專利名稱：一種從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法，屬于生物醫(yī)用材料的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25% -30%，是腱、軟骨、皮膚和血管的主要成分，I型膠原蛋白分子由三條肽鏈組成，兩條α I鏈、一條 α Π鏈，三條肽鏈以特有的左手螺旋相互纏繞構(gòu)成右手螺旋，分子結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)獨(dú)特的甘氨酸-X-Y(Χ、Υ為其他種類的氨基酸，多為脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸)周期結(jié)構(gòu)。膠原蛋白獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性，因此，膠原蛋白在醫(yī)學(xué)、美容、化妝品、保健品和食品中有著廣泛的應(yīng)用。迄今為止，豬、牛等陸生動(dòng)物的皮和跟腱仍然是提取未變性天然膠原的主要原材料。但是由于瘋牛病和口蹄疫等動(dòng)物傳染性疾病全球肆虐，并且尚無(wú)有效治療方法，以致人們對(duì)使用從陸生動(dòng)物組織中提取的未變性天然膠原產(chǎn)生恐慌。于是，尋求更高質(zhì)量和更高安全性的提取未變性天然膠原的原材料迫在眉睫。目前，水產(chǎn)動(dòng)物組織中提取膠原蛋白已經(jīng)成為可行之徑，其膠原相比陸生動(dòng)物在安全性上具有更大的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，它還具有陸生動(dòng)物所沒(méi)有的一些特點(diǎn)，因此，水產(chǎn)動(dòng)物已經(jīng)成為未變性天然膠原提取材料的新目標(biāo)。牛蛙，屬脊椎動(dòng)物門，兩棲綱蛙科中的大型種類，體重可超過(guò)1000克。牛蛙的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常豐富，每100克蛙肉中含蛋白質(zhì)19. 9克，脂肪0. 3克，是一種高蛋白質(zhì)、低脂肪、低膽固醇營(yíng)養(yǎng)食品，備受人們的喜愛(ài)。牛蛙養(yǎng)殖業(yè)日益壯大，牛蛙產(chǎn)量逐年增加。牛蛙的皮膚組織重量約占其體量的5%，食用過(guò)程中通常被廢棄，造成了大量的生物資源的浪費(fèi)。從遺棄的牛蛙皮膚組織中提取優(yōu)質(zhì)未變性天然膠原，深度開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品，不僅可以解決廢棄物的污染問(wèn)題，更重要的是，生物質(zhì)資源的綜合開(kāi)發(fā)和高值利用，將產(chǎn)生巨大的環(huán)境效益和社會(huì)效益。目前，未變性天然膠原蛋白的提取方法主要有酸法、堿法、酶法和結(jié)合法，如 CN101979654A和CN101948900A分別介紹了以魚(yú)皮和牛軟骨為原料的酶法提取膠原蛋白的方法，CN1385489A介紹了一種從雞胸軟骨中堿法提取膠原蛋白的方法，CN1155549A介紹了一動(dòng)物結(jié)締組織為原料的酸法提取膠原蛋白的方法，此外，人們還將上述幾種方法結(jié)合使用來(lái)提取膠原。不過(guò)，上述方法的原料多為哺乳動(dòng)物或魚(yú)類，鮮有涉及兩棲類動(dòng)物，同時(shí)，單一方法提取未變性天然膠原蛋白的產(chǎn)率均不太理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法，其特點(diǎn)是該方法采用預(yù)處理、提取和純化三步預(yù)處理用氫氧化鈉溶液、雙氧水溶液和脫脂劑處理分別除去非膠原蛋白、色素和脂肪；提取則用乙酸溶液和乙酸-蛋白酶先后提取得到酸溶膠原和酶溶膠原溶液；純化則是利用多次鹽析后凍干得到海綿狀牛蛙皮膠原。較好地保存了膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)及其生理功能。提高了牛蛙皮廢棄物的附加值，牛蛙皮未變性天然膠原蛋白的提取率不低于80 %。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說(shuō)明外，均為摩爾份數(shù)。從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法包括以下步驟(1)原料預(yù)處理將新鮮牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗凈，擠干，切碎；加入料液比為1 20-40， 濃度為0. 05-0. 2M/LNa0H溶液處理對(duì)-4 1，維持勻速攪拌，中途換液2_5次，將牛蛙皮取出， 沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)PH至8-12，加入料液比為1 5-30，體積濃度為1 % -8%的H2A溶液處理 12-48h，維持勻速攪拌，中途換液2-4次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至6. 