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      苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒及其多克隆抗體的制備方法

      文檔序號:3584336閱讀:337來源:國知局
      專利名稱:苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒及其多克隆抗體的制備方法
      技術領域
      本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域,具體涉及苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒及其多克隆抗體的制備方法。
      背景技術
      癲癇是一種常見的神經系統(tǒng)疾病,也是我國神經系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥。目前,抗癲癇類藥物仍然是控制癲癇發(fā)作的主要手段。傳統(tǒng)的抗癲癇類藥物苯妥因治療窗窄、個體差異大、療效和毒性反應與血藥濃度密切相關,臨床醫(yī)生僅憑經驗給藥往往達不到有效血藥濃度。因此,苯妥因血藥濃度的監(jiān)測對癲癇的診斷和治療具有重要的臨床指導意義。目前,國內外測定苯妥因血藥濃度的方法主要是高效液相色譜(HPLC)、熒光偏振 免疫分析(FPIA)、微粒酶免法、免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等方法。采用HPLC法,需要樣本前處理,操作相對復雜、且檢測成本昂貴;ELISA檢測法靈敏度較高,但無法精確定量;熒光偏振免疫分析(FPIA)具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點,但試劑成本高,不適合常規(guī)治療藥物的檢測,阻礙個性化治療的推廣。因此開發(fā)一種操作簡便、周期短、成本低、靈敏度高的檢測方法成為亟待解決的問題。

      發(fā)明內容
      本發(fā)明的目的是提供一種高度特異性的苯妥因多克隆抗體及苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法。為了解決上述技術問題,本發(fā)明所采用的技術方案是提供苯妥因特異性多克隆抗體的制備方法,其特征在于,所述方法為步驟a 苯妥因衍生物的活化將特異的苯妥因衍生物置于容器中,并依次加入純二甲基酰胺、無水乙醇、IOmM pH為5. O的磷酸鉀緩沖液、I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺,攪拌溶解反應30分鐘;步驟b:抗原的偶聯(lián)和純化將牛血清白蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白溶解于IOmLO. 2M pH為8. 5的磷酸緩沖液中得到溶液A,將步驟a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中,在2 8°C條件下攪拌12-16小時,得到偶聯(lián)的苯妥因抗原,將得到的偶聯(lián)的苯妥因抗原進行透析純化,得到苯妥因免疫抗原;步驟c :采用步驟b得到的苯妥因免疫抗原免疫動物,得到苯妥因特異性多克隆抗體。優(yōu)選的所述步驟a為苯妥因衍生物的活化將20mg特異的苯妥因衍生物置于容器中,并依次加入700 μ L純二甲基酰胺、700 μ L無水乙醇、I. 4mL IOmM pH為5. O的磷酸鉀緩沖液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和IOmg N-羥基硫代琥珀酰亞胺,攪拌溶解反應30分鐘;步驟b :抗原的偶聯(lián)和純化將40mg牛血清白蛋白溶解于IOmLO. 2M pH8. 5的磷酸緩沖液中得到牛血清白蛋白溶液A,將步驟a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中,在2 8°C條件下攪拌12-16小時,將得到的偶聯(lián)的苯妥因抗原進行透析純化,得到苯妥因免疫抗原;優(yōu)選的,所述步驟c為用O. 2M的pH為8. 5的磷酸緩沖液將合成的所述步驟b中的本妥因免疫抗原稀釋至I. Omg/mL,然后用I. OmL的本妥因免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合,對家兔進行注射,2 3周后,再用I. OmL相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次,之后每隔28天注射一次,注射兩次后,獲得苯妥因特異性多克隆抗體。