專利名稱：靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人免疫球蛋白及其制備方法，特別是一種靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
巨細(xì)胞病毒CMV(Cytomegalovirus)是皰疹病毒科β屬的DNA病毒，由巨細(xì)胞病毒引起的孕婦、新生兒、器官移植患者、免疫抑制患者感染死亡率可達(dá)50% 80%。巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白CMV-IgG因能特異中和巨細(xì)胞病毒，臨床上主要用其治療孕婦、新生兒、 免疫抑制患者及器官移植手術(shù)中弓I發(fā)的巨細(xì)胞病毒重癥感染。普通人群中的巨細(xì)胞病毒自然感染率可達(dá)80%以上，從健康人群中篩選并采集含高效價(jià)巨細(xì)胞病毒IgG抗體的血漿， 采用特定的分離純化方法制備巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白藥物，對于治療因巨細(xì)胞病毒引起的重癥感染具有不可替代的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，已上市的特異性人免疫球蛋白類藥物大多采用低溫乙醇法(Edwin J. Cohn, L. Ε. Strong, W. L. Hughes JR. , D. J. Mulford, J. N. Ashworthm, M. Melin and H. L. Taylor, J.Am. Chem. Soc.，68 (1946) 459-475.)進(jìn)行分離提純，該法由1946年美國哈佛大學(xué)Edwin. J. Cohn教授發(fā)明，通過調(diào)節(jié)工藝中的pH，蛋白濃度，溫度，乙醇濃度和離子強(qiáng)度五個參數(shù)來實(shí)現(xiàn)不同蛋白的分離。長期實(shí)踐表明，低溫乙醇法存在以下幾方面的缺陷首先，乙醇是一種蛋白變性劑，分離過程中易引起IgG結(jié)構(gòu)改變而變性失活，導(dǎo)致效價(jià)回收率較低，還可能導(dǎo)致新的抗原決定簇的形成；其次，相比柱層析技術(shù)，乙醇沉淀純化效率較低，通常需要減少蛋白回收率來達(dá)到產(chǎn)品的純度要求，因此工藝過程收率偏低，產(chǎn)品純度不高；再次，因分離過程通常需在低溫條件下進(jìn)行，還存在硬件及運(yùn)行成本高，勞動強(qiáng)度大等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法，要解決的技術(shù)問題是提高產(chǎn)品的純度、收率及安全性。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白，所述靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2. 5PEI-U/mg,抗-CMV效價(jià)不小于100PEI-U/ml，純度大于 98. 2%，蛋白含量為51 55mg/ml。一種靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白的方法，包括以下步驟(1)FI+II+III、FII+III 沉淀制備取經(jīng)酶聯(lián)免疫法測定的抗-CMV高效價(jià)的人血漿，2 30°C下融漿，合并混合；①FI+II+III沉淀制備用生理鹽水調(diào)節(jié)血漿蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6. 0 6. 5， 加入95%乙醇或無水乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至20 25%，反應(yīng)溫度為-5. 5 -4. 5°C，攪拌反應(yīng)為4 6小時，反應(yīng)完畢離心或壓濾分離獲得FI+II+III沉淀；②FII+III沉淀制備
用生理鹽水調(diào)節(jié)血漿蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6. 8 7. 2， 加入體積比分?jǐn)?shù)為95%的乙醇或無水乙醇并調(diào)節(jié)乙醇濃度至7. 5 8. 5%，反應(yīng)溫度為-2. 5 -2. 0°C，攪拌反應(yīng)4小時，反應(yīng)完畢經(jīng)離心或壓濾分離去除FI沉淀，獲得上清液，用冰乙酸調(diào)節(jié)上清液pH至6. 0 6. 5，加入95%乙醇或無水乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至20 25%，反應(yīng)溫度為-5. 5 -4. 5°C，攪拌反應(yīng)為4 6小時，反應(yīng)完畢經(jīng)離心或壓濾分離獲得 FII+III 沉淀；(2)FI+II+III 或 FII+III 沉淀溶解FI+II+III或FII+III沉淀用0. 9 1. 1倍血漿量的pH為4. 8 5. 2、濃度為20 SOmM乙酸鈉緩沖液在2 8°C下攪拌8 16小時，使沉淀充分溶解，經(jīng)離心或壓濾分離上