0-6. 5，用料液比為1 10-50，體積濃度為30%-70%脫脂劑處理12-24h，維持勻速攪拌，取出，沖洗， 純水浸泡過(guò)夜，擠干，備用；(2)未變性天然膠原的提取將上述預(yù)處理所得的牛蛙皮60-100重量份用濃度為0. 1-2M/L乙酸溶液浸提 M-4 !，維持勻速攪拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用濃度為0. 1-2M/L乙酸溶液復(fù)提6-Mh，得到酸溶牛蛙皮膠原溶液；向牛蛙皮沉渣中繼續(xù)加入濃度為0. 1-2M/L乙酸溶液，并加入濃度為 1% -5%蛋白酶浸提M-4 !，維持勻速攪拌，得到酶溶牛蛙皮膠原溶液；(3)未變性天然膠原的純化將上述所得到的酸溶牛蛙皮膠原溶液和酶溶牛蛙皮膠原溶液用濃度為0. 6-4M/ L鹽分別鹽析，在溫度4°C以下，以5000-20000rpm離心10_15min，沉淀用濃度為0. 1-2M/ L乙酸溶液復(fù)溶，鹽析2-4次；將得到的沉淀分別溶于濃度為0. 1-2M/L乙酸中，以濃度為 0. 1-1M/L的乙酸溶液為透析液透析處理2-3天，凍干，得到海綿狀牛蛙皮膠原；(4)以上步驟中除特殊說(shuō)明外，均在溫度15°C以下進(jìn)行。脫脂劑為異丙醇、丁醇和丙酮中的至少一種。蛋白酶為胃蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌復(fù)合酶和537蛋白酶中的至少一種。鹽為氯化鈉、硫酸銨、硫酸鈉或硫酸鎂中的任一種。從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法制備得到未變性天然膠原。未變性天然膠原用于醫(yī)學(xué)、美容、化妝品、保健品和食品領(lǐng)域。性能測(cè)試未變性天然牛蛙皮膠原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖1所示， 結(jié)果表明牛蛙皮膠原含有分子量為30萬(wàn)、20萬(wàn)和10萬(wàn)的γ鏈、β鏈和α鏈，其中α鏈為兩條，很好地保存了膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)。本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)1、預(yù)處理方法能很大限度地除去非膠原蛋白和色素；2、分別使用酸法和酸酶結(jié)合法提取膠原，干重提取率不低于80%，產(chǎn)品色純白，品質(zhì)優(yōu)良；3、制得的天然膠原不同于水解膠原，它具有獨(dú)特的生物相容性、低抗原性和生物降解性；4、所有流程均在低溫下操作，保留了膠原特有的三股螺旋結(jié)構(gòu)，保證了膠原蛋白的活性和結(jié)構(gòu)的完整性。


圖1.為未變性天然牛蛙皮膠原蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖1為酸溶牛蛙皮未變性天然膠原，2為酶溶牛蛙皮未變性天然膠原，其中，Mark為標(biāo)準(zhǔn)樣，分子量分別為 66kDa、97. 4kDa、116kDa、200kDa。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例1 (1)原料預(yù)處理將新鮮牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗凈，擠干，切碎；加入料液比為1 20，濃度為0. 05M/L NaOH溶液處理48h，維持勻速攪拌，中途換液5次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至8-12，加入料液比為1 5，體積濃度為8%的H2A溶液處理12h，維持勻速攪拌，中途換液2次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至6. 0-6. 5，用料液比為1 10，體積濃度為 30%異丙醇處理Mh，維持勻速攪拌，取出，沖洗，純水浸泡過(guò)夜，擠干，備用；(2)未變性天然膠原的提取將上述預(yù)處理所得的牛蛙皮60g(干重15. 6g)用濃度為0. 1M/L乙酸溶液浸提 Mh，維持勻速攪拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用濃度為0. 1M/L乙酸溶液復(fù)提他，得到酸溶牛蛙皮膠原溶液，向牛蛙皮沉渣中繼續(xù)加入濃度為0. 1M/L乙酸溶液，并加入濃度為胃蛋白酶浸提48h，維持勻速攪拌，得到酶溶牛蛙皮膠原溶液；(3)未變性天然膠原的純化將上述所得到的酸溶牛蛙皮膠原溶液和酶溶牛蛙皮膠原溶液用濃度為0. 6M/L氯化鈉分別鹽析，在溫度4°C以下，以20000rpm離心10分鐘，沉淀用濃度為0. 1M/L乙酸溶液復(fù)溶，鹽析2次；將得到的沉淀分別溶于濃度為0. 5M/L乙酸中，以濃度為0. 