專利名稱：乙肝病毒表面抗原的免疫顯性hla-a*1101限制性ctl表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，涉及一種抗原表位，特別涉及乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)的免疫顯性HLA-A*1101限制性CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)表位。
背景技術(shù)：
乙型肝炎Ofepatitis B)是由于感染了乙型肝炎病毒BOfepatitis B virus, HBV)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。目前全球約有4億HBV攜帶者，主要集中在發(fā)展中國家。在全球范圍內(nèi)，中國屬高流行區(qū)，HBV攜帶者約占總?cè)丝诘?0%(1. 2億)，慢性肝炎患者約3000萬。乙型肝炎多為圍產(chǎn)期傳播、青春期發(fā)病、青壯年惡化，因此其危害人群多為青壯年。大部分患者感染后通過自然病程痊愈，而部分患者遷延不愈并發(fā)展為肝硬化、 肝癌。據(jù)估計(jì)，全球每年至少有50萬慢性感染患者死于肝硬化和肝癌。乙型肝炎已成為我國最嚴(yán)重的公共健康問題之一。隨著對體液保護(hù)性免疫的深入認(rèn)識(shí)和預(yù)防性疫苗的使用， 乙型肝炎的特異性預(yù)防問題基本得到解決，但乙型肝炎的特異性治療至今一直未能突破。目前已證實(shí)=(I)HBV作為一種嗜肝病毒，并不能直接引起肝細(xì)胞損傷，其感染的病理和臨床后果取決于免疫機(jī)制；(2)作為細(xì)胞內(nèi)感染，慢性持續(xù)性感染狀態(tài)主要與機(jī)體抗感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答缺陷有關(guān)。其中，HBV特異性CTL反應(yīng)決定了 HBV感染的最終結(jié)果。 感染HBV后，CTL活性高者體內(nèi)病毒被清除而痊愈；CTL活性低或根本檢測不到的感染者則發(fā)展為慢性持續(xù)感染狀態(tài)，并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化或/和肝癌。因此，在體啟動(dòng)HBV特異性 CTL反應(yīng)有望解決HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài)及其相關(guān)疾病的防治問題，對研制乙型肝炎和乙肝繼發(fā)性肝硬化、肝癌的治療性疫苗具有非常重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，引起CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)的并非完整的病毒抗原分子，而是抗原來源的特異性CTL表位。抗原提呈細(xì)胞將抗原加工處理成多肽片段，該多肽片段即為CTL表位，其與主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子結(jié)合形成多肽-MHC復(fù)合物(pMHC)，并最終將pMHC呈遞到細(xì)胞表面供CD8+ T細(xì)胞表面的T細(xì)胞抗原受體(TCR)識(shí)別，從而活化CTL， 引發(fā)CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，在HBV相關(guān)抗原中鑒定出免疫顯性CTL表位是慢性乙型肝炎免疫治療的前提和基礎(chǔ)。CTL表位具有MHC I類分子限制性。既往研究發(fā)現(xiàn)的HBV相關(guān)抗原的免疫顯性CTL表位多是HLA-A*0201限制性表位。例如，目前已經(jīng)鑒定出HBcAg18^27為HBcAg的 HLA-A*0201限制性CTL表位，且該表位已應(yīng)用于乙型肝炎治療用多肽疫苗ε ΡΑ44的設(shè)計(jì)研發(fā)中。ε ΡΑ44摒棄了 HBcAg中抑制免疫反應(yīng)的不利因素并聯(lián)合了有利于激發(fā)細(xì)胞免疫的化學(xué)基團(tuán)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ε ΡΑ44能夠有效打破乙肝免疫耐受，重建針對HBcAgl8-27的特異性CTL免疫功能，有效抑制和清除乙肝病毒。目前，ε PA44已經(jīng)順利進(jìn)入臨床IIb期試驗(yàn)，但其局限性在于適用人群只能是HLA-A*0201個(gè)體。在我國，攜帶HLA-A*1101等位基因的人群占到了總?cè)巳旱慕种?，是僅次于HLA-A*0201的高頻等位基因。但目前關(guān)于 HBV來源的HLA-A* 1101限制性CTL表位的研究目前很少。文獻(xiàn)報(bào)道了一個(gè)HLA_A*1101限制性CTL表位HBcAg88,,是用弱酸及去污劑處理，抽提細(xì)胞膜上與HLA-A*1101分子結(jié)合的抗原肽，經(jīng)HPLC分離、純化及序列分析獲得的。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種HBsAg的免疫顯性HLA_A*1101限制性 CTL表位，目的之二在于提供該CTL表位在制藥方面的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
