專利名稱：利用具有中和VEGFA生物學(xué)活性的McAb應(yīng)用于腫瘤的靶向治療的制作方法
利用具有中和VEGFA生物學(xué)活性的McAb應(yīng)用于腫瘤的靶向治療技術(shù)領(lǐng)域
該發(fā)明屬生物技術(shù)及生物制藥領(lǐng)域。利用具有中和VEGFA生物學(xué)活性的單克隆抗體(McAb)應(yīng)用于腫瘤的靶向治療，以期達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的新生血管生成，從而使腫瘤組織因“饑餓”而死亡。達(dá)到靶向治療各種實體腫瘤的目的，為腫瘤的治療提供一種新的途徑和藥物。
背景技術(shù)：
目前，研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤血管生成有關(guān)的因子有30余種。其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)也稱為血管通透性因子(vascular permeability factor, VPF)及其受體(vascular endothelial growth factor reccptor, VEGFR)能特異地促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖及遷移，在腫瘤新生血管生成過程中起著至關(guān)重要的作用。VEGF-A是一種在癌變過程中起重要作用的調(diào)控因子，因此VEGF-A可以作為癌癥等相關(guān)疾病監(jiān)控的重要指標(biāo)，也是治療癌癥的重要靶點。腫瘤細(xì)胞的生存取決于血管提供營養(yǎng)物質(zhì)，腫瘤的生長依賴于新血管的形成，因此，理論上，抗血管生成抑制劑會“餓死”腫瘤細(xì)胞，從而阻止腫瘤的生長。無論何種組織來源的腫瘤，還是特定的癌基因或抑癌基因的表達(dá)，或轉(zhuǎn)移的程度，這個結(jié)論均適用。也就是說，抑制腫瘤新生血管形成可廣譜地治療各種類型的腫瘤。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了抗人VEGF-A單克隆抗體，該抗體能夠中和VEGF-A生物學(xué)活性，可 用于抑制新生血管、尤其是腫瘤新生血管的形成。所述單克隆抗體由保藏號為 CCTCC-C201168的雜交瘤細(xì)胞株VEGFA1E6(已于2011年8月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC-C201168)特異穩(wěn)定分泌產(chǎn)生。
體外實驗結(jié)果顯示，該單克隆抗體能抑制VEGF-A誘導(dǎo)HUVEV (人臍靜脈細(xì)胞株) VEGFR2的磷酸化，抑制HUVEV細(xì)胞的生長與增殖、促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的凋亡。
體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，用該單克隆抗體注射荷瘤小鼠，與對照(僅注射正常小鼠 IgG)相比，注射該單克隆抗體的荷瘤小鼠的生存期明顯延長(彡3月，P <0. 05)、瘤體縮小明顯(較對照組平均縮小50%以上)或消失。
體內(nèi)體外的實驗結(jié)果均表明，所述單克隆抗體可用于抑制腫瘤新生血管的形成， 抑制腫瘤的生長，減小腫瘤大小，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
因此，一方面，本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體用于抑制腫瘤新生血管形成中的用途。
另一方面，本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體用于治療腫瘤，尤其是惡性腫瘤中的用途。
再另一方面，本發(fā)明提供了所述單克隆抗體在制備用于抑制腫瘤新生血管形成的藥物中的用途。
再另一方面，本發(fā)明提供了所述單克隆抗體在制備用于治療腫瘤、尤其是惡性腫瘤的藥物中的用途。
在其他方面，本發(fā)明提供了包含所述單克隆抗體的藥物組合物，該藥物組合物可用于抑制腫瘤新生血管形成，從而治療腫瘤、尤其是惡性腫瘤。所述藥物組合物可以是注射劑的形式。所述腫瘤優(yōu)選為乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和肺癌。
此外，本發(fā)明還提供了特異穩(wěn)定分泌所述單克隆抗體的保藏號為CCTCC-C201168 的雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明篩選出了一株特異性強，穩(wěn)定高效分泌具有抗VEGF-A生物學(xué)活性的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單克隆抗體具有抑制VEGF-A生物學(xué)活性，應(yīng)用于腫瘤病人的治療，為腫瘤的治療提供一種新的手段和方法。
本發(fā)明采取了以下主要解決的關(guān)鍵技術(shù)
將本發(fā)明已成功建立的一株特異性強，穩(wěn)定高效分泌具有抗VEGF-A生物學(xué)活性的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)基因工程改造技術(shù)，制備出重組的人源化具有抑制VEGF-A生物學(xué)活性的抗體，應(yīng)用于腫瘤病人的治療，為腫瘤的治療提供一種新的手段和方法。
技術(shù)路線
1.用基因重組的VEGF-A表達(dá)蛋白，免疫BALB/C小鼠；
