專利名稱:綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法及在魚糜制品生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法及在魚糜制品生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung Bean Trypsin Inhibitor, MBT I) 是從綠豆 iPhaseolus radiatus L.)成熟種子中分離的屬于Bowman-Birk型絲氨酸蛋白酶抑制劑。我國學(xué)者戚正武等人深入而系統(tǒng)地研究了 MBTI的物理化學(xué)及生物化學(xué)性質(zhì),測定了它的一級結(jié)構(gòu)。MBTI共含72個氨基酸殘基,分子量為8,883徹,含7對二硫鍵,對熱、 酸、堿、酶消化的穩(wěn)定性很高。它具有兩個抑制活力相同的結(jié)構(gòu)域,兩個抑制活性位點(diǎn) (Lys20-Ser21, Arg47-Ser48)都對胰蛋白酶起作用。前者由一條含沈殘基的長鏈與含9 個殘基的短鏈通過兩對二硫鍵連接而成。而后者由含27個殘基的單鏈組成。MBTI與酶作用的機(jī)制遵循其它蛋白質(zhì)型絲氨酸蛋白酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)抑制機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn),MBTI 還具有抗腫瘤等醫(yī)學(xué)作用。目前,綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化主要采用硫酸抽提、硫酸銨分級沉淀、膜超濾、離子交換柱層析、親和色譜或高效液相色譜等方法,分離純化過程繁瑣,操作復(fù)雜,耗時長,得率低,成本高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單,分離效果好的綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法以及其對魚糜制品彈性增強(qiáng)的改善作用。本發(fā)明的工藝流程設(shè)計(jì)原理是在低濃度硫酸的作用下,綠豆中部分雜蛋白被酸破壞而降解成小分子物質(zhì),加熱處理進(jìn)一步去除了雜蛋白。對酸、對熱穩(wěn)定的綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)則基本不受影響而在離心后的上清液中。膜處理可有效去除大分子(>30 kDa)蛋白和小分子(<5 kDa)的鹽和小肽成分。離子交換層析中,MBTI對陰離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷基團(tuán)的靜電吸引,而這種吸引力與溶液的PH值及鹽濃度有關(guān)。溶液中鹽濃度的變化直接影響陰離子交換劑對蛋白質(zhì)的吸附能力。故本發(fā)明采用鹽濃度線性梯度洗脫方式對MBTI進(jìn)行純化。此外,在魚糜制品生產(chǎn)過程中,肌肉中的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶 (myofibril-bound serine proteinase, MBSP)是導(dǎo)致魚糜制品彈性下降的主要因素。將以上方法制備的高純度MBTI或部分純化的MBTI添加到以海水魚或淡水魚為主要原料的魚糜制品中,使其終濃度達(dá)到10-50 mg/kg或以上,攪拌均勻,可使最終制品的凝膠強(qiáng)度增加 10-20%,達(dá)到改善魚糜制品品質(zhì)的效果。為了達(dá)成上述目的,本發(fā)明的解決方案是
一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分離純化方法,包括如下步驟
1)提取將干燥的綠豆用粉碎機(jī)粉碎成粉末;以1:4-6 m/v比例溶于硫酸中,攪拌浸泡后,離心取其上清液為MBTI粗提液;
2)中和向步驟1)所得的MBTI粗提液中加堿至溶液的pH呈中性;
3)熱處理將步驟2)所得的MBTI粗提液在水浴中加熱,加熱后立即冷卻,離心收集上
清液;
4)膜處理將步驟3)所得的上清液用30kDa分子量截留的超濾膜超濾后取外液;進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜超濾脫鹽制得MBTI濃縮液;