1. HBsAg的免疫顯性HLA-A*1101限制性CTL表位，由以下氨基酸序列組成=Ser-Met-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Thr-Lys (SEQ ID No. 1)，S卩 HBsA&95_304。2.所述HBsAg的免疫顯性HLA_A*1101限制性CTL表位在制備乙型肝炎治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明通過檢測抗原特異性CTL增殖、細(xì)胞因子分泌以及特異性CTL頻率檢測金標(biāo)準(zhǔn)pentamer技術(shù)等，從有效激發(fā)特異性CTL應(yīng)答的角度充分證實(shí)了 HBsA&95_3(14是一個(gè)免疫顯性HLA-A*1101限制性CTL表位，其對于攜帶HLA_A*1101 基因個(gè)體的外周血有很強(qiáng)的激發(fā)CTL應(yīng)答的能力，從而為研制覆蓋中國近三分之一的 HLA-A*1101陽性人群的乙型肝炎治療性多肽疫苗提供了新的候選核心序列，不僅如此，將其與HLA-A*0201限制性表位以及一些利于激發(fā)細(xì)胞應(yīng)答的化學(xué)基團(tuán)聯(lián)合用于制備乙型肝炎治療性多肽疫苗，還可以極大地拓寬疫苗的適用人群，有望覆蓋我國四分之三以上的乙肝患者，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為具有代表性的HLA-A*1101純合分型電泳圖。圖2為Elispot法檢測HBsA&95_3Q4誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN- γ的能力。圖3為胞內(nèi)因子染色檢測HBsA&95_3Q4誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN- γ的能力。圖4為CFSE標(biāo)記檢測HLA-A*1101陽性健康個(gè)體經(jīng)HBsA&95_3(14誘導(dǎo)刺激前后的特異性CTL增殖情況。圖5為肽-MHC五聚體技術(shù)(Pentamer)檢測HLA_A*1101陽性健康個(gè)體經(jīng) HBsAg295^304誘導(dǎo)刺激前后的特異性CTL頻率。圖6為Pentamer檢測HBsA&95_3(14在慢性乙型肝炎患者中的頻率。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。一、多肽HBcA&95_3。4的合成、純化及鑒定
多肽HBcAg295_3(l4委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案進(jìn)行合成，合成多肽粗品采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，純化后的多肽經(jīng)反相高效液相色譜法鑒定純度為96. 0%，經(jīng)質(zhì)譜法鑒定分子量與計(jì)算值一致，最后冷凍干燥，溫度-70°C保存?zhèn)溆谩６?、HLA_A*1101健康志愿者和慢性乙型肝炎患者的鑒定
分別取健康志愿者和慢性乙型肝炎患者外周血300 μ L，采用DNA提取試劑盒(TBG公司)獲得濃度為3(T60ng/ μ L的DNA 100 μ L，經(jīng)檢測其吸光度比值A(chǔ)260A280為1. 70 1· 90， 滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求；將所得DNA采用PCR-SSP低分試劑盒anvitrogen公司)鑒定HLA 型別。具有代表性的HLA-A*1101純合分型電泳圖如圖1所示。三、Elispot法檢測HBcA&95_3Q4誘導(dǎo)的特異性CTL分泌細(xì)胞因子IFN- γ的能力采用密度梯度離心法從HLA-A*1101健康志愿者靜脈血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞
