專利名稱：抑制癌細(xì)胞生長的短肽及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制癌細(xì)胞生長的短肽及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥，也稱為惡性腫瘤，是由于細(xì)胞增殖與凋亡的精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制失常所引起的疾病，癌細(xì)胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移到身體其他器官。癌癥已經(jīng)成為全球人類健康的首要?dú)⑹种唬瑩?jù)世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organization, WHO) 2010年發(fā)表的公告，全球每年有1200萬人被確診為癌癥，760萬人死于癌癥。若不加控制，預(yù)計(jì)到2030年每年癌癥死亡人數(shù)有可能達(dá)到1700萬人，且大多數(shù)發(fā)生在中低收入的發(fā)展中國家。WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2005年我國有189. 2萬人死于癌癥，其中118. 2萬人為70歲以下，胃癌為最高發(fā)癌癥種類，而近年來我國癌癥發(fā)病更是逐漸趨于低齡化。發(fā)現(xiàn)并發(fā)展新的癌癥治療的藥物，對于社會的穩(wěn)定，人民健康生活質(zhì)量的提高，社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有良好的推動作用。目前，用于臨床的癌癥藥物種類繁多，但多數(shù)抗癌藥物在抑制癌癥細(xì)胞生長的同時(shí)，對于人體正常組織也有一定的損害，使癌癥病人在治療癌癥過程中承受巨大的生理和心理的折磨。癌癥細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制失常往往是由于一些重要調(diào)控基因的失活造成的。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因根據(jù)其 在細(xì)胞中的失活機(jī)理可簡單的分為兩類。I型抑癌基因是指其在DNA層面上，基因發(fā)生突變而喪失抑制細(xì)胞生長作用的基因。II型抑癌基因是一種新穎的抑癌基因，它們在正常細(xì)胞中存在一定水平的表達(dá)，具有一定的功能，而在腫瘤細(xì)胞中DNA并沒有發(fā)生改變，而其基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯在不同程度上下調(diào)，從而喪失抑制細(xì)胞生長的作用。II型抑癌基因?qū)τ谡＜?xì)胞和個(gè)別的癌癥細(xì)胞并沒有明顯的抑制作用，而對于大多數(shù)癌癥細(xì)胞具有很明顯的抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。因此，II型抑癌基因中具有抑癌作用的短肽將有望成為新型的抗癌新藥。來自人類蛋白的短肽，在細(xì)胞中能夠被多種酶降解代謝為天然氨基酸，對人體沒有毒性，也不會造成累計(jì)效應(yīng)。由于II型抑癌基因的自身特點(diǎn)，對正常細(xì)胞不產(chǎn)生抑制作用，來自II型抑癌基因的短肽將不會對正常細(xì)胞或人體正常器官組織產(chǎn)生副作用，減少治療過程對癌癥病人造成的痛苦。因此，來自II型抑癌基因的抑癌短肽有望成為一種新型的綠色仿生藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種多肽。本發(fā)明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述多肽的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述編碼基因?yàn)槿缦翴)-3)中任一所述的DNA分子I)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下可與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的 多肽的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的多肽的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC)，0.1 % SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也在本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體為將所述多肽的編碼基因插入pcDNA3.1-BFPC-1inker中，得到表達(dá)所述多肽的重組載體。所述pcDNA3.1-BFPC-1inker按照如下方法制備I)在pcDNA3.1載體的NotI和ClaI酶切位點(diǎn)間插入Tag BFP編碼基因(序列3)，得到重組載體pcDNA3.1-BFPC ；2)在步驟I)得到的重組載體pcDNA3.1-BFPCLinkerClaI和BspEI酶切位點(diǎn)間插A Linker 基因的 DNA 片段(序列 6)，得到載體 pcDNA3. 1-BFPC-linker。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系是將所述的重組載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所述宿主細(xì)胞具體為子宮頸癌細(xì)胞，所述子宮頸癌細(xì)胞尤其優(yōu)選為HeLa細(xì)胞。擴(kuò)增所述基因的全長或其任一片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述引物對的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5。所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品的應(yīng)用；或所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡體現(xiàn)在如下I)-5)中的任意一種I)降低腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位、促進(jìn)磷酯酰絲氨酸外翻、激活細(xì)胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶(caspase)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡；2)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡；3)降低腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位；4)促進(jìn)磷酯酰絲氨酸外翻；5)激活細(xì)胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶(caspase)；
所述腫瘤細(xì)胞具體為子宮頸癌細(xì)胞，所述子宮頸癌細(xì)胞尤其優(yōu)選為HeLa細(xì)胞；所述產(chǎn)品為藥物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制腫瘤生長產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過對II型抑癌基因功能區(qū)域的研究，發(fā)現(xiàn)一種可以抑制人類癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的三十七肽，通過對HeLa細(xì)胞的施用實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該短肽能夠造成人類子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的凋亡，因此該短肽可能成為良好的低副作用的抗癌藥物。


