專利名稱:力生長(zhǎng)因子在制備無(wú)血清培養(yǎng)耐受型哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程和基因工程重組技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種新型生長(zhǎng)因子在改良工程細(xì)胞方面的應(yīng)用,特別涉及力生長(zhǎng)因子(Mechano growth factor, MGF)在制備無(wú)血清培養(yǎng)耐受型哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
在生物技術(shù)領(lǐng)域,基因工程重組技術(shù)無(wú)疑是最具革命性的技術(shù),該技術(shù)使人類可以對(duì)物種進(jìn)行改造,通過(guò)基因重組構(gòu)建工程菌、哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等,從而獲得所需的生物制品或更具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物品種。長(zhǎng)期以來(lái),重組蛋白的生產(chǎn)多采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),但有許多重要蛋白在大腸桿菌中無(wú)法進(jìn)行有活性的表達(dá),對(duì)大腸桿菌進(jìn)一步的遺傳改造也收效甚微。與大腸桿菌相比,用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠正確有效地識(shí)別蛋白的合成、加工和分泌信號(hào),能夠準(zhǔn)確地完成糖基化、磷酸化,形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵以及蛋白水解等翻譯后加工過(guò)程,所表達(dá)的蛋白具有天然蛋白一樣的生物活性。但與大腸桿菌相比,哺乳動(dòng)物細(xì)胞的工程化培養(yǎng)面臨諸多困難,主要原因在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高,對(duì)大規(guī)模發(fā)酵環(huán)境下的應(yīng)激環(huán)境非常敏感,容易發(fā)生細(xì)胞死亡或凋亡。雖然通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件獲得了一些有利成果,但一些問(wèn)題仍然無(wú)法從根本上得到解決。近年來(lái),隨著對(duì)細(xì)胞代謝途徑和調(diào)控機(jī)理的深入研究,越來(lái)越多的研究者將研究方向轉(zhuǎn)向?qū)?xì)胞本身進(jìn)行改造,通過(guò)基因工程重組技術(shù)使細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)的適應(yīng)能力更強(qiáng),從而滿足產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)的要求。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵工程中,為了下游純化方便和提高生物安全性,也為了降低生產(chǎn)成本,通常需要進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng),但血清中所含的各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素、粘附蛋白等成份往往是細(xì)胞存活和增殖所必須的。因此,提高哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的耐受力,是哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵工程的關(guān)鍵。MGF是胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)的一種變體,由Igf-1基因剪接變異產(chǎn)生。與IGF-1相比,人MGF多出長(zhǎng)40個(gè)氨基酸的羧基端短肽序列(嚙齒類動(dòng)物為41個(gè)氨基酸,兩種MGF的功能相同),該短肽可以作用于獨(dú)立的受體;并由于來(lái)自外顯子5的49bp (嚙齒類動(dòng)物為52bp)的插入序列,導(dǎo)致外顯子6的翻譯發(fā)生移碼突變,產(chǎn)生特異的長(zhǎng)24個(gè)氨基酸的羧基端E肽序列(嚙齒類動(dòng)物為25個(gè)氨基酸),該序列可以作為MGF的活性片段單獨(dú)發(fā)揮MGF的生物學(xué)功能。MGF最初是在機(jī)械損傷的骨骼肌中被發(fā)現(xiàn)的,目前發(fā)現(xiàn)心肌、成骨細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、肌腱成纖維細(xì)胞等在損傷狀態(tài)下都有MGF的表達(dá)。既往研究顯示,MGF具有保護(hù)損傷細(xì)胞、促進(jìn)損傷修復(fù)的功能,預(yù)示了該因子在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景。但MGF能否應(yīng)用于細(xì)胞工程領(lǐng)域以提高哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞對(duì)大規(guī)模發(fā)酵環(huán)境下無(wú)血清培養(yǎng)的耐受力,目前尚未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究MGF能否應(yīng)用于細(xì)胞工程領(lǐng)域以提高哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞對(duì)大規(guī)模發(fā)酵環(huán)境下無(wú)血清培養(yǎng)的耐受力,進(jìn)而獲得一種更適合生物制品工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞。為達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
MGF在制備無(wú)血清培養(yǎng)耐受型哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中的應(yīng)用。所述MGF可以來(lái)源于嚙齒類動(dòng)物鼠,氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,編碼基因序列如SEQ ID No. 4所示。鑒于除鼠外的其它嚙齒類動(dòng)物來(lái)源的MGF、人源MGF與鼠源MGF都具有高度類似的序列和相同的功能,并都能在不同種屬的細(xì)胞中得到表達(dá),因此,所述MGF也可以來(lái)源于除鼠外的其它嚙齒類動(dòng)物,如兔,氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示,編碼基因序列如SEQ ID No. 5所示;還可以來(lái)源于人,氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示,編碼基因序列如SEQ ID No. 6所示。所述哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinesehamster ovary cell, CH0)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)和人胚腎293細(xì)胞等。本發(fā)明的有益 效果在于本發(fā)明提供了 MGF在制備無(wú)血清培養(yǎng)耐受型哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中的應(yīng)用,通過(guò)將MGF編碼基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,可以構(gòu)建出能穩(wěn)定、自主表達(dá)MGF的工程細(xì)胞,該工程細(xì)胞通過(guò)表達(dá)MGF能顯著提高對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的耐受能力,可降低對(duì)發(fā)酵條件的要求,減少培養(yǎng)成本,特別適用于生物制品的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖1為攜帶MGF編碼基因的重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖2為PCR鑒定陽(yáng)性克隆細(xì)胞中基因組MGF基因的整合,其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Maker),I為攜帶MGF編碼基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞,2為未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞。圖3為PCR鑒定陽(yáng)性克隆細(xì)胞中MGF mRNA的表達(dá),其中M為Marker,I為攜帶MGF編碼基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞,2為未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞,3為未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞,4為攜帶MGF編碼基因的重組慢病毒質(zhì)粒。圖4為Western blot鑒定陽(yáng)性克隆細(xì)胞中MGF的表達(dá),其中I為攜帶MGF編碼基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞,2為未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞,3為未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞。圖5為MTT法檢測(cè)陽(yáng)性克隆細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)下的增殖能力,其中空白對(duì)照為未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞,空病毒為未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞,MGF整合為攜帶MGF編碼基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞。圖6為Annexin V-FITC/PI法流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性克隆細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)下的凋亡狀況,其中a為未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞,b為未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞,c為攜帶MGF編碼基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚,下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版,J.薩姆布魯克等著,黃培堂等譯,科學(xué)出版社,2002年)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。一、穩(wěn)定表達(dá)鼠MGF的哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞的構(gòu)建和鑒定
合成核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的鼠MGF編碼基因。按照ViraPower LentiviralDirectional Τ0Ρ0 Expression Kit (Invitrogen公司)說(shuō)明書的要求合成如下引物上游引物 F :5,-caccatgggaccggagacgc-3,;下游引物 R :5,-gatgaacacaagaagtttac-3,。以合成的鼠MGF編碼基因?yàn)槟0?,采用上述引物,PCR擴(kuò)增帶有CACC粘性末端的鼠MGF編碼基因。將帶有CACC粘性末端的鼠MGF編碼基因與慢病毒質(zhì)粒pLenti6/V5-D-T0P0連接,獲得攜帶鼠MGF編碼基因的重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6/V5-D-T0P0-MGF (圖1)。采用常規(guī)CaCl2法制備大腸桿菌Stbl3的感受態(tài)細(xì)胞,并熱激轉(zhuǎn)化pLenti6 V5 D-T0P0-MGF質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)化的Stbl3細(xì)胞用含有100 μ g/ml氨節(jié)青霉素和50 μ g/ml稻痕菌素(blasticidin)的LB平板培養(yǎng),篩選出轉(zhuǎn)化了 pLenti6 V5 D-T0P0-MGF的陽(yáng)性克隆細(xì)胞。將陽(yáng)性克隆細(xì)胞擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,用BstX I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定,獲得大小符合鼠MGF編碼基因長(zhǎng)度的酶切片段,說(shuō)明重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6/V5-D-T0P0-MGF構(gòu)建成功。 復(fù)蘇293FT細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到60-80%時(shí),按照ViraPower LentiviralDirectional Τ0Ρ0 Expression Kit說(shuō)明書介紹的方法,將重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6/V5-D-T0P0-MGF用Lipofectamine轉(zhuǎn)化細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí),收集含病毒的培養(yǎng)上清液,離心去除細(xì)胞碎片,獲得鼠MGF重組慢病毒懸液。培養(yǎng)CH0-K1細(xì)胞至60-80%融合,加入鼠MGF重組慢病毒懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)染,用4 μ g/ml稻瘟菌素篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞,共培養(yǎng)12天。取所得陽(yáng)性克隆細(xì)胞,進(jìn)行基因組PCR、mRNAPCR及western blot鑒定?;蚪MPCR鑒定結(jié)果如圖2所示,提取細(xì)胞DNA,采用前述上游引物F和下游引物R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從陽(yáng)性克隆細(xì)胞基因組中可以擴(kuò)增出MGF編碼基因,說(shuō)明MGF編碼基因已整合入細(xì)胞基因組中,而從未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞基因組中不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。mRNA PCR鑒定結(jié)果如圖3所示,提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用前述上游引物F和下游引物R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,陽(yáng)性克隆細(xì)胞可以擴(kuò)增出MGF編碼基因,說(shuō)明細(xì)胞中有MGF mRNA表達(dá),而未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞和未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞均不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。Western blot鑒定結(jié)果如圖4所示,提取細(xì)胞總蛋白,采用兔抗MGF抗體進(jìn)行分析,可見陽(yáng)性克隆細(xì)胞中有MGF表達(dá),而未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞和未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞都沒(méi)有特異性條帶產(chǎn)生。上述攜帶MGF編碼基因并有相應(yīng)蛋白表達(dá)的陽(yáng)性克隆細(xì)胞即為成功構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)鼠MGF的CH0-K1工程細(xì)胞。二、穩(wěn)定表達(dá)鼠MGF的哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)耐受能力測(cè)試