5)吸附分離解吸將步驟4)脫鹽后的MBTI濃縮液經(jīng)Q-kpharose(購于安瑪西亞公司或DEAE-kpharose陰離子交換樹脂(購于安瑪西亞公司)吸附分離,MBTI吸附在樹脂上,吸附后的樹脂經(jīng)梯度淋洗解吸,得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。所述的步驟1)中硫酸濃度為0. 05-0. 1 mol/L,攪拌浸泡時間為18_36 h,組織搗碎后,以8000-12000 g離心15-30 min,上清液為MBTI粗提液。所述的步驟2)中堿采用1-2 mol/L的NaOH。所述的步驟3)中加熱條件采用60° C,90 min或80° C,30min或90° C,15 min 中的一種;10000-12000 g離心10-15 min,收集上清液為部分純化的綠豆胰蛋白酶抑制劑。所述的步驟4)中的上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾,截留大分子量蛋白,而分子量較小的MBTI (約9 kDa)則流出到外液;進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜超濾脫鹽,同時在超濾液中加入PH 7. 5-8. 0的20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液或磷酸緩沖液制得MBTI濃縮液。所述的步驟5)中陰離子交換樹脂采用二乙基氨乙基(DEAE-)或季氨基(Q-)陰離子交換樹脂;吸附后的樹脂經(jīng)0-0. 5 mol/L NaCl線性梯度的鹽淋洗解吸,得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。一種綠豆胰蛋白酶抑制劑在魚糜制品生產(chǎn)中的應(yīng)用,將綠豆胰蛋白酶抑制劑添加到以海水魚或淡水魚為主要原料的魚糜制品中,混合均勻,用于增強(qiáng)魚糜彈性。所述的綠豆胰蛋白酶抑制劑在魚糜制品中添加的終濃度為10-50 mg/kg以上, 使魚糜制品的凝膠強(qiáng)度提高10-20%。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明通過進(jìn)行低濃度硫酸抽提,加熱處理,膜分離,離子交換等手段,獲得高度純化的綠豆胰蛋白酶抑制劑。尤其是利用綠豆胰蛋白酶抑制劑分子量小(9 kDa)的特點(diǎn),采用30 kDa分子量截留的超濾膜去除大分子量雜蛋白。進(jìn)一步采用 5 kDa分子量截留的超濾膜去除小分子量小肽及鹽。與耗時較長的透析脫鹽相比,膜濃縮在實(shí)現(xiàn)快速脫鹽的同時減少了樣品體積,節(jié)省了下一步離子交換柱的上樣時間;膜處理也去除了分子量大于30 kDa和小于5 kDa的雜蛋白,顯著提高了純化效率。由于本發(fā)明利用陰離子交換樹脂快速有效分離綠豆胰蛋白酶抑制劑,因而具有工藝簡單,分離效果好,可大規(guī)模制備的優(yōu)點(diǎn),大大簡化了原來需要進(jìn)行多次柱層析的純化步驟。綜上所述,本發(fā)明主要采用低濃度硫酸抽提,加熱和膜技術(shù)處理脫鹽除雜蛋白,進(jìn)一步利用陰離子交換柱層析方法,快速有效地分離綠豆胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明采用膜技術(shù)加快了脫鹽速度并有效去除了高分子量和低分子量雜蛋白。
圖1為本發(fā)明純化綠豆胰蛋白酶抑制劑的質(zhì)譜圖,M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),1 純化的 MBTI ;
圖2為本發(fā)明純化綠豆胰蛋白酶抑制劑的Tricine-SDS-PAGE電泳圖,電泳膠為銀染
色;
圖3為本發(fā)明純化綠豆胰蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性圖;將MBTI在不同溫度下分別加熱30 min(#), Ih(D)和2h(A)后對胰蛋白酶的抑制活性殘留。圖4為本發(fā)明純化的綠豆胰蛋白酶抑制劑對魚糜制品凝膠強(qiáng)度的影響結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
本實(shí)施例的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分離純化方法,包括如下步驟
1、抽提將400 g綠豆磨碎成粉,加入1600 ml濃度為0.1 mol/L的硫酸,攪拌M h。 用Kinematica (瑞士)組織搗碎機(jī)搗碎30 min,12000 g下離心20 min,收集上清液約700 mL,即為MBTI粗提液。2、中禾口 向700 mL粗提液中加入1 mol/L NaOH,至溶液的pH呈中性。3、熱處理將中和后的MBTI粗提液在60° C水浴中加熱90 min,加熱后立即冷卻,12000 g離心10 min,收集上清液。4、膜處理將上述經(jīng)加熱處理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾,收集外液。進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜對收集外液超濾脫鹽濃縮,同時在超濾液中加入0.02 mol/L Tris-HCl, pH 8. 0,使溶液的最終pH為8. 0。5、吸附分離將步驟4脫鹽后的MBTI濃縮液經(jīng)上樣于Q-kpharose Fast Flow陰離子交換樹脂(2. 5X9 cm),流速lmL/min。吸附完畢后,用0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液 CpH 8.0)充分沖洗柱子至觀0 nm下的吸光度到基線。6、解吸吸附后的樹脂經(jīng) 200 mL 0. 