專利名稱：三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因及其編碼蛋白和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子 PtALF-4基因及其編碼蛋白和應用。
背景技術(shù)：
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類，由于其營養(yǎng)價值豐富、生長迅速等優(yōu)點，已成為我國重要海水養(yǎng)殖品種。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大以及集約化程度不斷提高，由細菌、真菌等引起的多種疾病在三疣梭子蟹養(yǎng)殖群體中頻頻爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約了三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。由于對三疣梭子蟹的免疫系統(tǒng)缺乏深入了解，目前蟹病的防治仍主要采用傳統(tǒng)抗生素藥物防治，但長期盲目濫用藥物，造成抗藥性問題日益嚴重，非但難以有效地控制病情，反而帶來資金的浪費，蟹品質(zhì)的下降，環(huán)境污染及對人類健康構(gòu)成潛在威脅等不良后果。因此，這就迫切需要從三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病機制和開發(fā)新型的抗菌藥物進行免疫防治?？怪嗵且蜃?ALF)是一種能夠結(jié)合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用機制與傳統(tǒng)抗生素不同，細菌不易產(chǎn)生耐藥性，對正常真核細胞無毒害，日益受到廣泛關(guān)注。ALF最初是從美洲鱟中發(fā)現(xiàn)，它可以結(jié)合LPS，并對R型革蘭氏陰性菌有明顯的抑制生長作用。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，鱟ALF結(jié)構(gòu)中有兩個高度保守的半胱氨酸殘基， 它們形成二硫鍵所限制的β折疊區(qū)域即為LPS結(jié)合域。體外合成鱟ALF的LPS結(jié)合域，證明其確實可以與LPS結(jié)合，能夠在體外調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，有助于保護小鼠免受內(nèi)毒素的攻擊。隨后，從對蝦、螯蝦、蟹等甲殼動物中也鑒定或克隆出多種抗脂多糖因子。研究表明這些甲殼動物ALF的表達水平在細菌刺激后明顯上調(diào)，其重組蛋白能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長，提示ALF在甲殼動物固有免疫中發(fā)揮重要作用。到目前為止，關(guān)于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的報道較少。因此，識別、定性抗菌效應分子-抗脂多糖因子對研究三疣梭子蟹的免疫防御機制和進行病害防治具有重要的理論和實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因及其編碼蛋白和應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4 基因為序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因編碼蛋白所述PtALF-4基因編碼蛋白為序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。
三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因編碼蛋白的應用所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因的重組表達產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因的重組表達產(chǎn)物可作為革蘭氏陰性菌、真菌的抑菌藥物。所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、愛德華氏菌，真菌為畢赤酵母。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明利用表達序列標簽技術(shù)(EST)、RACE技術(shù)從三疣梭子蟹中克隆到PtALF-4 基因cDNA全長序列，通過PCR技術(shù)擴增編碼PtALF-4成熟肽的基因片段并將其克隆到 pET32a(+)表達載體中，在大腸桿菌BL21(DE;3)-plysS實現(xiàn)體外重組表達。重組蛋白經(jīng) TALON柱純化和透析復性后，對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華氏菌、 真菌畢赤酵母具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為3. 32 μ Μ、53· 14 μ Μ、13. 28 μ Μ、 106. ^yM ；而對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌沒有明顯的抑制作用。本發(fā)明基因及其重組蛋白在藥物生產(chǎn)、免疫增強劑、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產(chǎn)中的應用，另外還可以進一步研究三疣梭子蟹免疫防御機制提供基礎(chǔ)，并為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑。


圖1為本發(fā)明實例提供的純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4編碼成熟肽的基因擴增產(chǎn)物(其中，M =DNA marker, 1 成熟肽的基因擴增產(chǎn)物)。圖2為本發(fā)明實例提供的誘導和純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4重組蛋白(其中M 蛋白marker ;1 未誘導菌體中表達的蛋白；2 :IPTG誘導后表達的蛋白；3 純化的重組蛋白)。
具體實施例方式下面的實施例中將本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明中的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4的cDNA序列克隆包括下列步驟a)三疣梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化；b)三疣梭子蟹cDNA文庫構(gòu)建；c)三疣梭子蟹cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定；d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtALF-4基因片段的篩選；e) RACE擴增獲得PtALF-4的全序列以及全序列的驗證。實施例1.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因為SEQ ID No. 1中所示的堿基序列。序列表SEQ ID No. 1 為:ggggactccc tcaccggcta caacacaggc acgtgaaaca cacacacaggtgactccacg gacaccttat cttaaacagg atg cat gtg tcc eggcca tgg gca gtg gtg gtg aca gtg gtg gtg gtg atg gcc ctaccc aca ccc acg caa ggg ggg tgg cta gac att gta aaa gcc
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gtgaatgtgatactatttataatatttgttactagacata3.3.3.3. C 3. 3.3.3.