清液；⑶辛酸沉淀用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)上清液pH至4. 5 5. 5，按10 lOOmmol/L濃度加入辛酸，在18 25°C下攪拌反應(yīng)1 3小時，經(jīng)離心或過濾分離上清液；(4)辛酸病毒滅活上清液用孔徑為1. 0 μ m濾膜過濾，控制過濾壓力不大于0. 25MPa，用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)濾液pH至4. 5 5. 5，補(bǔ)加注射用水或辛酸調(diào)節(jié)懸液辛酸濃度至20 80mmol/L，在20 30°C下攪拌1 2小時，離心或過濾分離上清液；(5)乙醇沉淀用0. 5 lmol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)上清液pH至4. 5 5. 5，按12 16%濃度加入95%乙醇或無水乙醇進(jìn)行沉淀反應(yīng)，在-4. 0 -2. 5°C下攪拌反應(yīng)2 8小時，離心或壓濾分離上清液；(6)超濾上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，控制過濾壓力不大于0. 25MPa,濾液用30KD超濾膜 15 20倍濃縮，經(jīng)8 10倍體積pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸鹽緩沖液超濾透析，超濾后收樣控制蛋白含量為25 40mg/ml ；(7)陰離子交換層析用pH為6. 0 7. 1、濃度為20 60mmol/L的磷酸鹽緩沖液作為平衡緩沖液平衡層析柱8 10柱體積，按每毫升填料不大于填料最大載量的70 80%計(jì)算上樣蛋白量，上樣后收集穿透液，掛柱雜蛋白經(jīng)含2mol/LNaCl的pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫；(8)納米膜除病毒過濾用0. 5 lmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)穿透液pH至4. 2 5. 0，經(jīng)0. 1 μ m濾膜預(yù)過濾后，用 Novasip DV20納米膜過濾除病毒，控制過濾壓力不大于0. 25Mpa ；(9)超濾除病毒后濾液經(jīng)30KD超濾膜濃縮蛋白含量至80 100mg/ml，用8 10倍注射用水超濾，超濾后收樣控制蛋白含量為80 150mg/ml ；(10)配制測定超濾后原液蛋白含量，用注射用水稀釋調(diào)整制品蛋白含量至51 55mg/ml， 同時按9 11%的量加入麥芽糖，用0.5 lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 8 4. 2。
本發(fā)明的方法在所述配制步驟后除菌分裝，經(jīng)0.2μπι濾膜過濾除菌，控制過濾壓力不大于0. 25MPa，按蛋白含量51 55mg/ml，效價(jià)不小于100PEI-U/ml規(guī)格分裝。本發(fā)明的方法抽樣測定分裝后制品蛋白含量，抗-CMV效價(jià)，純度，分子大小分布， 辛酸殘留量，滲透壓摩爾濃度的項(xiàng)目質(zhì)量指標(biāo)。本發(fā)明的在陰離子交換層析步驟中加入填料，填料選自DEAE Sepharose Fast Flow、TOYOPEARL DEAE 650M 或 Macro-Pr印 DEAE Media。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的全過程低溫乙醇分級分離工藝方法相比，具有的技術(shù)效果如下(1)采用了條件溫和的辛酸沉淀及陰離子交換層析工藝，減少了低溫乙醇沉淀的步驟，在提高產(chǎn)品收率的同時，能有效保持IgG的活性，提高純度和收率。工藝過程效價(jià)回收率為40 65%，純化倍數(shù)為5. 30 8. 14，IgG回收率大于4. 9g/L，純度大于98. 2%，IgG 多聚體小于0. 1%。(2)工藝過程中采用了辛酸病毒滅活和納米膜過濾除病毒工藝，能有效滅活和去除病毒，結(jié)合陰離子交換層析，工藝過程病毒降低量大于121og1(l。(3)辛酸沉淀能有效沉淀非免疫球蛋白類雜質(zhì)，而IgG、IgA、銅藍(lán)蛋白保留在上清液中，沉淀過程抗體效價(jià)回收率可達(dá)90 %以上。(4)陰離子交換層析能有效去除多聚體及酸性雜蛋白，經(jīng)純化后最終產(chǎn)品不含多聚體、白蛋白等雜質(zhì)。(5)本發(fā)明工藝的生產(chǎn)周期為5 7天，現(xiàn)有技術(shù)的低溫乙醇工藝生產(chǎn)周期為 28 30天，有效提高了生產(chǎn)效率，同時減少了乙醇的使用量，降低能耗和勞動強(qiáng)度，能有效節(jié)約生產(chǎn)成本。總之，本發(fā)明所用的巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白的制備工藝不僅提高了產(chǎn)品純度、 收率和安全性，還能節(jié)省能耗和降低生產(chǎn)成本。


圖1是本發(fā)明靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白純化工藝流程圖。圖2是現(xiàn)有技術(shù)低溫乙醇法制備普通人免疫球蛋白工藝流程圖。圖3是實(shí)施例1靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白純化樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖譜。圖4是實(shí)施例2靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白純化樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖譜。圖5是實(shí)施例3靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白純化樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖譜。圖6是實(shí)施例4靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白純化樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖譜。圖7是實(shí)施例5靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白純化樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖譜。圖8是對比例1靜注人免疫球蛋白pH4純化樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1，如圖1所示，(1)取經(jīng)酶聯(lián)免疫法測定抗-CMV高效價(jià)的人血漿20人份，25°C條件下融漿，混合后體積為11540ml。(2)加入生理鹽水2310ml調(diào)節(jié)血漿蛋白含量至49. 53mg/ml，，加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至6. 18，加入無水乙醇3^6ml調(diào)節(jié)懸液乙醇濃度至22%，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度至-5. 0°C，攪拌反應(yīng)4小時，反應(yīng)完畢離心分離獲得FI+II+III沉淀。(3)FI+II+III沉淀用pH為4. 93、濃度為50mmol/L乙酸鈉緩沖液11500ml進(jìn)行溶解，4°C下攪拌12小時，離心分離上清液。(4)用4mol/L乙酸調(diào)節(jié)上清pH至4. 57，60mmol/L濃度加入辛酸，在21°C下攪拌反應(yīng)3小時，離心分離上清液。(5)上清液經(jīng)1. 0 μ m濾膜過濾，控制過濾壓力不大于0. 25MPa,用0. 5mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至4. 74，補(bǔ)加注射用水調(diào)整辛酸濃度至22mmol/L，22°C下攪拌1小時滅活脂包
膜病毒，離心分離上清液。(6)用0. 5mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)上清pH至5. 11，按14%濃度加入無水乙醇2070ml， 在-3. 8°C下反應(yīng)7小時，離心分離上清液。(7)上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，控制過濾壓力不大于0. 25MPa,濾液用30KD超濾膜20倍濃縮，經(jīng)8倍體積pH為6. 63、濃度為25mmol/L磷酸鹽緩沖液超濾，超濾后收樣 2000ml，蛋白含量為 36. 81mg/ml。(8)用 pH 為 6. 63、濃度為 25mmol/L 磷酸鹽緩沖液平衡 DEAE Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences AB，美國)柱10個柱體積，柱體積為200ml，，將超濾后濾液過柱，收集穿透液7000ml，掛柱雜蛋白用含2mol/LNaCl的pH為6. 63、濃度為25mmol/ L的磷酸鹽緩沖液洗脫。(9)用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)穿透液pH至4.25，經(jīng)0. Iym濾膜預(yù)過濾后，再用Novasip DV20納米膜過濾除病毒，控制過濾壓力不大于0. 25MPa。(10)除病毒后濾液用30KD超濾膜10倍濃縮，經(jīng)8倍體積注射用水超濾，收獲原液 600ml，蛋白含量為107. 21mg/ml，用注射用水稀釋并按10g/L的量加入麥芽糖，用0. 5mol/ L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 02，經(jīng)0. 2 μ m濾膜過濾除菌，控制過濾壓力不大于0. 25MPa,按蛋白含量51 55mg/ml，效價(jià)不小于100PEI_U/ml規(guī)格分裝，分裝后抽樣用凱氏定氮法檢測蛋白含量、用酶聯(lián)免疫法法測定效價(jià)、非還原型E聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE法測定純度及白蛋白殘留、PH值測定法測定pH值，高效液相色譜法測定IgG單體、二聚體、多聚體、裂解體，氣相色譜法測定辛酸殘留量，滲透壓摩爾濃度測定法測定滲透壓摩爾濃度，檢測結(jié)果見表6。工藝過程蛋白及效價(jià)回收率見表1。表1工藝過程蛋白及效價(jià)回收率
權(quán)利要求
1.一種靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于所述靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2. 5PEI-U/mg，抗-CMV效價(jià)不小于100PEI-U/ml，純度大于98. 2%，蛋白含量為 51 55mg/ml。
2.一種靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白的方法，包括以下步驟(1)FI+II+III、FII+III沉淀制備取經(jīng)酶聯(lián)免疫法測定的抗-CMV高效價(jià)的人血漿，2 30°C下融漿，合并混合；①FI+II+III沉淀制備用生理鹽水調(diào)節(jié)血漿蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6. 0 6. 5，加入 95%乙醇或無水乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至20 25%，反應(yīng)溫度為-5. 5 -4. 5°C，攪拌反應(yīng)為 4 6小時，反應(yīng)完畢離心或壓濾分離獲得FI+II+III沉淀；②FII+III沉淀制備用生理鹽水調(diào)節(jié)血漿蛋白含量至45 5511^/1111，用冰乙酸調(diào)節(jié)？!1至6.8 7.2， 加入體積比分?jǐn)?shù)為95%的乙醇或無水乙醇并調(diào)節(jié)乙醇濃度至7. 5 8. 5%，反應(yīng)溫度為-2. 5 -2. 0°C，攪拌反應(yīng)4小時，反應(yīng)完畢經(jīng)離心或壓濾分離去除FI沉淀，獲得上清液，用冰乙酸調(diào)節(jié)上清液pH至6. 