02 mol/L Tris-HCl ( pH 8. 0)和 200 mL 0.02 mol/L Tris-HCKpH 8.0,含0.5 mol/L NaCl)混合組成的線性梯度洗脫液淋洗解吸, 收集洗脫液(2 mL/管)得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。7、樹脂再生解吸后,樹脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小時,再將樹脂拆下,在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小時,然后用大量蒸餾水清洗樹脂至近中性,樹脂再生完畢,可循環(huán)使用。純化的MBTI 上樣于 MALDI-T0F 質(zhì)譜儀(Shimadzu/Kratos,Kyoto,日本)進(jìn)行分子量測定,結(jié)果如圖1所示,峰值所對應(yīng)MBTI的分子量為8887. 25Da。將純化的MBTI通過 Tricine-SDS-PAGE分析,結(jié)果如圖2所示,電泳膠為銀染色,電泳結(jié)果為單一條帶,分子量與質(zhì)譜分析結(jié)果一致,表明本方法可獲得高純度MBTI。實(shí)施例2
本實(shí)施例的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分離純化方法,包括如下步驟
1、提取取IOOg綠豆粉,加入500 mL 0. 1 mol/L H2SO4攪拌放置20小時,充分組織搗碎,10000 g離心20 min,收集上清液約170 mL,即為MBTI粗提液。2、中和用2 mol/L NaOH調(diào)整粗提液pH,使得溶液pH穩(wěn)定在7左右。3、熱處理將中和后的MBTI粗提液在水浴中加熱80° C,30 min,加熱后立即冷卻,IOOOOg離心15 min,收集上清液。4、膜處理將上述經(jīng)加熱處理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾,截留大分子量蛋白,而分子量較小的目的蛋白MBTI (約9 kDa)則流出到外液。進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜對外液超濾脫鹽濃縮,同時在超濾液中適量加入0.02 mol/ L Tris-HCl CpH 8.0)確保脫鹽完全。5、吸附分離用 0. 02 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH=8. 0)平衡 Q-S印harose 陰離子交換樹脂(1.5X8 cm),將脫鹽后的MBTI蛋白母液泵入柱中,控制流速為1 mL/min。6、解吸吸附完畢后的樹脂用0. 02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)充分沖洗柱子至觀0 nm下的吸光度到基線。吸附后的樹脂用100 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)禾口 100 mL 0. 02 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 8. 0 含 0. 2 mol/L NaCl)混合組成的梯度洗脫液淋洗解吸,收集洗脫液(2 mL/管),得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。7、樹脂再生解吸后,樹脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小時,再將樹脂拆下,在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小時,然后用大量蒸餾水清洗樹脂至近中性,樹脂再生完畢,可循環(huán)使用。將以上方法制備的高純度MBTI在不同溫度下進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析,所得結(jié)果如圖3 所示。純化的MBTI在100°C加熱1小時后仍有85 %活性,2小時后仍有55 %的活性,表明其對熱穩(wěn)定。將以上方法制備的高純度MBTI或部分純化的MBTI添加到以淡水鰱魚為主要原料的魚糜制品中,使其終濃度達(dá)到40 mg/kg或以上,攪拌均勻,可有效抑制肌肉中的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性,使制品的凝膠強(qiáng)度增加10%。實(shí)施例3
本實(shí)施例的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分離純化方法,包括如下步驟