tagacaaaaa(a)序列特征 長度i;353bp (有效長度 81-458) 類型堿基序列 鏈型單鏈 拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源三撫梭子蟹(Portunus trituberculatus)(f)特異性名稱CDS構(gòu)建具體操作如下1.三疣梭子蟹總RNA的提取及mRNA的純化利用hvitrogen公司的Trizol試劑提取三疣梭子蟹總RNA，利用QIAGENE公司的Oligitex mRNA純化試劑盒純化mRNA。2.三疣梭子蟹cDNA文庫構(gòu)建利用Clontech公司的Creator Smart cDNALibrary Construction Kit試劑盒使用說明構(gòu)建cDNA文庫。以純化后的mRNA為模板， SMART IV Oligonucleotide(5‘ MGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG 3')和CDS III/3' PCR Primer (5‘ ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30Ν_!Ν 3')為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV reverse transcriptase)作用下轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈。用 5' PCRPrimer ( 5' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3‘)和 CDSII1/3' PCR Primer (5‘ ATTCTAGAGGCCGAGGCG GCCGACATG-d(T) SONjN 3')為引物經(jīng) long distance (LD-PCR)合成 cDNA 第二鏈。雙鏈 cDNA(ds cDNA)在45°C條件下經(jīng)蛋白酶K(0. 8mg/ml)消化20min，然后用Sf Π酶進行酶切， 酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit回收1-31Λ的片段。將回收的片段與載體pDNR-LIB連接后純化，通過電轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌感受態(tài)細胞，37°C條件下220rpm/min培養(yǎng)lh，加入終體積20%的甘油，即為全長cDNA 原始文庫。3.三疣梭子蟹cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')在ABI3730xl測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*. abl，*. abd文件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*. seq) 和質(zhì)量文件(*. seq. qual)，依據(jù)質(zhì)量文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-match程序屏蔽數(shù)據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13(準確率大于95% )且長度大于IOObp的序列作為EST數(shù)據(jù)，具體《基因表達序列(EST)數(shù)據(jù)分析手冊》(胡松年著，浙江大學出版社，2005年)。4.三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtALF-4基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數(shù)據(jù)進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲得的Contigs與 Singletons在數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn和BLASTx分析，結(jié)果顯示在EST序列中發(fā)現(xiàn)了與細角濱對蝦抗脂多糖因子相似性較高( %)的序列，根據(jù)相似性分析結(jié)果確定了三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因的EST序列。5.三疣梭子蟹PtALF-4基因cDNA全長序列的克隆根據(jù)與 PtALF-4基因同源的EST序列設(shè)計特異引物Fl (5 ‘ GACGCTCTGAAGGACTTTATG 3 ‘)禾Π Rl(5 ‘ CGCCGAAACGCTTAGAAATAC 3 ‘)，分別禾U 用載體通用引物 M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')禾口 M13R(5' CAGGAAACAGCTATGACC 3')進 亍 3'禾口 5'末端的擴增。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用Axygen膠回收試劑盒進行 PCR產(chǎn)物回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Transl-Tl (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑選陽性克隆用載體引物Μ13-47 和RV-M進行測序，所得結(jié)果經(jīng)Wired/Wirap軟件進行拼接，得到三疣梭子蟹PtALF-4基因全長cDNA序列見SEQ ID No. 1。6.三疣梭子蟹PtALF-4基因cDNA全長的驗證在測序拼接的PtALF-4 全長序列上設(shè)計一對引物 F2(5 ‘ CTTAAACAGGATGCATGTGTCCCGG 3 ‘)和 R2(5' ATAGTATCACATTCACAGTCAGGC 3')，以cDNA為模板進行全長的驗證。測序及分析同 5。3' RACE擴增反應體系及反應條件25 μ 1反應體系IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP (IOmM)0. 5 μ 1
引物 Fl (5μΜ)Ιμ
引物 Μ13ΙΙ(5μΜ)1 μ 1