1M/L的乙酸溶液為透析液透析處理2天，凍干，得到海綿狀牛蛙皮膠原蛋白12. Sg,干重提取率為 82. 05% ；(4)以上步驟中除特殊說(shuō)明外，均在溫度15°C以下進(jìn)行。實(shí)施例2 (1)原料預(yù)處理將新鮮牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗凈，擠干，切碎；加入料液比為1 40，濃度為0. 2M/L NaOH溶液處理Mh，維持勻速攪拌，中途換液2次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至8-12，加入料液比為1 30，體積濃度為1 %的H2A溶液處理48h，維持勻速攪拌， 中途換液4次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至6. 0-6. 5，用料液比為1 50，體積濃度為70%丁醇處理12h，維持勻速攪拌，取出，沖洗，純水浸泡過(guò)夜，擠干，備用；(2)未變性天然膠原的提取
將上述預(yù)處理所得的牛蛙皮IOOg (干重沈.Og)用濃度為2M/L乙酸溶液浸提48h， 維持勻速攪拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用濃度為2M/L乙酸溶液復(fù)提Mh，得到酸溶牛蛙皮膠原溶液，向牛蛙皮沉渣中繼續(xù)加入濃度為2M/L乙酸溶液，并加入濃度為5wt%酸性蛋白酶浸提Mh，維持勻速攪拌，得到酶溶牛蛙皮膠原溶液；(3)未變性天然膠原的純化將上述所得到的酸溶牛蛙皮膠原溶液和酶溶牛蛙皮膠原溶液用濃度為4M/L硫酸銨分別鹽析，在溫度4°C以下，以5000rpm離心15分鐘，沉淀用濃度為2M/L乙酸溶液復(fù)溶， 鹽析4次；將得到的沉淀分別溶于濃度為2M/L乙酸中，以濃度為1M/L的乙酸溶液為透析液透析處理3天，凍干，得到海綿狀牛蛙皮膠原蛋白20.91g，干重提取率為80. 44% ；(4)以上步驟中除特殊說(shuō)明外，均在溫度15°C以下進(jìn)行。實(shí)施例3 (1)原料預(yù)處理將新鮮牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗凈，擠干，切碎；加入料液比為1 30，濃度為0. 1M/L NaOH溶液處理36h，維持勻速攪拌，中途換液4次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至8-12，加入料液比為1 15，體積濃度5%的H2O2溶液處理Mh，維持勻速攪拌，中途換液3次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至6. 0-6. 5，用料液比為1 30，體積濃度為 50%丙酮處理18h，維持勻速攪拌，取出，沖洗，純水浸泡過(guò)夜，擠干，備用；(2)未變性天然膠原的提取將上述預(yù)處理所得的牛蛙皮80g(干重20. Sg)用濃度為1M/L乙酸溶液浸提36h， 維持勻速攪拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用濃度為1M/L乙酸溶液復(fù)提12h，得到酸溶牛蛙皮膠原溶液，向牛蛙皮沉渣中繼續(xù)加入濃度為1M/L乙酸溶液，并加入濃度為3wt%真菌復(fù)合酶浸提36h，維持勻速攪拌，得到酶溶牛蛙皮膠原溶液；(3)未變性天然膠原的純化將上述所得到的酸溶牛蛙皮膠原溶液和酶溶牛蛙皮膠原溶液用濃度為2M/L硫酸鈉分別鹽析，在溫度4°C以下，以IOOOOrpm離心12分鐘，沉淀用濃度為1M/L乙酸溶液復(fù)溶， 用濃度為2M/L硫酸鈉鹽析3次；得到的沉淀分別溶于濃度為1M/L乙酸中，以濃度為0. 5M/ L的乙酸溶液為透析液透析處理3天，凍干，得到海綿狀牛蛙皮膠原蛋白17. 36g，干重提取率為 83. 46% ；(4)以上步驟中除特殊說(shuō)明外，均在溫度15°C以下進(jìn)行。實(shí)施例4 (1)原料預(yù)處理將新鮮牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗凈，擠干，切碎；加入料液比為1 30，濃度為0. 1M/L NaOH溶液處理48h，維持勻速攪拌，中途換液3次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至8-12，加入料液比為1 20，體積濃度為3%的H2A溶液處理Mh，維持勻速攪拌， 中途換液3次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，用料液比為1 40，含30%異丙醇和20%丁醇的脫脂劑處理Mh，維持勻速攪拌，取出，沖洗，純水浸泡過(guò)夜，擠干，備用；(2)未變性天然膠原的提取將上述預(yù)處理所得的牛蛙皮70g(干重18. 2g)用濃度為0. 5M/L乙酸溶液浸提 36h，維持勻速攪拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用濃度為0. 5M/L乙酸溶液復(fù)提12h，得到酸溶牛蛙皮膠原溶液，向牛蛙皮沉渣中繼續(xù)加入濃度為0. 