1、抽提將500 g干燥的綠豆磨碎成粉,加入3000 ml濃度為0.075 mol/L的硫酸,攪拌36 h,組織搗碎30 min后在12000 g下離心20 min,收集上清液約1250 mL,即為MBTI 粗提液。2、中禾口 向1250 mL粗提液中加入1. 2 mol/L NaOH,至溶液的pH呈中性。3、熱處理將中和后的MBTI粗提液在80°C水浴中加熱30 min,加熱后立即冷卻, 在12000 g離心15 min,收集上清液。4、膜處理將上述經(jīng)加熱處理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾,收集外液。進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜對外液超濾脫鹽濃縮,同時在超濾液中加入20 mmol/L Tris-HCl,調(diào)溶液的pH至7. 5。5、吸附分離將步驟4脫鹽后的MBTI濃縮液泵入DEAE-kpharose Fast Flow陰離子交換樹脂的吸附柱(2. 5X12 cm)中,流速1.5 mL/min,吸附完畢后的樹脂用0. 02 mol/ L Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)充分沖洗柱子至觀0 nm下的吸光度到基線。
6、解吸吸附后的樹脂分別經(jīng)0. 02 mol/L Tris-HCl (pH 8. 0)和含不同濃度NaCl 的0. 02 mol/L Tris-HCl (pH 8. 0)洗脫液淋洗解吸。NaCl濃度分別依次為0. 1,0. 2,0. 3、 0.4和0.5 mol/L,每個濃度分別淋洗80 mL。收集洗脫液(2 mL/管)得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。7、樹脂再生解吸后,樹脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小時,再將樹脂拆下,在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小時,然后用大量蒸餾水清洗樹脂至近中性,樹脂再生完畢,可循環(huán)使用。將以上方法制備的高純度MBTI或部分純化的MBTI添加到以海水魚藍(lán)圓鰺為主要原料的魚糜制品中,使其終濃度達(dá)到50 μ g/kg,攪拌均勻,可有效抑制肌肉中的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性,使制品的凝膠強(qiáng)度增加21%,結(jié)果如圖4所示。實(shí)施例4
本實(shí)施例的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分離純化方法,包括如下步驟
1、抽提將500 g綠豆磨碎成粉,加入2000 ml濃度為0. 1 mol/L的硫酸,攪拌抽提22 h,充分組織搗碎,在10000 g下離心15 min,收集上清液約870 mL,即為MBTI粗提液。2、中和向870 mL粗提液中加入2 mol/L NaOH,至溶液的pH呈中性。3、熱處理將中和后的MBTI粗提液在水浴鍋中90° C處理15分鐘,放在冰水中立即冷卻,10000 g下離心15 min,收集上清液。4、膜處理將上述經(jīng)加熱處理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾,截留大分子量蛋白,而分子量較小的目的蛋白MBTI (約9 kDa)則流出到外液。進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜對外液超濾脫鹽濃縮,同時在超濾液中適量加入20 mmol/ L磷酸緩沖液(pH 8.0)確保脫鹽完全。5、吸附分離將脫鹽后的MBTI蛋白母液泵入用0. 02 mol/L磷酸緩沖液(pH 8. 0) 平衡的Q-kpharose陰離子交換柱(1.5X10 cm)中,控制流速為1 mL/min。6、解吸吸附完畢后的樹脂用0. 02 mol/L磷酸緩沖液(pH 8. 0)充分淋洗柱子至 280 nm下的吸光度到基線。吸附后的樹脂用200 mL 0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH=8. 0)和 200 mL 0. 02 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0含0.4 mol/L NaCl)混合組成的梯度洗脫液解吸, 收集洗脫液(3 mL/管),得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。7、樹脂再生解吸后,樹脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小時,再將樹脂拆下,在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小時,然后用大量蒸餾水清洗樹脂至近中性,樹脂再生完畢,可循環(huán)使用。將以上方法制備的高純度MBTI或部分純化的MBTI添加到以海水魚藍(lán)圓鰺為主要原料的魚糜制品中,使其終濃度達(dá)到15 μ g/kg,攪拌均勻,可有效抑制肌肉中的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性,使制品的凝膠強(qiáng)度增加21%。實(shí)施例5
