專利名稱：一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)抑制物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品和藥品技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種星蟲血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE)抑制物。
背景技術(shù)：
星蟲(Phascolosoma esculenta, Sipunculus nudus)，俗稱海蛆、沙蟲、土筍等，為我國土著種，分布于長江口以南的沿海地區(qū)，棲息于潮間帶、高潮區(qū)的泥灘內(nèi)，營底棲穴居生活。它不僅肉質(zhì)脆嫩、味道鮮美，并具有較高的藥用、食療價值，能夠調(diào)節(jié)機體多種功能。 我國藥典記載其食用和藥用價值，其性涼味寒，歸肺，腎經(jīng)，具滋陰降火，有治牙齦腫痛，清肺熱，祛痰咳之功效，民間用作“冬蟲夏草”代用品，主治陰虛盜汗，骨蒸潮熱，肺癆咳嗽等癥；此外，星蟲還含有較多的?；撬?、精氨酸，?；撬釋θ梭w有恢復(fù)疲勞，治療病毒性肝炎， 降低血中膽固醇等作用，精氨酸是鳥氨酸循環(huán)中的一個成員，對高氨血癥，肝臟機能障礙等疾病頗有效果，且具有免疫調(diào)節(jié)等功效。星蟲營養(yǎng)豐富，含有大量人體必須的營養(yǎng)要素。我們前期的研究表明，星蟲干物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為76. 53 %，脂肪含量2.03%，總糖含量8.33%，灰分含量11. 19 %?？梢姡窍x是一個高蛋白低脂肪的優(yōu)質(zhì)蛋白。利用氨基酸自動分析儀，得星蟲中18種氨基酸的總和為61%，包含全部人體必需氨基酸，占總氨基酸的31. 37%，精氨酸占總氨基酸的10%。近年來，隨著人們生活水平的提高，自身保健意識逐漸增強，人們對星蟲的需求量逐漸增大，對于星蟲的研究逐漸深入。有較大部分文獻集中于探討星蟲的成分分析，闡述星蟲高營養(yǎng)價值的理論依據(jù)。關(guān)于星蟲的研究在營養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上有了更多的進展，其營養(yǎng)成分在耐缺氧、抗疲勞、抗氧化、抗組織缺血和抗自由基方面的功能已經(jīng)得到了相應(yīng)的研究。黃哲元對星蟲的制成品一一土蒜凍進行了藥學研究，在對小鼠服用土蒜凍水提液和生理鹽水藥理指標進行比較后發(fā)現(xiàn)，在抗疲勞、耐缺氧、耐高溫三方面，服用土蒜凍水提液的小鼠表現(xiàn)了更好的抗疲勞、耐缺氧和耐高溫能力。周迎松、嚴小軍等進行了可口革囊星蟲多肽在運動中抗自由基作用的實驗研究，實驗提取得到星蟲蛋白質(zhì)后采用蛋白酶水解得到小肽，經(jīng)純化后經(jīng)冷凍干燥得到星蟲肽，以大鼠為研究對象進行運動訓練。結(jié)果表明星蟲肽有抗組織缺血、抗氧化等功效，是一種有效的運動抗氧化劑。根據(jù)資料，廖供山、雷丹青等人經(jīng)過星蟲體腔和內(nèi)臟蛋白的提取，通過陽離子交換樹脂分離出纖溶酶，通過SDS-PAGE測定了其純度和分子量，等電聚焦法測定其等電點，以尿激酶為對照，驗證了純化的纖溶酶的酶解能力及穩(wěn)定性(CN102002488A)；閆小軍，周迎松，陳海敏等人應(yīng)用酶解法制備出了星蟲多肽，通過離子交換樹脂、濃縮蒸發(fā)、冷凍干燥等步驟獲得了星蟲多肽，并驗證了其在抗氧化、增強運動能力及防止運動造成的氧化損傷等方面的活性(CN 101210261A)；蘇秀榕，孫蓓等人利用星蟲體壁為原料，通過酶提和酸提得到白色或淡黃色粉末的膠原蛋白，并驗證了其pi、分子量、氨基酸組成及結(jié)構(gòu)等方面的特征，分析膠原蛋白普遍特性，適合于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域(CN 101381411A)；沈先榮， 賈福星，蔣定文等人利用鹽溶液抽提、有機溶劑沉淀、超濾、冷凍干燥后得到星蟲活性物質(zhì)粉末，主要有活性蛋白質(zhì)、?；撬?、精氨酸和微量元素鋅等，并驗證了其在提高免疫力、抗疲勞和延緩衰老等方面的活性(CN 1430975A)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)是一種含鋅二肽羧基肽酶，相對分子質(zhì)量為 150，000-200, OOODa,它有2個Si2+結(jié)合位點，是催化反應(yīng)的活性基團位置。