以未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞和未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞為對(duì)照,取所構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)鼠MGF的CH0-K1工程細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)耐受實(shí)驗(yàn)(I)將細(xì)胞用MDM/ΗΤ無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;(2)將細(xì)胞用MDM/ΗΤ無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí),用Annexin V-FITC/PI法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況。MTT法檢測(cè)結(jié)果如圖5所示,與未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞和未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞相比,穩(wěn)定表達(dá)鼠MGF的CH0-K1工程細(xì)胞數(shù)顯著增加,說(shuō)明鼠MGF可以提高CH0-K1細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下的增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖6所示,未經(jīng)病毒感染的細(xì)胞和未攜帶MGF編碼基因的空病毒感染細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72小時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別為65. 6%和68. 3%,而穩(wěn)定表達(dá)鼠MGF的CHO-K1工程細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下的細(xì)胞凋亡率僅為20. 5%,說(shuō)明鼠MGF可以提高CHO-Kl細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的耐受能力。鑒于除鼠外的其它嚙齒類動(dòng)物來(lái)源的MGF、人源MGF與鼠源MGF具有高度類似的序列和相同的功能,并都能在不同種屬的細(xì)胞中得到表達(dá),本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)除鼠外的其它嚙齒類動(dòng)物來(lái)源的MGF和人源MGF也可以提高CHO-Kl細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的耐受能力。參照上述實(shí)施例,本發(fā)明分別以兔MGF編碼基因(SEQ ID No. 5)和人MGF編碼基因(SEQ ID No. 6)取代鼠MGF編碼基因構(gòu)建MGF重組慢病毒,再轉(zhuǎn)化CHO-Kl細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)兔MGF或人MGF的CHO-Kl工程細(xì)胞,同樣進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)耐受實(shí)驗(yàn),獲得了與鼠MGF相近的結(jié)果,證實(shí)了嚙齒類動(dòng)物來(lái)源的MGF和人源MGF都可以提高CHO-Kl細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的耐受能力。參照上述實(shí)施例,本發(fā)明還將所構(gòu)建的鼠/兔/人MGF重組慢病毒分別轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞和人胚腎293細(xì)胞,獲得穩(wěn)定表達(dá)鼠/兔/人MGF的工程細(xì)胞,同樣進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)耐受實(shí)驗(yàn),也獲得了與CHO-Kl細(xì)胞相近的結(jié)果,證實(shí)了 MGF也能夠提高除CHO-Kl細(xì)胞以外的其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的耐受能力。根據(jù)上述記載,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測(cè),除MGF以外,具有MGF活性的MGF截短片段如羧基端E肽序列,以及維持MGF活性不變或活性提高的MGF變體和MGF衍生物等都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的;除天然的MGF編碼基因序列以外,根據(jù)宿主細(xì)胞對(duì)密碼子的偏好性人工設(shè)計(jì)的MGF編碼基因序列,也同樣可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的。最后說(shuō)明的是,以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制,盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述,但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變,而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.力生長(zhǎng)因子在制備無(wú)血清培養(yǎng)耐受型哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用,其特征在于所述力生長(zhǎng)因子來(lái)源于嚙齒類動(dòng)物鼠,其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的應(yīng)用,其特征在于所述力生長(zhǎng)因子的編碼基因序列如SEQID No. 4 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用,其特征在于所述力生長(zhǎng)因子來(lái)源于嚙齒類動(dòng)物兔,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的應(yīng)用,其特征在于所述力生長(zhǎng)因子的編碼基因序列如SEQID No. 5 所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于所述力生長(zhǎng)因子來(lái)源于人,其氨基酸序列如 SEQ ID No. 3 所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的應(yīng)用,其特征在于所述力生長(zhǎng)因子的編碼基因序列如SEQID No. 6 所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的應(yīng)用,其特征在于所述哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞的宿主細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程和基因工程重組技術(shù)領(lǐng)域,涉及力生長(zhǎng)因子(Mechanogrowthfactor,MGF)在制備無(wú)血清培養(yǎng)耐受型哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中的應(yīng)用,通過(guò)將MGF編碼基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,可以構(gòu)建出能自主表達(dá)MGF的工程細(xì)胞,該工程細(xì)胞通過(guò)表達(dá)MGF能顯著提高對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)的耐受力,可降低對(duì)發(fā)酵條件的要求,減少培養(yǎng)成本,特別適用于生物制品的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K14/65GK103031277SQ20111029230
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者張兵兵, 鮮成玉, 王遠(yuǎn)亮, 徐洪記, 趙源 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)