本實(shí)施例的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分離純化方法,包括如下步驟1、抽提將500 g干燥的綠豆磨碎成粉,加入2000 ml濃度為0.1 mol/L的硫酸,攪拌 24 h,組織搗碎30 min ;繼續(xù)攪拌10小時,再組織搗碎10分鐘后在12000 g下離心15 min, 收集上清液約900 mL,即為MBTI粗提液。2、中和向900 mL粗提液中加入1 mol/L NaOH,至溶液的pH呈中性。3、熱處理將中和后的MBTI粗提液在60°C水浴中加熱90 min,加熱后立即冷卻, 在12000 g離心12 min,收集上清液。4、膜處理將上述經(jīng)加熱處理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾,收集外液。進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜對外液超濾脫鹽濃縮,同時在超濾液中加入0.02 mol/L Tris-HCl,pH8. 0,使超濾液的最終pH達(dá)到8. 0。5、吸附分離將步驟4脫鹽后的MBTI濃縮液經(jīng)Q-kpharose Fast Flow陰離子交換樹脂(2. 5X8 cm)吸附分離,MBTI吸附在樹脂上。吸附完畢后的樹脂用0. 02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)充分淋洗至觀0 nm下的吸光度到基線。6、解吸吸附后的樹脂用 200 mL 0. 02 mol/L Tris-HCl ( pH 8. 0)和 200 mL 0.02 mol/L Tris-HCl (pH 8.0,含0.5 mol/L NaCl)混合組成的線性梯度洗脫液洗脫,收集洗脫液(2 mL/管),可得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。7、樹脂再生解吸后,樹脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小時,再將樹脂拆下,在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小時,然后用大量蒸餾水清洗樹脂至近中性,樹脂再生完畢,可循環(huán)使用。將以上方法制備的高純度MBTI或部分純化的MBTI添加到以淡水鰱魚為主要原料的魚糜制品中,使其終濃度達(dá)到25 μ g/kg,攪拌均勻,可有效抑制肌肉中的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性,使制品的凝膠強(qiáng)度增加14. 5%ο實(shí)施例6
本實(shí)施例的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑(Mung bean trypsin inhibitor, MBTI)的分離純化方法,包括如下步驟
1、提取將1000 g干燥的綠豆粉,加入4000 ml濃度為0.05 mol/L的硫酸,攪拌M h, 分成5份,每份組織搗碎30 min。在12000 g下離心15 min,收集上清液約1750 mL,即為 MBTI粗提液。2、中禾口 向1750 mL粗提液中加入1. 5 mol/L NaOH,至溶液的pH呈中性。3、熱處理將中和后的MBTI粗提液在水浴80° C中加熱30 min,加熱后立即冷卻,10000 g離心15 min,收集上清液。4、膜處理將上述3處理所得的MBTI上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾, 截留大分子,收集含目的蛋白MBTI (約9 kDa)的外液。進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜對外液超濾脫鹽濃縮,同時在超濾液中加入0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.幻,使脫鹽完全,體積約為300 mL。5、吸附分離將步驟4脫鹽后的MBTI濃縮液上樣于用0.02 mol/L磷酸緩沖液 CpH 7. 5)平衡的DEAE-S印harose Fast Flow陰離子交換柱(2· 5X 18 cm),流速2 mL/min。 吸附完畢后,用0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.5)充分淋洗柱子至觀0 nm下的吸光度到基線。
6、解吸吸附后的樹脂用400 mL 0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7. 5)和400 mL 0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7. 5,含0.5 mol/L NaCl)組成的線性梯度洗脫液解吸,收集洗脫液(4 mL/管)得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑(MBTI)。7、樹脂再生解吸后,樹脂先用2 mol/L NaCl溶液淋洗4小時,再將樹脂拆下,在 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小時,然后用大量蒸餾水清洗樹脂至近中性,樹脂再生完畢,可循環(huán)使用。