人體內(nèi)存在如下的血壓調(diào)劑機制升壓系統(tǒng)——腎素血管緊張素系統(tǒng)和降壓系統(tǒng)——激肽-激肽酶系統(tǒng)。 兩系統(tǒng)是一對相互拮抗的血壓調(diào)節(jié)體系，其平衡協(xié)調(diào)對維持正常血壓十分重要。在這個體系中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是ACE。腎素在一定條件下生成十肽的血管緊張素I，血管緊張素I無生理活性，其在ACE作用下，生成八肽的血管緊張素II。后者是一種強有力的血管收縮物質(zhì)，可導致血壓升高。同時，ACE也能作用于激肽-激肽酶系統(tǒng)中的降血壓物質(zhì)緩激肽，使其失活，使激肽-激肽酶系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，從而使血壓升高。ACE抑制物質(zhì)能夠與ACE活性部位的Si2+競爭性結(jié)合，導致ACE的活性受到抑制，阻止ACE水解血管緊張素I轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素II，減少血管緊張素II的生成；同時，阻止催化水解激肽，減緩激肽的破壞，從而發(fā)揮降低血壓的作用。到目前為止，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于利用星蟲制備ACE抑制物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人致力于開發(fā)新的星蟲活性物質(zhì)，充分有效利用星蟲。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，在利用常規(guī)方法提取星蟲蛋白質(zhì)后，再對蛋白質(zhì)進一步水解后得到的產(chǎn)物對于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)具有明顯的抑制活性，因而可以用于制備降血壓藥物。基于此，本發(fā)明的第一個目的，在于提供一種星蟲多肽，所述星蟲多肽是通過將提取的星蟲蛋白質(zhì)進一步水解得到的多肽片段。根據(jù)本發(fā)明，所述星蟲蛋白質(zhì)包括水溶性蛋白質(zhì)、水不溶性蛋白質(zhì)以及它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對星蟲蛋白質(zhì)進行水解所采用的方法包括蛋白酶水解、酸水解和堿水解，其中以蛋白酶水解為最佳。根據(jù)一個優(yōu)選實施例，所述多肽片段的分子量優(yōu)選的是< lOKDa，更優(yōu)選的是 < 3KDa。本發(fā)明的第二個目的，在于提供一種星蟲多肽的制備方法，包括以下步驟A、提取星蟲蛋白質(zhì)；B、對提取的星蟲蛋白質(zhì)進一步水解，獲得星蟲多肽。根據(jù)本發(fā)明，步驟B中所述的水解包括采用蛋白酶水解、酸水解和堿水解，其中以蛋白酶水解為最佳。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。本發(fā)明的第三個目的，在于提供所述星蟲多肽用于制備降血壓藥物的用途。本發(fā)明通過對星蟲蛋白進一步水解，發(fā)現(xiàn)了星蟲蛋白的新用途，可以用于抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)，因而可以用于制備降血壓藥物，為有效利用星蟲開辟了一條新途徑。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的降血壓多肽的制備方法作進一步詳細說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于實施本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中，ACE抑制活性的測定原理及方法步驟如下星蟲蛋白水解物(多肽)的ACE抑制活性測定采用體外模擬測定，體外ACE抑制率測試原理為底物馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)在酶ACE的催化作用下，可以生成馬尿酸 (Hip)和二肽，通過液相的方法測定馬尿酸的含量，進而可以間接測定ACE酶的酶活；而ACE 抑制劑的存在，可以抑制ACE酶的活性，致使Hip的生成減少，從而間接反應(yīng)了 ACE抑制肽的活性。測試方法步驟如下選取EP管作為反應(yīng)器，編號0、1、2、3等，0號管加入25 μ L 20mM的pH8. 