(PBMC)，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，一部分調(diào)整細(xì)胞密度至1. 0 X 107/3mL,接種于6孔板；另一部分調(diào)整細(xì)胞密度至1. OX 106/mL，接種于48孔板。將接種于6孔板的PBMC在溫度37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育1. 5 小時(shí)，移除非貼壁細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞)，補(bǔ)充樹突狀細(xì)胞(DC)培養(yǎng)基2mL/孔，孵育1小時(shí)，移除非貼壁細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞即為抗原遞呈細(xì)胞DC，再補(bǔ)充DC培養(yǎng)基3mL/孔，并加入終濃度為800IU/mL的集落刺激因子(GM-CSF)和終濃度為1000IU/mL的白介素4 (IL-4)，孵育3天，再補(bǔ)充DC培養(yǎng)基1. 5mL/孔，并補(bǔ)充GM-CSF至終濃度為1600IU/mL、IL-4至終濃度為1000IU/mL，第6天重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5. 0 X 105/3mL，并加入終濃度為800 IU/mL的 GM-CSF、終濃度為1000IU/mL的IL-4、終濃度為10ng/mL的腫瘤壞死因子(TNF-a )、終濃度為lOng/mL的白介素1 β (IL-1 β )和終濃度為1000IU/mL的白介素6 (IL-6)，孵育1天獲得成熟DC，用流式細(xì)胞儀鑒定，備用。 將接種于48孔板的PBMC分別用終濃度為10 μ g/mL的HBsAfe5_3(14和HBcAfe_96 (陽性對照表位肽)刺激1(Γ14天；同時(shí)設(shè)植物血凝素(PHA)組和Blank組，兩組不加任何刺激物；之后各組每隔3天換液并加入終濃度為30IU/mL的IL-2和終濃度為5ng/mL的IL-7維持，得經(jīng)肽刺激過的PBMC。將前面制得的成熟DC離心重懸后按IX IO5/孔鋪板，分別加入終濃度為 10 μ g/mL 的 HBSA&5_3Q4(HBSA&95_3Q4 組)和 HBcAfe_96 (HBcAfe_96 組)以及終濃度為2. 5 μ g/mL的PHA (PHA組)，Blank組不加任何肽，于第7天按照數(shù)量比為1 10將各組負(fù)載肽的DC加入到上述經(jīng)相應(yīng)肽刺激過的同源PBMC中，7天為1個(gè)周期，共誘導(dǎo)2個(gè)周期，獲得肽特異性CTL。采用Elispot試劑盒檢測肽特異性CTL分泌IFN- γ的能力調(diào)整肽特異性CTL濃度至 LOXlOVmL,取 100 μ L 鋪板，分別加入終濃度為 10 μ g/mL 的 HBsAg295^304 (HBsAg295^304 組)和HBcAg88^96 (HBcAg88^96組)以及終濃度為2. 5 μ g/mL的PHA (PHA組)，Blank組不加任何肽，刺激48小時(shí)后去除細(xì)胞，按試劑盒說明書依次加入一抗、二抗和顯色劑進(jìn)行反應(yīng)，顯色晾干后讀數(shù)。結(jié)果如圖2所示(PHA組實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，柱狀圖中未顯示其結(jié)果)，HBsA&95_3Q4誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN- γ的能力明顯高于HBcAfe_96和Blank組(P<0. 01)。四、胞內(nèi)因子染色檢測HBsA&95_3Q4誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN- γ的能力
采用密度梯度離心法從HLA-A*1101純合慢性乙型肝炎患者的外周血中分離得到 PBMC,按前述方法培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)肽刺激1個(gè)周期后，加入負(fù)載相應(yīng)肽的同源DC，在第2個(gè)周期的第3天，分別加入終濃度為10 μ g/mL的HBsAg
295-304
(HBsAg2
95-304
組)和 HBcA&8_96(HBcAfe_96
組)以及終濃度為1 μ g/mL的PHA(PHA組)，Blank組不加任何肽，再加入高爾基阻斷劑 0. 7 μ L，6小時(shí)后采用胞內(nèi)因子染色試劑盒(eBioscience公司)對IFN-γ進(jìn)行染色，按照試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀測定，計(jì)算肽特異性CTL中分泌IFN- Y的T細(xì)胞(即CD3 + ⑶8 + IFN-Y +T細(xì)胞)所占的百分率。
結(jié)果如圖3所示，HBsAg295^304誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN- γ的能力明顯高于 HBcAg88^96 和 Blank 組。五、CFSE標(biāo)記檢測HLA_A*1101陽性健康個(gè)體經(jīng)HBsA&95_3(14誘導(dǎo)刺激前后的特異性CTL增殖