5M/L乙酸溶液，并加入濃度為Iwt %胃蛋白酶和2wt% 537酶浸提36h，維持勻速攪拌，得到酶溶牛蛙皮膠原溶液；(3)未變性天然膠原的純化將上述所得到的酸溶牛蛙皮膠原溶液和酶溶牛蛙皮膠原溶液用濃度為0. 7M/L硫酸鎂分別鹽析，在溫度4°C以下，以20000rpm離心10分鐘，沉淀用濃度為0. 5M/L乙酸溶液復(fù)溶，用濃度為0. 7M/L硫酸鎂鹽析2次；將得到的沉淀分別溶于濃度為0. 5M/L乙酸中， 以濃度為0. 1M/L的乙酸溶液為透析液透析處理2天，凍干，得到海綿狀牛蛙皮膠原蛋白 15. 45g，干重提取率為84. 87% ；(4)以上步驟中除特殊說(shuō)明外，均在溫度15°C以下進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)原料預(yù)處理將新鮮牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗凈，擠干，切碎；加入料液比為1 20-40，濃度為0. 05-0. 2M/LNa0H溶液處理Μ_4 ι，維持勻速攪拌，中途換液2_5次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)PH至8-12，加入料液比為1 5-30，體積濃度為-8%的H2O2溶液處理 12-48h，維持勻速攪拌，中途換液2-4次，將牛蛙皮取出，沖洗數(shù)次，調(diào)節(jié)pH至6. 0-6. 5，用料液比為1 10-50，體積濃度為30% -70%脫脂劑處理12-Mh，維持勻速攪拌，取出，沖洗， 純水浸泡過(guò)夜，擠干，備用；(2)未變性天然膠原的提取將上述預(yù)處理所得的牛蛙皮60-100重量份用濃度為0. 1-2M/L乙酸溶液浸提對(duì)-4他， 維持勻速攪拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用濃度為0. 1-2M/L乙酸溶液復(fù)提6-Mh，得到酸溶牛蛙皮膠原溶液，向牛蛙皮沉渣中繼續(xù)加入濃度為0. 1-2M/L乙酸溶液，并加入濃度為 Iwt% -5wt%蛋白酶浸提M-4 !，維持勻速攪拌，得到酶溶牛蛙皮膠原溶液；(3)未變性天然膠原的純化將上述所得到的酸溶牛蛙皮膠原溶液和酶溶牛蛙皮膠原溶液用濃度為0. 6-4M/L鹽分別鹽析，在溫度4°C以下，以5000-20000rpm離心10-15分鐘，沉淀用濃度為0. 1-2M/L乙酸溶液復(fù)溶，鹽析2-4次；將得到的沉淀分別溶于濃度為0. 1-2M/L乙酸中，以濃度為0. I-IM/ L的乙酸溶液為透析液透析處理2-3天，凍干，得到海綿狀牛蛙皮膠原；(4)以上步驟中除特殊說(shuō)明外，均在溫度15°C以下進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法，其特征在于脫脂劑為異丙醇、丁醇和丙酮中的至少一種。
3.如權(quán)利要求1所述從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法，其特征在于蛋白酶為胃蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌復(fù)合酶和537蛋白酶中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1所述從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法，其特征在于鹽為氯化鈉、硫酸銨、硫酸鈉或硫酸鎂中的任一種。
5.如權(quán)利要求1 4之一所述從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法制備得到的未變性天然膠原。
6.如權(quán)利要求5所述未變性天然膠原用于醫(yī)學(xué)、美容、化妝品、保健品和食品領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從牛蛙皮中提取未變性天然膠原的方法，其特點(diǎn)是處理階段用NaOH溶液、H2O2溶液和脫脂劑處理洗凈的牛蛙皮分別除去非膠原蛋白、色素和脂肪，提取階段以乙酸溶液和乙酸-蛋白酶分別浸提得到酸溶膠原和酶溶膠原，純化階段利用鹽多次鹽析，最后透析凍干得到海綿狀牛蛙皮膠原。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖表明牛蛙皮膠原含有分子量為30萬(wàn)、20萬(wàn)和10萬(wàn)的γ鏈、β鏈和α鏈，其中α鏈為兩條，很好地保留了膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)。提取過(guò)程中除特殊說(shuō)明外操作溫度均在15℃以下，得到的產(chǎn)品干重提取率不低于80％，色白，品質(zhì)優(yōu)良。
文檔編號(hào)C07K1/34GK102276716SQ201110225760
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者劉文濤, 李國(guó)英, 楊波 申請(qǐng)人:四川大學(xué)