為了解決上述技術問題,本發(fā)明所采用的另一個技術方案是提供苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法,所述苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒上設置有Rl試劑、R2試劑、 定標液,所述苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟R1試劑的制備,R2試劑的制備,定標液的制備,所述Rl試劑的制備為步驟a:苯妥因衍生物的活化,將20mg特異的苯妥因衍生物置于容器中,并依次加入700yL 二甲基酰胺、700yL乙醇、1.4mL IOmM pH5. O的磷酸鉀緩沖液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和IOmg N-羥基硫代琥珀酰亞胺,攪拌溶解反應30分鐘;步驟b :抗原的偶聯(lián)和純化將40mg牛血清白蛋白溶解于IOmLO. 2M pH為8. 5的磷酸緩沖液中得到牛血清白蛋白溶液A,將步驟a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中,在2 8°C條件下攪拌12-16小時,將得到的偶聯(lián)的苯妥因抗原進行透析純化,得到苯妥因免疫抗原;步驟c :采用步驟b得到的苯妥因衍生物免疫抗原免疫動物,得到苯妥因特異性多克隆抗體;步驟d :在ILTris緩沖液中依次加入2. 02g脫氫輔酶I和O. 86g葡萄糖_6_磷酸,在室溫下攪拌10分鐘,所述Tris緩沖液pH為8. 0,所述Tris緩沖液中各組分濃度為55mMTris、質量體積百分比為O. I %的牛血清白蛋白、145. 4mMNaCl、3mMMgCl2,然后將步驟c中得到的苯妥因衍生物特異性多克隆抗體加入該溶液中,稀釋比例為I : 1000-1 6000,得到Rl試劑;所述R2試劑的制備為步驟a、將30mg葡糖糖六磷酸脫氫酶,溶解于24mL O. 05M的Tris緩沖液中,然后依次加入200-500mg還原型輔酶I、I. 0-2. OmL的卡必醇和2. 0-6. OmL的二甲基亞砜混勻;步驟b、將20mg的苯妥因衍生物溶解于840 μ L 二甲基亞砜和360 μ L純二甲基酰胺的混合溶液中,加入12 μ L三丁胺和6 μ L氯甲酸異丁酯,在2 8°C條件下攪拌30分鐘;步驟C、將步驟a和步驟b得到的兩種溶液混合,在2 8°C條件下攪拌過夜,得到偶聯(lián)的酶標抗原,再進行G-25凝膠層析柱純化得到葡萄糖六磷酸脫氫酶標記的苯妥因偶聯(lián)物;步驟d、將步驟c中的葡糖糖六磷酸脫氫酶苯妥因偶聯(lián)物酶標抗原稀釋于Tris緩沖液中,稀釋比例為I 400-1 3000,得到R2試劑;所述Tris緩沖液pH為8. 2,所述Tris緩沖液中各組分濃度為120mM Tris、質量體積百分比為O. 1%的牛血清白蛋白、145.4mMNaCl、3mM MgCl2 ;定標液的制備為將苯妥因校準品溶于空白血清中配制成。優(yōu)選的,所述Rl試劑的制備中的步驟c為用O. 2M的pH8. 5的磷酸緩沖液將合成的所述步驟b中的苯妥因免疫抗原稀釋至I. Omg/mL,然后用I. OmL的苯妥因免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合,對家兔進行注射,2 3周后,再用I. OmL相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次,之后每隔28天注射一次,注射兩次后,獲得苯妥因特異性多克隆抗體。優(yōu)選的,所述定標液的制備為將苯妥因校準品溶于空白血清中并配制成O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL 共 6 種系列濃度的定標液。
      本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的苯妥因特異性多克隆抗體的特異性強,效價高,在藥物交叉反應試驗中,對測試的32種常見藥物和化合物幾乎無任何交叉反應,適合臨床檢驗苯妥因的血藥濃度。本發(fā)明的苯妥因藥物濃度均相酶免疫檢驗試劑盒靈敏度高,能夠準確檢測10ng/mL的標本,苯妥因藥物濃度的有效檢測范為20ng/mL_40y g/mL。本發(fā)明試劑盒的準確率高,回收率在90%以上,簡便、快速、成本低、靈敏度高、可全自動化。


      下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
      作進一步詳細的說明圖I是苯巴比妥均相酶免疫測定的定標曲線。