采用密度梯度離心法從HLA-A*1101健康志愿者靜脈血中分離得到PBMC，用CFSE溶液 (將0. 5 μ L濃度為10mmol/L的CFSE儲(chǔ)備液用ImL含0. 1%BSA的PBS稀釋制得)重懸細(xì)胞， 37°C孵育10分鐘，加入200 μ L胎牛血清，離心棄上清，用新鮮的預(yù)熱至37°C的含血清培養(yǎng)基重懸，370C孵育30分鐘(確保CFSE的完全修飾)，用培養(yǎng)基洗滌1次，再用含10%人AB 血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為lX106/mL，平衡過夜后，接種至48孔板， 每孔 lmL，分別加入終濃度為 10 μ g/mL 的 HBsA&5_3(14 (HBsAg295^304 組)和 HBcAfe_96 (HBcAg88^96 組)以及終濃度為1 μ g/mL的PHA (PHA組)，Blank組不加任何肽，經(jīng)肽刺激1個(gè)周期后，再加入負(fù)載相應(yīng)肽的同源DC，在溫度37°C、0)2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)3飛天，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果如圖4所示，HBsA&95_3Q4誘導(dǎo)的特異性CTL增殖較HBcAfe_96和Blank組明顯
J·日夕O六、Pentamer檢測HLA_A*1101陽性健康個(gè)體經(jīng)HBsAfe^3tl4誘導(dǎo)刺激前后的特異性CTL頻率
采用密度梯度離心法從HLA-A*1101健康志愿者靜脈血中分離得到PBMC，按前述方法培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)肽[HBsAfe5_3Q4、陽性對照表位肽HBcA^_96、陰性對照表位肽 HBcAg18^27(Control組)、Blank組不加任何肽]刺激1個(gè)周期后，加入負(fù)載相應(yīng)肽的同源 DC 誘導(dǎo) 10 天，獲得肽特異性 CTL，通過 PE 標(biāo)記的 HLA-A*1101/HBsAg295_3(14 及 HLA_A*1101/ HBcAg88^96 Pentamer染色后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測肽特異性CD8+CTL頻率。結(jié)果如圖5所示，誘導(dǎo)前均檢測不到肽特異性CTL頻率，但誘導(dǎo)10天后， HBsAg295^304誘導(dǎo)的特異性CTL頻率顯著高于HBcAg88_96誘導(dǎo)的特異性CTL頻率。七、Pentamer檢測HBsAg295_3(14在慢性乙型肝炎患者中的頻率
在8例HLA-A^l 101陽性的慢性乙型肝炎患者中，利用HLA-A^l 101/HBSAg295^304及 HLA- A*1101/HBcAg88_96 Pentamer檢測外周血中肽特異性CD8+CTL頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 HLA-A*1101陽性的慢性乙型肝炎患者外周血中，雖未經(jīng)肽誘導(dǎo)擴(kuò)增，仍然存在相應(yīng)的肽特異性⑶8+ CTL,占⑶8+ T細(xì)胞的頻率范圍從0. 1%到2. 3%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在同一個(gè)體中， HBsAg295^304特異性CTL頻率較HBcAfe_96特異性CTL頻率高，說明與已知的HLA_A*1101限制性表位HBcA&8_96相比，HBsAg295^304是更優(yōu)勢的HLA-A*1101限制性CTL表位。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.乙肝病毒表面抗原的免疫顯性HLA-A*1101限制性CTL表位，其特征在于，由以下氨基酸序列組成Ser-Met-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Thr-Lys。
2.權(quán)利要求1所述的乙肝病毒表面抗原的免疫顯性HLA-A*1101限制性CTL表位在制備乙型肝炎治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙肝病毒表面抗原的免疫顯性HLA-A*1101限制性CTL表位，由以下氨基酸序列組成Ser-Met-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Thr-Lys；其對于攜帶HLA-A*1101基因個(gè)體的外周血有很強(qiáng)的激發(fā)CTL應(yīng)答的能力，從而為研制覆蓋中國近三分之一的HLA-A*1101陽性人群的乙型肝炎治療性多肽疫苗提供了新的候選核心序列。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102286075SQ20111021781
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者牛微, 王文博, 王莉, 陳曉玲 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)