將以上方法制備的高純度MBTI或部分純化的MBTI添加到以海水魚藍(lán)圓鰺為主要原料的魚糜制品中,使其終濃度達(dá)到30 mg/kg,擂潰攪拌均勻,可有效抑制肌肉中的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase, MBSP)活性,使最終制品的凝膠強(qiáng)度增加17. 6%。上述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例,但本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思并不局限于此,凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動,均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。
權(quán)利要求
1.一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法,其特征在于包括如下步驟1)提取將干燥的綠豆用粉碎機(jī)粉碎成粉末;以1:4-6 m/v比例溶于硫酸中,攪拌浸泡后,離心取其上清液為粗提液;2)中和向步驟1)所得的粗提液中加堿至溶液的pH呈中性;3)熱處理將步驟2)所得的粗提液在水浴中加熱,加熱后立即冷卻,離心收集上清液;4)膜處理將步驟3)所得的上清液用30kDa分子量截留的超濾膜超濾后取外液;進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜超濾脫鹽制得濃縮液;5)吸附分離解吸將步驟4)脫鹽后的濃縮液經(jīng)Q-kpharose或DEAE-kpharose陰離子交換樹脂吸附分離,綠豆胰蛋白酶抑制劑吸附在樹脂上,吸附后的樹脂經(jīng)梯度淋洗解吸, 得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法,其特征在于 所述的步驟1)中硫酸濃度為0. 05-0. 1 mol/L,攪拌浸泡時間為18-36 h,組織搗碎后,以 8000-12000 g離心15-30 min,上清液為粗提液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法,其特征在于所述的步驟2)中堿采用1-2 mol/L的NaOH。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法,其特征在于所述的步驟3)中加熱條件采用60° C,90min或80° C,30min或90° C,15min中的一種; 10000-12000 g離心10-15 min,收集上清液為部分純化的綠豆胰蛋白酶抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法,其特征在于所述的步驟4)中的上清液用30 kDa分子量截留的超濾膜超濾,截留大分子量蛋白,而分子量較小的蛋白則流出到外液;進(jìn)一步用5 kDa分子量截留的超濾膜超濾脫鹽,同時在超濾液中加入pH 7. 5-8. 0的20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液或磷酸緩沖液制得濃縮液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法,其特征在于所述的步驟5)中陰離子交換樹脂采用二乙基氨乙基或季氨基陰離子交換樹脂;吸附后的樹脂經(jīng)0-0. 5 mol/L NaCl梯度的鹽淋洗解吸,得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑。
7.一種如權(quán)利要求1所述的綠豆胰蛋白酶抑制劑在魚糜制品生產(chǎn)中的應(yīng)用,其特征在于將綠豆胰蛋白酶抑制劑添加到以海水魚或淡水魚為主要原料的魚糜制品中,混合均勻, 用于增強(qiáng)魚糜彈性。
8.如權(quán)利要求7所述的一種綠豆胰蛋白酶抑制劑在魚糜制品生產(chǎn)中的應(yīng)用,其特征在于所述的綠豆胰蛋白酶抑制劑在魚糜制品中添加的終濃度為10-50 mg/kg以上,使魚糜制品的凝膠強(qiáng)度提高10-20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種綠豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化方法,包括如下步驟1)提??;2)中和;3)熱處理;4)膜處理;5)吸附分離解吸,得到高純度綠豆胰蛋白酶抑制劑。以及將綠豆胰蛋白酶抑制劑添加到以海水魚或淡水魚為主要原料的魚糜制品中,混合均勻,用于增強(qiáng)魚糜彈性的應(yīng)用。本發(fā)明具有工藝簡單,分離效果好,其對魚糜制品彈性增強(qiáng)具有很大的改善作用。
文檔編號C07K1/18GK102295700SQ20111021563
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者曹敏杰 申請人:集美大學(xué)