      具體實施例方式本發(fā)明中的檢驗方法是一種均相酶免疫測定法,該檢驗的基本原理基于一種競爭反應,即液體樣本中游離的苯妥因與偶聯(lián)在葡萄糖六磷酸脫氫酶(Glucose-6-PhosphateDehydrogena se,G6PDH)上的苯妥因衍生物競爭結合特異性抗體的位點。G6TOH-苯妥因衍生物偶聯(lián)物是酶標半抗原,具有抗原和酶的活性,G6PDH-苯妥因衍生物偶聯(lián)物可以被抗體識別。G6PDH既能夠氧化磷酸葡萄糖脫氫,同時將氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD+)還原為NADH。這個過程導致吸光度的變化,可以在340nm波長光源下被檢測到??贵w與酶-苯妥因衍生物結合后,G6PDH的活性被抑制,液體樣本中的苯妥因競爭性的取代與抗體結合的苯妥因酶偶聯(lián)物,并使其從抗體的結合位點上釋放出來,從而使G6TOH恢復活性。因此,液體樣本中苯妥因的含量越多,游離的G6TOH-苯妥因衍生物偶聯(lián)物就越多,從而能得到更強的信號。本發(fā)明的要點是提供一種簡便、快速、靈敏度高和全自動化的苯妥因藥物濃度檢測試劑盒和制備方法。本發(fā)明的核心技術為均相酶免疫檢測方法,其中試劑和待測樣品均為液相,測定過程中不存在分離步驟,樣品與抗體反應后再加入標記的抗原進行反應。本發(fā)明的技術方案包括苯妥因免疫原的合成,抗苯妥因特異性抗體的制備,酶標偶聯(lián)物的制備以及樣本的測定。分別通過化學合成的方法制備出G6TOH-苯妥因偶聯(lián)物和BSA-苯妥因免疫原,并由BSA-苯妥因免疫原免疫動物,制備出特異性的抗苯妥因多克隆抗體。將制備好的抗體和酶標偶聯(lián)物配制成均相酶免疫試劑Rl和R2,在全自動生化分析儀上進行苯妥因樣本的測定。實施例一苯妥因特異性多克隆抗體的制備a、苯妥因免疫抗原的合成I)苯妥因衍生物的活化,稱取20mg特異的苯妥因衍生物于小燒杯中,并依次加入700 μ L 純二甲基酸胺(dimethylformamide, DMF)、700 μ L 無水乙醇、I. 4mL IOmM 的 pH 為5.0的磷酸鉀緩沖液、SOmgl-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和IOmgN-羥基硫代琥拍酰亞胺(N-hydroxysuccinimide, Sulfo-NHS),將這些化學品在室溫條件下攪拌溶解反應30min ;2)BSA溶液的制備,稱取40mg牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)并在 室溫條件下溶解于IOmL O. 2M的pH8. 5的磷酸緩沖液中;3)抗原的偶聯(lián)和純化,將活化的苯妥因衍生物滴加到BSA溶液中,在2 8°C條件下攪拌過夜,得到抗原;并將偶聯(lián)的抗原進行透析純化。b、采用常規(guī)方法制備抗體,大致步驟如下用磷酸緩沖液將合成的苯妥因免疫抗原稀釋至I. Omg/mL,然后用I. OmL的抗原溶液與弗氏完全佐劑混合,對家兔進行注射;2 3周后,再用I. OmL相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次,之后每隔四周一次,共兩次,獲得的抗體效價約為I : 30000。實施例二苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備,包括以下步驟苯妥因衍生物特異多克隆抗體的制備,葡萄糖六磷酸脫氫酶標記的苯妥因偶聯(lián)物的制備,定標液的制備,均相酶免疫試劑的制備和利用全自動生化分析儀進行樣本測試a、按實施例I的方法制備苯妥因特異性多克隆抗體。b、苯妥因酶標抗原的制備I)稱取30mg葡糖糖六磷酸脫氫酶,溶解于24mL,0. 05M Tris緩沖液中,然后依次加入200-500mg NADH、I. 0-2. OmL的卡必醇和2_6. OmL的二甲基亞砜混勻;2)將20mg的苯妥因衍生物溶解于840yL 二甲基亞砜和360yL DMF中,加入12 μ L 三丁胺(tributylamine)和 6μ L 氯甲酸異丁酯(isobutylchloroformate),在 2
      8O條件下攪拌30min ;3)將上述兩種溶液混合,在2 8°C條件下攪拌過夜,并將偶聯(lián)的酶標抗原進行G-25凝膠層析柱純化。C、定標液的制備將苯妥因校準品溶于空白血清中并配制成0、2. 5、5、10、20、40μ g/mL共6種系列濃度的定標液,定標液的工作體積為10-35 μ L。d、均相酶免疫試劑的制備I) Rl試劑的制備在ILTris 緩沖液(55mMTris,0. 1% BSA,145. 4mMNaCl, 3mMMgCl2, pH 為 8. 0)中依次加入2. 02gNAD (輔脫氫酶I)和0. 86gG6P(葡萄糖_6_磷酸),在室溫下攪拌lOmin。然后將實施例I中苯妥因衍生物特異多克隆抗體制備中得到的抗體加入溶液中,稀釋比例為I 1000-1 6000。2) R2試劑的制備在ILTris 緩沖液(120mMTris,O. 1% BSA, 145. 4mMNaCl,3mM MgCl2,pH8. 2)中加入G6TOH-苯妥因衍生物酶標抗原,稀釋比例為I : 400-1 3000。然后加入100-200 μ L試劑Rl和100-200 μ L試劑R2,采用兩點速率法,檢測主波長為340nm、副波長為405nm的吸光度變化率,建立并優(yōu)化苯妥因均相酶免疫定標曲線如圖I所述,定標曲線的建立和優(yōu)化在日立7180型全自動生化分析儀上完成。e、利用全自動生化分析儀進行樣本測試 I)血清標本的收集,按照常規(guī)方法收集血清標本;2)根據(jù)日立7180型全自動生化儀的操作說明,打開儀器,進行儀器光密度檢測和探針的清洗,檢測儀器是否運行正常;3)儀器檢測運行正常后,將試劑Rl、R2依次放入Rl、R2試劑倉,血清標本放入樣品盤 I (SI),將 O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL 的苯妥因定標液放入樣品盤2 (S2)的指定位置;4)儀器在Stand by狀態(tài)時,設定苯妥因的操作程序和檢測參數(shù),具體檢測參數(shù)如