2.經(jīng)PEG 4000將免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；
3.反復(fù)進(jìn)行ELISA及WB進(jìn)行篩選，建立特異穩(wěn)定表達(dá)抗VEGF-A的雜交瘤細(xì)胞株；
4.大量擴增，接種小鼠腹腔，制備腹水；
5.收集腹水，進(jìn)行ELISA效價檢測、WB檢測、增殖抑制試驗及抑制VEGF-A誘導(dǎo) HUVEC細(xì)胞VEGFR2磷酸化的生物學(xué)活性檢測等。
利用以上技術(shù)路線1-5，本發(fā)明申請人篩選出了特異穩(wěn)定分泌小鼠抗人VEGF-A抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號為CCTCC-C201168。通過體外和體內(nèi)測試，證實了所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體可抑制新生血管的形成，從而可用于治療各種腫瘤，尤其是惡性腫瘤。
6.擬以穩(wěn)定表達(dá)具有抗VEGF-A生物學(xué)活性的雜交瘤細(xì)胞mRNA為模板，小鼠IgV 區(qū)簡并引物擴增VH及VL。再經(jīng)重疊PCR技術(shù)構(gòu)建VH-1inker-VL目的片段，最終構(gòu)建成大腸桿菌BL21/pETa (32+) -VH-1inker-VL基因工程表達(dá)菌；經(jīng)常規(guī)發(fā)酵擴增、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、 破碎、純化后進(jìn)行藥物的體內(nèi)外活性及藥代學(xué)檢測。
進(jìn)行中試表達(dá)純化，建立一套可行的生產(chǎn)工藝及規(guī)程；
申報藥物的1、I1、III期臨床試驗批文，最終獲得國家新藥生產(chǎn)證書；進(jìn)行產(chǎn)品宣傳并推向市場，應(yīng)用于臨床治療，為人類健康作出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。


圖1是對抗人VEGF-A單克隆抗體的特異性鑒定。
圖2是抗人VEGF-A單克隆抗體(McAb)對HUVEC生長的抑制曲線。橫坐標(biāo)是抗體稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)是抑制率。
圖3顯示了抗人VEGF-A單克隆抗體(McAb)對HUVEC細(xì)胞VEGFR2磷酸化的抑制。
圖4顯示了抗VEGF-A單克隆抗體治療組與非治療組瘤體的大小對比。圖中所顯示的瘤體大小是治療組和非治療組分別的平均值。
圖5顯示了抗VEGF-A單克隆抗體治療組與非治療組的生存期比較結(jié)果。圖中所示的生存期是治療組和非治療組分別的平均值。兩者相比，P < O. 05，具有統(tǒng)計學(xué)顯著差巳
具體實施例方式
本發(fā)明由以下實施例來例證，但應(yīng)當(dāng)注意的是，以下實施例僅用于例證和解釋本發(fā)明，而不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
實施例1制備特異性針對VEGF-A的雜交瘤細(xì)胞株
以重組的人VEGF-A為免疫原。根據(jù)常規(guī)方法經(jīng)皮下多點免疫BALB/C小鼠，適時與SP2/0進(jìn)行經(jīng)PEG 4000進(jìn)行融合。按單克隆抗體制備常規(guī)進(jìn)行篩選及亞克隆，獲得能高效、穩(wěn)定分泌特異性抗人VEGF-A的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC-C201168。
將該雜交瘤細(xì)胞經(jīng)擴增后接種于已預(yù)先用液體石蠟致敏7天的BALB/C小鼠腹腔， 約10 14天收集小鼠腹水用于后續(xù)試驗研究。
腹水經(jīng)硫酸銨鹽析純化及Protein G-Sepharose 4B親和層析純化后(以后簡稱純化抗體)檢測ELISA效價> 409600。
用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人成骨細(xì)胞(Hobf)、髓樣白血病細(xì)胞(K562)的細(xì)胞裂解物及重組人VEGF-A為抗原進(jìn)行western-blot鑒定。結(jié)果細(xì)胞裂解物均在約40kd 處出現(xiàn)一明顯條帶，重組人VEGF-A在約20kd處出現(xiàn)一明顯條帶(結(jié)果見圖1)。這些結(jié)果顯示，所述雜交瘤分泌的抗體對VEGF-A具有特異性。
實施例2抗人VEGF-A單克隆抗體對HUVEC生長抑制試驗
常規(guī)收集處于對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，用HUVEC專用培養(yǎng)基(含10ng/mlVEGFA、 10% FSA的DMEM培養(yǎng)基)稀釋調(diào)細(xì)胞濃度為5X IO4個/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 ΙΟΟμΙ。37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)過夜。
次日，細(xì)胞已貼壁，換“DMEM培養(yǎng)基”過夜。
棄上清，分別加入已37°C孵育30分鐘后的100ng/ml的VEGF-A 100 μ I和不同稀釋度(0、1 IOOU 400,1 1600,1 6400,1 25600)的抗人 VEGF-A 單克隆抗體(上述實施例1所述的“純化抗體”，VEGF-AMcAb) 100 μ I。每一濃度3復(fù)孔。