0 6. 5，加入95%乙醇或無水乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至20 25%，反應(yīng)溫度為-5. 5 -4. 5°C，攪拌反應(yīng)為4 6小時，反應(yīng)完畢經(jīng)離心或壓濾分離獲得 FII+III 沉淀；(2)FI+II+III或 FII+III 沉淀溶解FI+II+III或FII+III沉淀用0. 9 1. 1倍血漿量的pH為4. 8 5. 2、濃度為20 SOmM乙酸鈉緩沖液在2 8°C下攪拌8 16小時，使沉淀充分溶解，經(jīng)離心或壓濾分離上清液；(3)辛酸沉淀用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)上清液pH至4. 5 5. 5，按10 lOOmmol/L濃度加入辛酸，在18 25°C下攪拌反應(yīng)1 3小時，經(jīng)離心或過濾分離上清液；(4)辛酸病毒滅活上清液用孔徑為Ι.Ομπι濾膜過濾，控制過濾壓力不大于0. 25MPa，用4mol/L乙酸或 0. 5 lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)濾液pH至4. 5 5. 5，補(bǔ)加注射用水或辛酸調(diào)節(jié)懸液辛酸濃度至20 80mmol/L，在20 30°C下攪拌1 2小時，離心或過濾分離上清液；(5)乙醇沉淀用0. 5 lmol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)上清液pH至4. 5 5. 5，按12 16%濃度加入 95%乙醇或無水乙醇進(jìn)行沉淀反應(yīng)，在-4. 0 -2. 5°C下攪拌反應(yīng)2 8小時，離心或壓濾分離上清液；(6)超濾上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，控制過濾壓力不大于0. 25MPa,濾液用30KD超濾膜15 20倍濃縮，經(jīng)8 10倍體積pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸鹽緩沖液超濾透析，超濾后收樣控制蛋白含量為25 40mg/ml ；(7)陰離子交換層析用pH為6. 0 7. 1、濃度為20 60mmol/L的磷酸鹽緩沖液作為平衡緩沖液平衡層析柱8 10柱體積，按每毫升填料不大于填料最大載量的70 80%計(jì)算上樣蛋白量，上樣后收集穿透液，掛柱雜蛋白經(jīng)含2mol/LNaCl的pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫；(8)納米膜除病毒過濾用0. 5 lmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)穿透液pH至4. 2 5. 0，經(jīng)0. 1 μ m濾膜預(yù)過濾后，用 Novasip DV20納米膜過濾除病毒，控制過濾壓力不大于0. 25Mpa ；(9)超濾除病毒后濾液經(jīng)30KD超濾膜濃縮蛋白含量至80 100mg/ml，用8 10倍注射用水超濾，超濾后收樣控制蛋白含量為80 150mg/ml ；(10)配制測定超濾后原液蛋白含量，用注射用水稀釋調(diào)整制品蛋白含量至51 55mg/ml，同時按9 11%的量加入麥芽糖，用0.5 lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 8 4. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白的方法，其特征在于在所述配制步驟后除菌分裝，經(jīng)0. 2 μ m濾膜過濾除菌，控制過濾壓力不大于0. 25MPa,按蛋白含量 51 55mg/ml，效價(jià)不小于100PEI-U/ml規(guī)格分裝。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白的方法，其特征在于抽樣測定分裝后制品蛋白含量，抗-CMV效價(jià)，純度，分子大小分布，辛酸殘留量，滲透壓摩爾濃度的項(xiàng)目質(zhì)量指標(biāo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白的方法，其特征在于在陰離子交換層析步驟中加入填料，填料選自DEAE Sepharose Fast Flow、T0Y0PEARL DEAE 650M 或 Macro-Prep DEAE Media。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法，要解決的技術(shù)問題是提高產(chǎn)品的純度、收率及安全性。本發(fā)明的靜注巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2.5PEI-U/mg，抗-CMV效價(jià)不小于100PEI-U/ml，純度大于98.2％，蛋白含量為51～55mg/ml。本發(fā)明采用辛酸沉淀、陰離子交換層析代替?zhèn)鹘y(tǒng)低溫乙醇法部分乙醇沉淀步驟，將IgG始終保留在上清液中，以保持IgG的活性；采用辛酸病毒滅活與納米膜除病毒工藝，有效地保障產(chǎn)品的安全性，研究表明本發(fā)明的制備方法不僅提高了產(chǎn)品純度、收率和安全性，還能節(jié)省能耗和降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C07K1/36GK102286099SQ201110223760
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者丁玉江, 劉永娣, 吳開永, 吳恩應(yīng), 宋清爽, 張佩, 張信, 張彥鵬, 張運(yùn)佳, 戴美蘭, 李慧, 王春華, 王錦才, 羅姍, 郭采平, 陳玉琴, 黃偉榮, 黃倩云 申請人:深圳市衛(wèi)武光明生物制品有限公司