CDNA文庫模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3μ 1 反應在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中進行，反應條件為94°C變性:3min ；94°C變性30s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，34個循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0
5' RACE擴增反應體系及反應條件 25 μ 1反應體系
IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP ( IOmM )0. 5 μ 1
引物 Rl (5μΜ)1μ 1
引物 M13F(5pM)1 μ 1
cDNA文庫模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3μ 1 SiS^TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中ii 行，反應條件為94°C變性3min ；94°C變性30s，57°C退火50s，72°C延伸lmin，34個循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0

全長驗證的PCR反應體系和反應條件為 25 μ 1反應體系
IOxPCR buffer MgCl2 (25mM) dNTP ( IOmM ) 引物 F2 (5μΜ)
111
μ μ μ 1
5 5 5α1
· La
21.0 1
1)
引物 R2 (5μΜ) cDNA文庫模板 Taq DNA 聚合酶(5U/ μ ddH20反應在 TaKaRa PCR Thermal Cycler 行，反應條件為94°C變性3min ；94°C變性30s, 57. 5°C退火50s, 72°C延伸lmin, 34個循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0序列表SEQ ID No. 1從三疣梭子蟹中克隆到PtALF_4基因cDNA全長1353bp，其中開放閱讀框378bp，5'非翻譯區(qū)80bp，3'非翻譯區(qū)8%bp，有多聚腺苷酸尾巴。
Ιμ Ιμ
0. 2μ 1 17. 3μ 1
DiceModel ΤΡ600 (Takara Bio Inc.)中進
實施例2.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4序列表SEQ ID No. 1所述堿基序列，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所述。序列表SEQ ID No. 2 為Met His Val Ser Arg Pro Trp AlaVal ValValThrValValValVal
Met Ala Leu Pro Thr Pro Thr GlnGly GlyTrpLeuAsplieValLys
Ala lie Val Val Pro Ala Ala ArgGlu ThrlieLysThrGlnGlulie
Thr Leu Leu Asp His Tyr Cys ThrLeu SerArgSerProTyrlieLys
Ser Leu Glu Leu His Tyr Arg AlaGlu ValThrCysProGlyTrpThr
lie lie Arg Gly Arg Gly Ser AsnHis ArgAsnProThrAsnSerGly
Lys Asp Ala Leu Lys Asp Phe MetThr GlnAlaValAlaAlaGlyLeu
Val Thr Lys Glu Glu Ala Ala ProTrp LeuAsnHisArg其具有完整的編碼蛋白含有125個氨基酸，其中編碼序列的1-25個氨基酸為信號肽，成熟肽包含100個氨基酸，預測的分子量為11. 20Da，等電點為9. 07。成熟肽具有典型的抗脂多糖因子模式結(jié)構(gòu)兩個保守的半胱氨酸殘基和保守單元W(T)CPGWT(A),兩個保守的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，構(gòu)成一個典型的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)。三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4重組蛋白的獲得，具體操作如下根據(jù)SEQ ID No. 2對應的cDNA序列，設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶BamHI和BioI酶切位點的特異性引物 F3 (5‘ GGATCCGGGTGGCTAGACATTGTAAAAG 3')和 R3 (5‘ CTCGAGTTAGC GGTGGTTGAGCCAGGGT 3')，通過PCR技術(shù)擴增編碼PtALF-4成熟肽的基因片段(參見圖 1), β,Ι^ TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中 于， 反應條件為94°C變性:3min ；94°C變性30s，58. 5°C退火50s，72°C延伸30s，34個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。然后通過酶切將其克隆到pET3h(+)表達載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE 3)-plysS，測序確認表達框正確后，接種陽性克隆到LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0. D. 600 = 0. 4-0. 6，加入IPTG至終濃度為ImM誘導4小時后離心收集菌體。菌體在冰浴條件下用超聲波180W處理30-60min (每次2s，間隔2s)，離心去掉上清，收集沉淀(含重組蛋白包涵體)。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱純化重組產(chǎn)物。 將純化的重組蛋白轉(zhuǎn)移到透析袋中，4°C條件下，在含有2mM還原谷胱苷肽、0. 