專利名稱：利拉魯肽變構(gòu)體及其綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利拉魯肽變構(gòu)體及其綴合物。
背景技術(shù)：
利拉魯肽是由丹麥諾和諾德公司研制的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)受體激動劑， 在分子結(jié)構(gòu)、生物活性、作用靶點及免疫原性等方面與GLP-I相似。利拉魯肽的分子結(jié)構(gòu)與 GLP-I (7-36)類似，不同之處在于利拉魯肽將GLP-I的第34位賴氨酸替換為精氨酸，并在第沈位增加了一個棕櫚酰脂肪酸側(cè)鏈。多肽類藥物普遍存在體內(nèi)半衰期較短，物理、化學穩(wěn)定性較差，易被體內(nèi)各種蛋白酶降解的特性。利拉魯肽作為一種皮下注射制劑，半衰期約12 14h，需每天一次使用，能起到良好的降低血糖作用，但給患者身體、心理和經(jīng)濟帶來較大的負擔，限制了患者用藥依從性。因此，對利拉魯肽進行結(jié)構(gòu)改造及開發(fā)新的劑型，從而延長其血漿周期和增加其系統(tǒng)性藥物暴露，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種利拉魯肽變構(gòu)體及其綴合物，延長了半衰期，可有效地降低血糖濃度。本發(fā)明首先提供一種利拉魯肽變構(gòu)體，其氨基酸序列為 Xl-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-
X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ -glutamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-Xll ；其中Χ1 為 His 或 Cys ；X2 為 Gly 或 Cys ；X3 為 Thr 或 Cys ；X4 為 Ser 或 Cys ；X5 為 Ser 或 Cys ；X6 為 Ser 或 Cys ；X7 為 Glu 或 Cys ；X8 為 Ala 或刪除；X9 為 Ala 或 Cys ；XlO 為 Leu 或 Cys 或 D-Ala ；Xll 為 Gly 或 Cys 或 Gly-Gly。采用上述技術(shù)方案，利拉魯肽變構(gòu)體保留了利拉魯肽的生物學活性，可有效地降低血糖，且延長了半衰期，為患者提供了更多的藥物選擇余地。作為本發(fā)明的進一步改進，所述利拉魯肽變構(gòu)體的氨基酸序列為=His-Ala-Glu-G Iy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ -
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 X5 為 Cys0作為本發(fā)明的進一步改進，所述利拉魯肽變構(gòu)體的氨基酸序列為=His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Pa lmitoyl-L-y-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 X8 刪除。作為本發(fā)明的進一步改進，所述利拉魯肽變構(gòu)體的氨基酸序列為=His-Ala-Glu-G Iy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(N-α-Palmitoyl-L- γ -
glutamyl))-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-D-Ala-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述 XlO 為 D_Ala。作為本發(fā)明的進一步改進，所述利拉魯肽變構(gòu)體的氨基酸序列為=His-Ala-Glu-G Iy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ -
glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly,所述 Xll 為 Gly-Gly。相應的，本發(fā)明還提供一種利拉魯肽變構(gòu)體的制備方法，包括如下步驟
A)2-CTC樹脂用DMF洗滌2 3次，用DMF溶脹30分鐘；
B)稱取N端Fmoc保護的氨基酸，加入有機堿DIEA，活化3飛分鐘，加入反應柱反應廣3 小時；
C)用體積比為1:4的哌啶和DMF混合液(DBLK)脫除Fmoc保護基20分鐘，用茚三酮方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除；
D)重復上述步驟A、B和C，按照所述利拉魯肽變構(gòu)體的氨基酸序列，逐個偶聯(lián)相應的氨基酸，其中，賴氨酸采用FmOC-Lys(AllOC)-0H，直到序列中最后一個氨基酸偶聯(lián)結(jié)束；
E)脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護基，偶聯(lián)上I^almitoyl-Glu-OtBu，得到的肽樹脂用DCM 洗3次，加入12eq苯基硅烷，反應5分鐘，加入0. 8eq Pd (PPh3) 4，反應60分鐘，用茚三酮檢測，樹脂有顏色，表明 Fmoc 已脫除；加入 kq Palmitamide-Glu-OtBu, 5eq H0At,5eq HATU, IOeq TMP，偶聯(lián)2小時，收縮，抽干得到利拉魯肽變構(gòu)體樹脂；