3的硼酸緩沖液最為對照，1、2、3等管加入20 μ L的ACE抑制劑，同時各管內(nèi)加入5(^1^的底物!11^，371溫浴51^11，然后加入10 μ L的ACE啟動反應(yīng)，在37°C水浴中反應(yīng) 40min，反應(yīng)結(jié)束后，加入IOOyL IM HCl終止反應(yīng)。反應(yīng)液進行高速離心，過4. 5 μ m的濾頭，然后進行高效液相色譜(HPLC)測定。HPLC條件是15%乙腈85%水(0. 1 % TFA)，檢測波長228nm,柱溫30 °C，上樣量10 μ L ；ACE抑制率⑴按下式計算X = (Α 對照-Al) /A 對照 X 100 %式中X——ACE抑制率(％ )；A對照——對照組生成Hip的峰面積；Al——實驗組生成Hip的峰面積。實施例1、星蟲多肽的制備1.1、星蟲蛋白的提取根據(jù)常規(guī)蛋白質(zhì)提取方法，采用低濃度NaCl溶液提取星蟲蛋白質(zhì)，具體如下取新鮮采集的星蟲進行清洗，解剖，除去內(nèi)臟和少量可見脂肪(不立即使用的，可于-20°C冷凍保藏)，然后用95%乙醇浸泡3h，同時不停攪拌，以充分脫脂；隨后用去離子水沖洗經(jīng)脫脂的星蟲，以洗去乙醇。然后將樣品與的NaCl溶液按照1 20的比例混合打漿，進行組織破碎，然后再超聲25min做進一步的細胞破碎，使星蟲體內(nèi)的蛋白充分溶進低鹽水溶液中，提取溫度控制在50°C，在不斷攪拌下提取4h。過程中每隔30min，利用 Brandford法測定上清液中蛋白質(zhì)的含量。反應(yīng)結(jié)束后，提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過離心后得到蛋白質(zhì)原液上清液(水溶性蛋白)和蛋白質(zhì)沉淀(水不溶性蛋白)。1.2、星蟲水溶性蛋白的酶解取1. 1的方法獲得的星蟲水溶性蛋白上清液，采用蛋白水解酶(表1)進行水解， 得到相應(yīng)的多肽，具體如下先將200mL星蟲蛋白質(zhì)提取液調(diào)至恒溫，溫度和pH調(diào)整至各種酶的最佳范圍，然后加入0.2% (w/v)的蛋白酶進行水解，利用恒速攪拌器輕輕攪拌；水解4h后反應(yīng)結(jié)束，然后將水解體系在沸水浴中保持IOmin進行蛋白酶滅火，回調(diào)pH至中性，然后冷卻、離心、過濾，去除變性的沉淀物。蛋白酶水解液進行超濾，濃縮，干燥，獲得星蟲多肽。表1、蛋白水解酶水解
權(quán)利要求
1.一種星蟲多肽，其特征在于，所述星蟲多肽是通過將提取的星蟲蛋白質(zhì)進一步水解得到的多肽片段。
2.如權(quán)利要求1所述的星蟲多肽，其特征在于，所述星蟲蛋白質(zhì)包括水溶性蛋白質(zhì)、水不溶性蛋白質(zhì)以及它們的混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的星蟲多肽，其特征在于，所述水解的方法包括蛋白酶水解、酸水解和堿水解。
4.如權(quán)利要求3所述的星蟲多肽，其特征在于，所述水解的方法為蛋白酶水解。
5.如權(quán)利要求1所述的星蟲多肽，其特征在于，所述多肽片段的分子量<lOKDa。
6.如權(quán)利要求1所述的星蟲多肽，其特征在于，所述多肽片段的分子量<3KDa。
7.—種星蟲多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、提取星蟲蛋白質(zhì)；B、對提取的星蟲蛋白質(zhì)進一步水解，獲得星蟲多肽。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟B中所述的水解包括采用蛋白酶水解、 酸水解和堿水解。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述水解為蛋白酶水解。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。
11.權(quán)利要求1-6中任一項所述的星蟲多肽用于制備降血壓藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種星蟲多肽，所述星蟲多肽是通過將提取的星蟲蛋白質(zhì)進一步水解得到的多肽片段，包括水溶性蛋白質(zhì)、水不溶性蛋白質(zhì)以及它們的混合物，所述水解的方法包括蛋白酶水解、酸水解和堿水解。可以用于抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)，因而可以用于制備降血壓藥物，為有效利用星蟲開辟了一條新途徑。
文檔編號C07K1/12GK102336806SQ20111028878
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者吳燕玲, 方明, 杜磊, 謝靜莉, 魏東芝 申請人:華東理工大學