(jìn)行
a、將毛菊苣根粉碎后，用濃度為70% -100%甲醇或乙醇進(jìn)行超聲、浸泡、回流提取，提取物減壓濃縮后獲得總浸膏；b、將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，并減壓蒸餾分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；C、將步驟b乙酸乙酯部位浸膏用乙酸乙酯溶解后，200-300目硅膠柱層析分離，用正己烷-乙酸乙酯溶劑剃度洗脫體積比4 1-1 3，每份收集15-20ml，將流份用薄層色譜法(TLC)進(jìn)行跟蹤檢查，以石油醚乙酸乙酯1 5為展開劑，合并相同成分，減壓濃縮，
得到山窩苣素和山窩苣苦素粗品；d、配制五種組分的混合溶劑，將石油醚、正己烷、正庚烷或正戊烷和乙酸乙酯和甲醇或乙醇和水，分別按各組分體積比為0-2 1-20 1-2 3-20將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積15% -25%四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；e、再配制五種組分的混合溶劑，將石油醚、正戊烷、正己烷或正庚烷和乙酸乙酯和甲醇或乙醇和水，按各組分體積比為0.5-2 2-4 2-3 3-5將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積5%-15%的四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；f、將步驟b中的乙酸乙酯部位溶于步驟d所得的溶劑系統(tǒng)中，采用高速逆流色譜的方法進(jìn)行分離，以上相為固定相，下相位流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至700-900轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. 0-2. Oml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，經(jīng)HPLC與標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照確定為山萵苣苦素，將剩余部分濃縮后溶于溶解于步驟e中再次進(jìn)行高速逆流色譜分離，可獲得山萵苣素；或步驟c中獲得的山萵苣素和山萵苣苦素粗品，分別溶于步驟d和步驟e溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行分離，采用高速逆流色譜法，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至700-900轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. 0-2. Oml/ min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長邪4歷，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，可獲得純度在97-98 %的山萵苣素和山萵苣苦素。步驟a超聲萃取溫度20-40 V，常溫浸提溫度20_30 V，加熱提取溫度60_90 V，液比 1 5-30。本發(fā)明所述方法中將得到的乙酸乙酯部位直接溶于溶劑系統(tǒng)，再利用高速逆流色譜進(jìn)行分離，該方法不僅可以用于粗品的純化，同時(shí)也可用于從提取物中直接分離山萵苣
素和山萵苣苦素。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的方法不僅限于以下給出的實(shí)施例實(shí)施例1:取毛菊苣根500g粉碎后，用濃度為70%乙醇采用超聲萃取進(jìn)行提取，液比 1 5，萃取溫度20°C，提取液減壓濃縮至無醇味，得到總浸膏；將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，并減壓蒸餾分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏；取乙酸乙酯部位浸膏1. 5g，用乙酸乙酯溶解后，200目硅膠柱層析分離，按體積比 4-1 1-3用正己烷-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)剃度洗脫，每份收集15-20ml，將流份用薄層色譜法(TLC)進(jìn)行跟蹤檢查，以石油醚乙酸乙酯1 5為展開劑，合并相同成分，減壓濃縮，得到山窩苣素和山窩苣苦素粗品；配制溶劑，將乙酸乙酯、甲醇和水，按各組分體積比為5 1 5將各組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積的15%四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；配制五種組分溶劑，將石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水，按各組分體積比為 1:3:2: 3將各組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積5%的四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；將步驟c中獲得的山萵苣素和山萵苣苦素粗品，分別溶于步驟d和步驟e溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行分離，采用高速逆流色譜法，以上相為固定相，下相位流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至700轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. Oml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，可獲得純度在97-98 %的山萵苣素和山萵苣苦素。實(shí)施例2 取毛菊苣根500g粉碎后，用濃度為90%乙醇采用超聲輔助提取法，液比1 10， 萃取溫度30°C，提取液減壓濃縮至無醇味，得到總浸膏；將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，并減壓蒸餾分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏；取乙酸乙酯部位浸膏1. 5g，用乙酸乙酯溶解后，300目硅膠柱層析分離，按體積比 4-1 1-3用正己烷-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)剃度洗脫，每份收集18ml，將流份用薄層色譜法 (TLC)進(jìn)行跟蹤檢查，以石油醚乙酸乙酯1 5為展開劑，合并相同成分，減壓濃縮，得到