F)將得到的利拉魯肽變構(gòu)體樹脂用TFA裂解，反應廣3小時，將多肽從樹脂上裂解下來，同時脫除側(cè)鏈保護基；
G)對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到所需要的利拉魯肽變構(gòu)體；
H)用HPLC方法檢測其純度和含量，用二級質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。本發(fā)明還提供所述利拉魯肽變構(gòu)體在制備用于降低血糖的藥物中的用途。本發(fā)明還提供所述利拉魯肽變構(gòu)體在制備用于降低體重的藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，包含所述PEG修飾基團和所述利拉魯肽變構(gòu)體。采用上述技術(shù)方案，通過PEG修飾基團的修飾，提供的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，在保留利拉魯肽生物學活性的同時，大大延長了半衰期，不易被體內(nèi)的蛋白酶降解，提高了穩(wěn)定性，可以減少患者的用藥次數(shù)。作為本發(fā)明的進一步改進，所述PEG修飾基團的分子量在2 kDa 20 kDa之間。作為本發(fā)明的進一步改進，一個或者多個PEG修飾基團綴合到利拉魯肽變構(gòu)體上，所述PEG修飾基團可以相同，也可以不同。所述PEG修飾基團可以修飾的利拉魯肽變構(gòu)體位點包括
DCys的修飾PEG修飾基團可以通過Cys殘基綴合到利拉魯肽變構(gòu)體上，以硫醚的形式實現(xiàn)特異性修飾；
2)N端氨基的修飾采用的PEG修飾基團為mPEG-丙醛，mPEG-丙醛的一個重要特性就是在酸性條件(ρΗ=5. 0)下，與α -氨基的耦合具有很高的選擇性；3)側(cè)鏈羧基的修飾利拉魯肽變構(gòu)體含有谷氨酸、天冬氨酸，谷氨酸和天冬氨酸是很有活性的修飾位點。第一種方法是以mPEG-NH2為原料修飾谷氨酸或天冬氨酸側(cè)鏈，得到 Fmoc-Asp (mPE-NH) -OH或Fmoc-Glu (mPE-NH) -OH,再以這種氨基酸PEG修飾物為原料直接合成利拉魯肽PEG側(cè)鏈修飾物；第二種方法是選用烯丙酯保護的谷氨酸和天冬氨酸，肽鏈組裝完畢后直接脫除烯丙酯，再與mPEG-NH2偶聯(lián)，得到PEG修飾產(chǎn)物；
4)C端羧基的修飾采用的PEG修飾基團為PEG-NH2，用PEG-NH2在二環(huán)己基碳二亞胺或者1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽作用下與C端羧基偶聯(lián)，得到PEG 修飾產(chǎn)物；
5)組氨酸側(cè)鏈咪唑基的修飾。作為本發(fā)明的進一步改進，所述PEG修飾基團選自以下結(jié)構(gòu)
(CH3) 2CH- (OCH2CH2)n- , CH3 (CH2) m- (OCH2CH2) η-, R- (OCH2CH2) η- , Lys-PEG2， Glu-PEG2 ,Tris-PEG3，Biotin-PEG11。其中，m表示廣6之間的整數(shù)；η表示40 120之間的整數(shù)；R選自H、(0Γ030)烷基、環(huán)(C6 C30)烷基或苯基(C6 C30)烷基；
Lys-PEG2表示以賴氨酸為核的二分支型PEG ；Glu-PEG2表示以谷氨酸為核的二分支型 PEG ；TrIs-PEG3表示三分支型PEG ；Biotin-PEG11表示末端連接生物素的11個單元PEG。作為本發(fā)明的進一步改進，所述PEG修飾基團選自PEG或mPEG。相應的，本發(fā)明還提供一種制備所述利拉魯肽變構(gòu)體綴合物的方法，包括如下步驟
A)稱取一定量的所述利拉魯肽變構(gòu)體，溶于適當?shù)木彌_溶液中；
B)按一定的PEG修飾基團與利拉魯肽變構(gòu)體摩爾比，稱取PEG修飾基團，加入上述緩沖溶液中，適當搖勻使PEG修飾基團溶解并與利拉魯肽變構(gòu)體反應；
C)用過量的Cys溶液終止反應，RP-HPLC檢測反應并純化得到目標化合物。作為本發(fā)明的進一步改進，所述緩沖溶液選自醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、磷酸鈉鹽緩沖溶液、碳酸氫鈉、EDTA-NH4Ac緩沖溶液或EDTA-磷酸鈉鹽緩沖溶液。作為本發(fā)明的進一步改進，所述PEG修飾基團與所述利拉魯肽變構(gòu)體的摩爾比為 3飛；所述PEG修飾基團與所述利拉魯肽變構(gòu)體的反應時間為0. 5^12小時。本發(fā)明還提供所述利拉魯肽變構(gòu)體綴合物在制備用于降低血糖的藥物中的用途。本發(fā)明還提供所述利拉魯肽變構(gòu)體綴合物在制備用于降低體重的藥物中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的利拉魯肽變構(gòu)體保留了利拉魯肽的生物學活性，延長了半衰期，為患者提供了更多的藥物選擇余地；本發(fā)明在提供利拉魯肽變構(gòu)體的基礎(chǔ)上，通過PEG修飾基團的修飾，提供的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，在保留利拉魯肽生物學活性的同時，延長了半衰期，不易被體內(nèi)的蛋白酶降解，提高了穩(wěn)定性，可以減少患者的用藥次數(shù)；本發(fā)明提供的利拉魯肽變構(gòu)體及其綴合物的制備方法簡便，降血糖和降體重的效果好，為降低血糖藥物和降低體重藥物的制備提供了更多的選擇，延長了半衰期，提高了穩(wěn)定性，降低了生產(chǎn)成本，有利于患者負擔的減輕。