      表一表一血清中苯妥因藥物濃度檢測參數(shù)
      檢測方法兩點速率法
      樣本量10-35 μι
      "TlO分鐘
      I. 5分鐘
      試劑 Rl100-200 μ
      試劑 R2100-200 uL__
      測光點21至31點 檢測波長(主/副)340/405 nm
      定標類型Logit-Log (4P)
      定標液IO pg/mL
      定標液22.5 pg/mL
      定標液35 pg/mL
      定標液410 pg/mL定標液 520 pg/mL
      定標液640 pg/mL5)按照設定的檢測參數(shù),首先進行定標實驗,建立苯妥因的定標曲線,然后根據(jù)建立的定標曲線,檢測血清標本中苯妥因的濃度。
      6)檢測血清標本中苯妥因的濃度,儀器將測得的吸光度變化率根據(jù)標準曲線換算成藥物濃度,并由終端顯示打印檢測報告。實施例三本妥因檢驗試劑盒廣品的檢驗實驗a、回收實驗利用建立的苯妥因定標曲線,測定低(2. 5μ g/mL)、中(10yg/mL))、高(40 μ g/mL)三種濃度的苯妥因血清標本,每個標本重復測定5次。表二 苯妥因試劑盒的回收實驗
      權利要求
      1.苯妥因特異性多克隆抗體的制備方法,其特征在于,所述方法為 步驟a 苯妥因衍生物的活化將特異的苯妥因衍生物置于容器中,并依次加入純二甲基酰胺、無水乙醇、IOmM pH為5. O的磷酸鉀緩沖液、I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺,攪拌溶解,反應30分鐘; 步驟b :抗原的偶聯(lián)和純化將牛血清白蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白溶解于IOmLO. 2M pH為8. 5的磷酸緩沖液中得到溶液A,將步驟a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中,在2 8°C條件下攪拌12-16小時,得到偶聯(lián)的苯妥因抗原,將得到的偶聯(lián)的苯妥因抗原進行透析純化,得到苯妥因免疫抗原; 步驟c :采用步驟b得到的苯妥因免疫抗原免疫動物,得到苯妥因特異性多克隆抗體。
      2.按權利要求I所述的抗苯妥因特異性多克隆抗體的制備方法,其特征在于,所述步驟a : 苯妥因衍生物的活化將20mg特異的苯妥因衍生物置于容器中,并依次加入700 μ L純二甲基酰胺、700 μ L無水乙醇、I. 4mL IOmM pH5. O的磷酸鉀緩沖液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和IOmg N-羥基硫代琥珀酰亞胺,攪拌溶解反應30分鐘; 步驟b :抗原的偶聯(lián)和純化將40mg牛血清白蛋白溶解于IOmL O. 2M pH8. 5的磷酸緩沖液中得到牛血清白蛋白溶液A,將步驟a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中,在2 8°C條件下攪拌12-16小時,將得到的偶聯(lián)的苯妥因抗原進行透析純化,得到苯妥因免疫抗原。
      3.按權利要求I所述的抗苯妥因特異性多克隆抗體的制備方法,其特征在于,所述步驟c為用O. 2M的pH為8. 5的磷酸緩沖液將合成的所述步驟b中的苯妥因免疫抗原稀釋至I. Omg/mL,然后用I. OmL的苯妥因免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合,對家兔進行注射,2 3周后,再用I. OmL相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次,之后每隔28天注射一次,注射兩次后,獲得苯妥因特異性多克隆抗體。