山窩苣素和山窩苣苦素粗品；配制五組分溶劑，將正庚烷、乙酸乙酯、甲醇和水，其各組分體積比為 0.8 2.5 2 6進(jìn)行配制，將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積的 20%四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；再配制五種組分的溶劑，將正庚烷、乙酸乙酯、甲醇和水，按各組分體積比為 1 3 2.5 3將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積10%的四氫呋喃， 搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；稱取步驟c中獲得的山萵苣素和山萵苣苦素粗品，分別溶于步驟d和步驟e溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行分離，采用高速逆流色譜法，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至75轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. 5ml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，可獲得純度在98 %的山萵苣素和山萵苣苦素。實(shí)施例3:取毛菊苣根500g粉碎后，用無水甲醇采用熱回流提取的方式進(jìn)行提取，液比 1 15，溫度60°C，提取液減壓濃縮至無醇味，得到總浸膏；
將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，并減壓蒸餾分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏；取乙酸乙酯部位浸膏約1. 5g，用乙酸乙酯溶解后，200目硅膠柱層析分離，按體積比4-1 1-3用正己烷-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)剃度洗脫，每份收集20ml，將流份用薄層色譜法 (TLC)進(jìn)行跟蹤檢查，以石油醚乙酸乙酯1 5為展開劑，合并相同成分，減壓濃縮，得到
山窩苣素和山窩苣苦素粗品；配制五種組分的溶劑，將正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水，按各組分體積比為 2 10 2 10將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積的25%四氫呋喃， 搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；再配制五種組分的溶劑，將正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水，按各組分體積比為 1.5-2 4 2.75 5將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積15%的四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；稱取步驟c中獲得的山萵苣素和山萵苣苦素粗品，分別溶于步驟d和步驟e溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行分離，采用高速逆流色譜法，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至800轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為2. Oml/min,待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，可獲得純度在97 %的山萵苣素和山萵苣苦素。實(shí)施例4 取毛菊苣根500g，然后用無水甲醇采用常溫浸泡方式進(jìn)行提取，液比1 30提取液減壓濃縮至無醇味，得到總浸膏；將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，并減壓整理分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，再取乙酸乙酯部位為原料備用；配制五種組分形成的溶劑，將正庚烷、乙酸乙酯、甲醇和水，按各組分體積比為 1.5 5 2.75 5將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積的15%四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；再配制五種組分形成的溶劑，將正庚烷、乙酸乙酯、甲醇和水，按各組分體積比為 2:4:3: 5將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積10%的四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；稱取步驟b中乙酸乙酯部位，先溶于步驟d所得的溶劑系統(tǒng)中，采用高速逆流色譜的方法進(jìn)行分離，以上相為固定相，下相位流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至700轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. Oml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，經(jīng)HPLC與標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照確定為山萵苣苦素，將剩余樣品濃縮后溶于步驟e 中再次進(jìn)行高速逆流色譜分離，可獲得山萵苣素。實(shí)施例5 取毛菊苣根500g粉碎后，用濃度為70%乙醇采用熱回流提取的方式進(jìn)行提取，液比1 15，溫度85°C，提取液減壓濃縮至無醇味，得到總浸膏；將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，并減壓蒸餾分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏；
配制五種組分形成的溶劑，將正戊烷、乙酸乙酯、乙醇和水，按各組分體積比為 1.5 20 1.5 15將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積的25%四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；再配制五種組分形成的溶劑，將或正戊烷、乙酸乙酯、乙醇和水，按各組分體積比為2 3 3 5將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積15%的四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；稱取步驟b中乙酸乙酯部位，先溶于步驟d所得的溶劑系統(tǒng)中，采用高速逆流色譜的方法進(jìn)行分離，以上相為固定相，下相位流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至800轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. 