分別于培養(yǎng)結(jié)束前4小時，加入5mg/ml MTT 10 μ I至培養(yǎng)結(jié)束。
1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清。加入DMSO 100 μ I/孔，輕輕振蕩至結(jié)晶完全溶解。
酶標(biāo)儀測定0D570值。
將每一濃度3復(fù)孔均值分別代入下式，分別計算出抑制率。
抑制率(0/0) ( _實驗組O腦-對廳麵O_) Χ100%對照組OD570
分別用各時間點的各濃度為橫坐標(biāo)，抑制百分率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線。結(jié)果見圖2。
如圖2所示，本發(fā)明的抗人VEGF-A單克隆抗體能抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的生長、增殖。
實施例3抗人VEGF-A單克隆抗體對HUVEC細(xì)胞VEGFR2磷酸化的抑制試驗
常規(guī)用O. 25%胰酶消化收集處于對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，用HUVEC專用培養(yǎng)基 (含10ng/mlVEGFA、10% FSA的DMEM培養(yǎng)基)稀釋調(diào)細(xì)胞濃度為5X IO5個/ml，接種于 Φ9αιι細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿1ml，共五皿。同時補充專用培養(yǎng)基9ml/皿。
37°C>5% CO2飽和濕度培養(yǎng)過夜。
次日，細(xì)胞已貼壁，換“DMEM培養(yǎng)基”過夜，IOml/皿。
棄上清，其中一皿為對照，不作處理。另四皿分別加入已37°C孵育30分鐘后的 50ng/ml 的 VEGF-A 100 μ I 和不同稀釋度(O、I 200、I 800、I 1600)的 VEGF-AMcAb IOml。
37 °C孵育2分鐘。
分別棄上清，每皿加入SDS-PAGE樣品緩沖液250 μ 1，用細(xì)胞刮分別收集細(xì)胞裂解液。
超聲波破碎儀破碎，工作5秒、停5秒、重復(fù)10次。煮沸5分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘 ， 離心沉淀，收集上清備用。
常規(guī)電泳及轉(zhuǎn)印后分別用兔抗VEGFR2和兔抗磷酸化-VEGFR2進(jìn)行雜交，ECL顯影、 沖印膠片。結(jié)果如圖3所示
如圖3所示，本發(fā)明的抗人VEGF-A單克隆抗體能夠抑制VEGF-A對人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) VEGFR2的磷酸化。
實施例4人VEGF-A單克隆抗體對荷瘤小鼠的治療試驗
常規(guī)用O. 25%胰酶消化收集處于對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞)，用生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度為5Χ IO7個/ml，接種于裸鼠腋下，每只O. 2ml，共二十只。同時注射雌激素(O. 15mg/ml) O. 2ml,每天一次。
約20天后，所有裸鼠腋下均長出約綠豆大小瘤體，隨機分為兩組，每組十只。
分別尾靜脈注射正常BALB/C IgG O.1ml和純化的抗VEGF-A單克隆抗體O.1ml (含 100 μ g MoAb)，同時肌肉注射雌激素O. 2ml/只。
觀察記錄裸鼠生存狀況和瘤體大小。
根據(jù)各組瘤體大小及生存期均值分別制作瘤體大小柱形圖(結(jié)果見圖4)和生存柱形圖(結(jié)果見圖5)。
如圖4所示，通過使用本發(fā)明的抗VEGF-A單克隆抗體治療，荷瘤小鼠的瘤體大小逐漸減少甚至直至消失，而對照組的瘤體大小則逐漸增加。而圖5則證實了通過使用本發(fā)明的抗VEGF-A單克隆抗體治療，顯著地增加了荷瘤小鼠的生存期。
權(quán)利要求
1.抗人VEGF-A單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏號為CCTCC-C201168的雜交瘤細(xì)胞株特異穩(wěn)定分泌產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體,其中所述抗體能夠中和VEGF-A生物學(xué)活性，用于抑制腫瘤新生血管的形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備用于抑制腫瘤新生血管形成的藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備用于靶向治療腫瘤藥物中的用途。
5.保藏號為CCTCC-C201168的雜交瘤細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明為利用具有中和VEGFA生物學(xué)活性的McAb應(yīng)用于腫瘤的靶向治療,提供了抗人VEGF-A單克隆抗體，該抗體能夠中和VEGF-A生物學(xué)活性，可用于抑制新生血管、尤其是腫瘤新生血管的形成。所述單克隆抗體由保藏號為CCTCC-C201168的雜交瘤細(xì)胞株特異穩(wěn)定分泌。
文檔編號C07K16/22GK103012588SQ20111028671
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者周俊, 何進(jìn)軍, 羅純 申請人:武漢吉天朋生物科技發(fā)展有限公司