      4.苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法,其特征在于,所述苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒上設置有Rl試劑、R2試劑、定標液,所述苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟R1試劑的制備,R2試劑的制備,定標液的制備, 所述Rl試劑的制備為 步驟a:苯妥因衍生物的活化,將20mg特異的苯妥因衍生物置于容器中,并依次加入。700 μ L純二甲基酰胺、700 μ L無水乙醇、I. 4mL IOmM pH為5. O的磷酸鉀緩沖液、80mg I-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和IOmg N-羥基硫代琥珀酰亞胺,攪拌溶解反應30分鐘; 步驟b :抗原的偶聯(lián)和純化將40mg牛血清白蛋白溶解于IOmL O. 2M pH為8. 5的磷酸緩沖液中得到牛血清白蛋白溶液A,將步驟a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中,在2 8°C條件下攪拌12-16小時,將得到的偶聯(lián)的苯妥因抗原進行透析純化,得到苯妥因免疫抗原; 步驟c :采用步驟b得到的苯妥因衍生物免疫抗原免疫動物,得到苯妥因特異性多克隆抗體;步驟d :在ILTris緩沖液中依次加入2. 02g脫氫輔酶I和O. 86g葡萄糖_6_磷酸,在室溫下攪拌10分鐘,所述Tris緩沖液pH為8. O,所述Tris緩沖液中各組分濃度為55mMTris、質量體積百分比為O. 1%的牛血清白蛋白、145. 4mM NaCl、3mM MgCl2,然后將步驟c中苯妥因衍生物特異多克隆抗體的制備中得到的抗體加入該溶液中,稀釋比例為I 1000-1 6000,得到 Rl 試劑; 所述R2試劑的制備方法為 步驟a、將30mg葡糖糖六磷酸脫氫酶,溶解于24mL O. 05M的Tris緩沖液中,然后依次加入200-500mg還原型輔酶I、I. 0-2. OmL的卡必醇和2. 0-6. OmL的二甲基亞砜混勻; 步驟b、將20mg的苯妥因衍生物溶解于840 μ L 二甲基亞砜和360 μ L純二甲基酰胺的混合溶液中,加入12 μ L三丁胺和6 μ L氯甲酸異丁酯,在2 8°C條件下攪拌30分鐘; 步驟C、將步驟a和步驟b得到的兩種溶液混合,在2 8°C條件下攪拌過夜,得到偶聯(lián)的酶標抗原,再進行G-25凝膠層析柱純化得到葡萄糖六磷酸脫氫酶標記的苯妥因偶聯(lián)物; 步驟d、將步驟c中的葡糖糖六磷酸脫氫酶苯妥因偶聯(lián)物酶標抗原稀釋于Tris緩沖液中,稀釋比例為I 400-1 3000,得到R2試劑;所述Tris緩沖液pH為8. 2,所述Tris緩沖液中各組分濃度為120mM Tris、質量體積百分比為O. 1%的牛血清白蛋白、145.4mM NaCl,3mM MgCl2 ; 定標液的制備方法為將苯妥因校準品溶于空白血清中配制成一系列濃度的標準品。
      5.按權利要求4所述的苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法,其特征在于,所述Rl試劑的制備中的步驟c為用O. 2M的pH為8. 5的磷酸緩沖液將合成的所述步驟b中的本妥因免疫抗原稀釋至I. Omg/mL,然后用I. OmL的本妥因免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合,對家兔進行注射,2 3周后,再用I. OmL相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次,之后每隔28天注射一次,注射兩次后,獲得苯妥因特異性多克隆抗體。
      6.按權利要求3所述的苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法,其特征在于,所述定標液的制備為將苯妥因校準品溶于空白血清中并配制成O μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5 μ g/mL、·10 μ g/mL>20 μ g/mL>40 μ g/mL共6種系列濃度的定標液。
      全文摘要
      本發(fā)明的目的是提供一種高度特異性的苯妥因多克隆抗體及苯妥因均相酶免疫檢測試劑盒的制備方法,包括苯妥因特異性多克隆抗體的制備,葡萄糖六磷酸脫氫酶標記的苯妥因偶聯(lián)物的制備,定標液的制備。本發(fā)明的苯妥因多克隆抗體特異性強,效價高,在藥物交叉反應試驗中,對測試的32種常見藥物和化合物幾乎無任何交叉反應,適合臨床檢驗苯妥因的血藥濃度。本發(fā)明的苯妥因藥物濃度均相酶免疫檢驗試劑盒靈敏度高,能夠準確檢測10ng/mL的樣本,苯妥因藥物濃度的有效檢測范圍為20ng/mL-40μg/mL。本發(fā)明試劑盒的準確率高,回收率在90%以上,簡便、快速、成本低、靈敏度高、可全自動化。
      文檔編號C07K16/44GK102807618SQ20111022864
      公開日2012年12月5日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權日2011年8月10日
      發(fā)明者虞留明, 陳瑞東, 李冬, 王金文, 燕啟江 申請人:重慶金域醫(yī)學檢驗所有限公司
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