5ml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，經(jīng)HPLC與標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照確定為山萵苣苦素，將剩余樣品濃縮后溶于步驟e 中再次進(jìn)行高速逆流色譜分離，可獲得山萵苣素。實(shí)施例6 取毛菊苣根500g粉碎后，用無水乙醇采用熱回流提取的方式進(jìn)行提取，液比 1 25，溫度60°C，提取液減壓濃縮至無醇味，得到總浸膏；將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，并減壓蒸餾分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏；配制混合溶劑，將乙酸乙酯和甲醇和水，按各組分體積比為10 1 15將配好的溶液放在分液漏斗，然后加入總體積的20 %四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；再配制五種組分的溶劑，將石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水，按各組分體積比為 2:4:3: 5將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積10%的四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；稱取步驟b中乙酸乙酯部位，先溶于步驟d所得的溶劑系統(tǒng)中，采用高速逆流色譜的方法進(jìn)行分離，以上相為固定相，下相位流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至900轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為2. Oml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，經(jīng)HPLC與標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照確定為山萵苣苦素，將剩余樣品濃縮后溶于步驟e 中再次進(jìn)行高速逆流色譜分離，可獲得山萵苣素。
權(quán)利要求
1.一種山萵苣素和山萵苣苦素的制備方法，其特征在于采用高速逆流色譜法從毛菊苣根的粗提物或山萵苣素或山萵苣苦素粗品中得到山萵苣素和山萵苣苦素，具體操作按下列步驟進(jìn)行a、將毛菊苣根粉碎后，用濃度為70%-100%甲醇或乙醇進(jìn)行超聲波輔助提取或浸泡或熱回流提取，提取物減壓濃縮后獲得總浸膏；b、將總浸膏分散于水中，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，經(jīng)減壓蒸餾后分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏；C、將步驟b乙酸乙酯部位浸膏用乙酸乙酯溶解后，200-300目硅膠柱層析分離，用正己烷-乙酸乙酯溶劑剃度洗脫體積比4-1 1-3，每份收集15-20ml，將流份用薄層色譜法進(jìn)行跟蹤檢查，以石油醚乙酸乙酯1 5為展開劑，合并相同成分，減壓濃縮，得到山窩苣素和山窩苣苦素粗品；d、配制五種組分的混合溶劑，將石油醚、正己烷、正庚烷或正戊烷和乙酸乙酯和甲醇或乙醇和水，分別按各組分體積比為0-2 1-20 1-2 3-20將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積15% -25%四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；e、再配制五種組分的混合溶劑，將石油醚、正己烷、正庚烷或正戊烷和乙酸乙酯和甲醇或乙醇和水，按各組分體積比為0.5-2 2-4 2-3 3-5將四組分溶液分別放在分液漏斗，然后分別加入總體積5% -15%的四氫呋喃，搖勻后靜置分層，待平衡后，分離上相和下相；f、將步驟b中的乙酸乙酯部位溶于步驟d所得的溶劑系統(tǒng)中，采用高速逆流色譜的方法進(jìn)行分離，以上相為固定相，下相位流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱，待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至700-900轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. 0-2. Oml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，經(jīng)HPLC與標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照確定為山萵苣苦素，將剩余部分濃縮后溶于溶解于步驟e中再次進(jìn)行高速逆流色譜分離，可獲得山萵苣素；或步驟c中獲得的山萵苣素和山萵苣苦素粗品，分別溶于步驟d和步驟e溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行分離，采用高速逆流色譜法，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，先將固定相泵入分離柱， 待分離柱充滿后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至700-900轉(zhuǎn)/分，同時(shí)泵入流動(dòng)相，流速為1. 0-2. Oml/min，待平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品，打開自外檢測器及記錄儀，檢測波長254nm，按色譜圖收集所有餾分，真空干燥后，可獲得純度> 97 %的山萵苣素和山萵苣苦素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a超聲萃取溫度20-40°C，常溫浸提溫度20-30 V，加熱提取溫度60-90 °C，液比1 5-30。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種山萵苣素和山萵苣苦素的制備方法，該方法采用高速逆流色譜法通過兩個(gè)分離步驟從毛菊苣中得到山萵苣素和山萵苣苦素，該方法分離量大，樣品損失小、回收率高，分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。采用逆流色譜儀能直接進(jìn)大量山萵苣素和山萵苣苦素粗品，分離結(jié)果達(dá)到較高的純度，取得良好的分離效果。該方法不僅適用于從植物粗提取物中制備純度較高的產(chǎn)品，同時(shí)也適用于對(duì)各種途徑獲得的山萵苣素和山萵苣苦素粗提物提純。
文檔編號(hào)C07D307/93GK102351824SQ20111021347
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者信學(xué)雷, 巴杭, 張堯, 楊義, 阿吉艾克拜爾·艾薩 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所