圖1為本發(fā)明利拉魯肽變構(gòu)體的固相合成工藝流程圖。圖2為本發(fā)明利拉魯肽與利拉魯肽變構(gòu)體5在體外對細胞內(nèi)cAMP活性的影響。
圖3為本發(fā)明利拉魯肽變構(gòu)體5及其綴合物在體外對細胞內(nèi)cAMP活性的影響。圖4為本發(fā)明利拉魯肽與利拉魯肽變構(gòu)體5降血糖作用實效試驗。圖5為本發(fā)明利拉魯肽與利拉魯肽變構(gòu)體5綴合物降血糖作用實效試驗。圖6為本發(fā)明利拉魯肽變構(gòu)體5及其綴合物對體重的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義列于下表中。
權(quán)利要求
1.一種利拉魯肽變構(gòu)體，其特征在于氨基酸序列為 Xl-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε -(N-α -Palmitoyl-L- γ-glu tamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-Xll ；其中X1 為 His 或 Cys ；X2 為 Gly 或 Cys ；X3 為 Ilir 或 Cys ；X4 為 Ser 或 Cys ；X5 為 Ser 或 Cys ；X6 為 Ser 或 Cys ；X7 為 Glu 或 Cys ；X8 為 Ala 或刪除；X9 為 Ala 或 Cys ；XlO 為 Leu 或 Cys 或 D-Ala ；Xll 為 Gly 或 Cys 或 Gly-Gly。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽變構(gòu)體，其特征在于氨基酸序列為=His-Ala-Glu -Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(Να -Palmitoyl-L- γ -glutamyl)) -Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 X5 為 Cys0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽變構(gòu)體，其特征在于氨基酸序列為 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Pa Imitoyl-L- γ -glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，所述 X8 刪除。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽變構(gòu)體，其特征在于氨基酸序列為 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N- ε - (Να -Palmitoyl-L- γ -glutamyl)) -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-D-Ala-Val-Arg-Gly-Arg-Gly,所述 XlO 為 D_Ala。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽變構(gòu)體，其特征在于氨基酸序列為=His-Ala-Glu -Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(Να -Palmitoyl-L-y-glutamyl))-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly, 所述 Xll 為 Gly-Gly。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的利拉魯肽變構(gòu)體的方法，其特征在于包括如下步驟A)2-CTC樹脂用DMF洗滌2 3次，用DMF溶脹30分鐘；B)稱取N端Fmoc保護的氨基酸，加入有機堿DIEA，活化3飛分鐘，加入反應柱反應廣3 小時；C)用體積比為1:4的哌啶和DMF混合液脫除Fmoc保護基20分鐘，用茚三酮法檢測 Fmoc是否脫除完全；D)重復上述步驟Α、Β和C，按照所述利拉魯肽變構(gòu)體的氨基酸序列，逐個偶聯(lián)相應的氨基酸，其中，賴氨酸采用FmOC-Lys(AllOC)-0H，直到序列中最后一個氨基酸偶聯(lián)結(jié)束；Ε)脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護基，偶聯(lián)上I^almitoyl-Glu-OtBu，得到利拉魯肽變構(gòu)體樹脂；F)將得到的利拉魯肽變構(gòu)體樹脂用TFA裂解，反應廣3小時，將多肽從樹脂上裂解下來，同時脫除側(cè)鏈保護基；G)對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到粗肽，然后用C8色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到所需要的利拉魯肽變構(gòu)體；H)用HPLC方法檢測其純度和含量，用二級質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的利拉魯肽變構(gòu)體在制備用于降低血糖的藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的利拉魯肽變構(gòu)體在制備用于降低體重的藥物中的用途。