2mM氧化谷胱苷肽、ImM EDTA、50mM Tris_HCl、50mM NaCl、10%甘油和1 %甘氨酸的及梯度降低的尿素 (6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M)的透析復性液(pH = 8. 0)中透析，使重組蛋白復性，最后在50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)的緩沖液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析復性后的重組蛋白經(jīng)PALL公司的Micros印Advance超濾離心濃縮管進行濃縮，用碧云天公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒測得三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4重組蛋白的濃度為3. 08mg/ml (參見圖2)。實施例3.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4重組蛋白的體外抑菌試驗1.微生物的培養(yǎng)及制備溶藻弧菌用TSB培養(yǎng)基^°C，銅綠假單胞菌用TSB培養(yǎng)基37°C，遲緩愛德華氏菌用LB培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌用LB培養(yǎng)基37°C，藤黃微球菌用LB培養(yǎng)基37°C，畢赤酵母用YPD培養(yǎng)基28 V，上述各菌株用搖床220rpm/min培養(yǎng)使菌濃度達到對數(shù)生長期時，分別用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)緩沖液稀釋菌體，分別使其每毫升菌液中的菌落數(shù)約為1X103。2.重組蛋白PtALF-4抑菌活性測定利用上述實施例所得重組蛋白PtALF_4用 Tris-HCl (50mM, pH = 8. 0)梯度稀釋(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)后，取 50 μ 1 加到無菌平底 96 孔板(Costar, Fisher)中，50 μ 1 Tris-HCl (50mM, pH = 8. 0)設(shè)為對照，然后加入50μ 1稀釋好的菌懸液，并且混勻。只加入50μ 1菌液的孔為空白孔。96孔板在菌液的培養(yǎng)溫度下孵育3小時后，加入相應的培養(yǎng)基150 μ 1，空白孔加入培養(yǎng)基200 μ 1，孵育過夜。加溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華氏菌、畢赤酵母的96孔板在波長為560nm 的可見光下讀數(shù)，加金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的96孔板在波長為600nm的可見光下讀數(shù)。發(fā)現(xiàn)上述實施例重組蛋白PtALF-4對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌和遲緩愛德華氏菌、真菌畢赤酵母有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度分別為3. 32μΜ、53. 14μΜ、 13. 28μΜ、106. 28 μ M ；而對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌沒有明顯的抑制作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因，其特征在于三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因為序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因編碼蛋白，其特征在于所述PtALF-4基因編碼蛋白為序列表SEQ IDNo. 2中氨基酸序列所示。
3.一種按權(quán)利要求2所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因編碼蛋白的應用， 其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因的重組表達產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。
4.按權(quán)利要求3所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因編碼蛋白的應用，其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因的重組表達產(chǎn)物可作為革蘭氏陰性菌、真菌的抑菌藥物。
5.按權(quán)利要求4所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因編碼蛋白的應用，其特征在于所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華氏菌，真菌為畢赤酵母。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因及其編碼蛋白和應用。本發(fā)明利用cDNA文庫和RACE技術(shù)從三疣梭子蟹中擴增到PtALF-4基因cDNA，該基因在三疣梭子蟹免疫防御方面發(fā)揮著重要作用。重組的PtALF-4蛋白對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌和遲緩愛德華氏菌、真菌畢赤酵母具有較強的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為3.32μM、53.14μM、13.28μM、106.28μM；而對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌沒有明顯的抑制作用。本發(fā)明為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C07K14/435GK102329802SQ20111029049
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者劉媛, 崔朝霞 申請人:中國科學院海洋研究所