9.一種利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，其特征在于包含PEG修飾基團和權(quán)利要求1至5中任一項所述的利拉魯肽變構(gòu)體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，其特征在于所述PEG修飾基團通過Cys、N端氨基、側(cè)鏈羧基、C端羧基或組氨酸側(cè)鏈咪唑基綴合到利拉魯肽變構(gòu)體上。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，其特征在于所述PEG修飾基團的分子量在2 kDa 20 kDa之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，其特征在于所述PEG修飾基團選自以下結(jié)構(gòu)=(CH3)2CH-(OCH2CH2)n- ,CH3 (CH2) m-( OCH2CH2) n- , R-(OCH2CH2)n-，Lys-PEG2，Glu-PEG2，Tris-PEG3，Biotin-PEG11 ；其中，m表示廣6之間的整數(shù)；η表示4(Γ120之間的整數(shù)；R選自H、(C1 C30)烷基、環(huán) (〇6飛30)烷基或苯基(06飛30)烷基；Lys-PEh表示以賴氨酸為核的二分支型PEG ；Glu-PEG2 表示以谷氨酸為核的二分支型PEG ；Tris-PEQ表示三分支型PEG ；Biotin-PEG11表示末端連接生物素的11個單元PEG。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物，其特征在于所述PEG修飾基團選自 PEG 或 mPEG。
14.一種制備權(quán)利要求9所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物的方法，其特征在于包括如下步驟A)稱取一定量的所述利拉魯肽變構(gòu)體，溶于適當?shù)木彌_溶液中；B)按一定的PEG修飾基團與利拉魯肽變構(gòu)體摩爾比，稱取PEG修飾基團，加入上述緩沖溶液中，適當搖勻使PEG修飾基團溶解并與利拉魯肽變構(gòu)體反應；C)用過量的Cys溶液終止反應，RP-HPLC檢測反應并純化得到目標化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物的方法，其特征在于所述緩沖溶液選自醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、磷酸鈉鹽緩沖溶液、碳酸氫鈉、EDTA-NH4Ac緩沖溶液或 EDTA-磷酸鈉鹽緩沖溶液。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物的方法，其特征在于所述PEG修飾基團與所述利拉魯肽變構(gòu)體的摩爾比為3飛；所述PEG修飾基團與所述利拉魯肽變構(gòu)體的反應時間為0. 5 12小時。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物在制備用于降低血糖的藥物中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利拉魯肽變構(gòu)體綴合物在制備用于降低體重的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利拉魯肽變構(gòu)體及其制備方法，利拉魯肽變構(gòu)體的氨基酸序列為X1-Ala-Glu-X2-Thr-Phe-X3-X4-Asp-Val-X5-X6-Tyr-Leu-X7-Gly-Gln-Ala-X8-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-X9-Trp-X10-Val-Arg-Gly-Arg-X11；其中X1為His或Cys；X2為Gly或Cys；X3為Thr或Cys；X4為Ser或Cys；X5為Ser或Cys；X6為Ser或Cys；X7為Glu或Cys；X8為Ala或刪除；X9為Ala或Cys；X10為Leu或Cys或D-Ala；X11為Gly或Cys或Gly-Gly。本發(fā)明還提供一種利拉魯肽變構(gòu)體綴合物及其制備方法。本發(fā)明提供的利拉魯肽變構(gòu)體及其綴合物保留了利拉魯肽的生物學活性，延長了半衰期，有利于患者負擔的減輕。
文檔編號C07K1/06GK102321170SQ20111027134
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者劉建, 潘俊鋒, 袁建成, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司