圖1為短肽引起人類子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的降低圖2為短肽誘導(dǎo)人類子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的凋亡圖3為短肽誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的死亡率統(tǒng)計(jì)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、短肽的獲得

本發(fā)明所用短肽序列來自一種人類第二類腫瘤抑制因子，其DNA片段可以通過以人類肝臟cDNA文庫為模板的PCR擴(kuò)增獲得。以人類肝臟cDNA文庫為模板，以h2cm7-N/h2cm7-C為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到該短肽基因片段的PCR產(chǎn)物，該基因片段兩端分別帶有BspEI和XbaI酶切位點(diǎn)。h2cm7-N :5，-CGATTCTCCGGACGCAGTGACCAGGTCAGAGAT-3，(序列 4)；h2cm7-C :5，-CTAGTCTAGATTATTGCTTTTGTCGCTTGTTTC-3’ (序列 5)。具體PCR反應(yīng)體系如下
人類肝臟cDNA文庫0.5 ^iL
正向引物2.5 ^iL(IpM)
反向引物2.5 ^iL(IpM)
2XPfu MasterMix25 [iL (購于天根生化科技有限公司)
H2O_19 uL_
50 JiL反應(yīng)條件940C 5min2 94°C 40sec3 60°C 40sec4 72 °C 45min72 °C 30min
4 °C IOmin2, 3,4 為 cycle 反應(yīng)需要 30cycles得到136bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸，其編碼的多肽具有序列表中序列2所示的氨基酸，將該多肽命名為REVC37。也可人工合成序列I作為模板，以h2cm7_N和h2cm7_C為引物，同樣得到136bp的PCR 產(chǎn)物 REVC37。也可直接人工合成序列2作為REVC37。實(shí)施例2、短肽REVC37的功能鑒定一、含有短肽REVC37基因序列的重組載體的構(gòu)建1、融合Tag BFP熒光蛋白載體pcDNA3.1-BFPC的構(gòu)建I) Tag BFP基因片段的制備Tag BFP根據(jù)Gene Bank的序列由博邁德科技發(fā)展有限公司全基因合成。Tag BFP的Gene Bank號為ABP88744.1 (核苷酸序列為序列3)。以全基因合成得到的含有Tag BFP序列的質(zhì)粒為模板(也可人工合成序列3作為模板)，以BFP-N/BFP-C為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物即為Tag BFP基因片段，該基因片段兩端分別帶有NotI和ClaI酶切位點(diǎn)。BFP-N :5’ -TAATGCGGCCGCATGAGCGAGCTGATTAAGGAG-3’
`
BFP-C :5’ -ACATATCGATATTAAGCTTGTGCCCCAGTT-3’具體PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
Tag BFP模板基因I隊(duì)(20 ng)
正向引物2.5 ^iL(IpM)
反向引物2.5 ^iL(IpM)
2XPfu MasterMix25 [iL (購于天根生化科技有限公司)
H2O_19 uL_
50 JiLPCR反應(yīng)條件94°C 5min2 94°C 40sec3 60°C 40sec4 72。。1. 5min72 °C 30min4 °C IOmin2, 3,4 為 cycle 反應(yīng)需要 30cycles得到731bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列3所示的核苷酸，即為Tag BFP基因片段。2)融合Tag BFP熒光蛋白載體的構(gòu)建將步驟I)得到的Tag BFP基因片段經(jīng)過NotI和ClaI酶切，得到酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切得到的pcDNA3.1載體(購自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號為V860-20)連接，得到連接產(chǎn)物，取5 u L連接產(chǎn)物加入大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞中(購于天根生化科技有限公司)，冰浴30min，42°C熱擊90s，冰浴5min，加入Iml LB培養(yǎng)基，37°C溫箱溫浴lh，涂布于Amp+平板，37°C溫箱培育過夜，得到轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子的單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒用NotI和ClaI酶切，能得到731bp核苷酸片段的為陽性質(zhì)粒，選擇陽性質(zhì)粒使用T7和BGHrev通用引物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與Tag BFP編碼基因相符的即為構(gòu)建成功的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為在pcDNA3.1載體的NotI和ClaI酶切位點(diǎn)間插入Tag BFP編碼基因(序列3)的重組載體，將該重組載體記作pcDNA3.1-BFPC0上述酶切反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
2.權(quán)利要求1所述多肽的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下可與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的多肽的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的多肽的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求1所述多肽的編碼基因插入pcDNA3.1-BFPC-1inker中，得到表達(dá)所述多肽的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系是將權(quán)利要求5所述的重組載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所述宿主細(xì)胞具體為子宮頸癌細(xì)胞，所述子宮頸癌細(xì)胞尤其優(yōu)選為HeLa細(xì)胞。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或其任一片段的引物對，所述引物對的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4，所述引物對中的另一條弓I物的核苷酸序列為序列表中的序列5。
8.權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2或3所述多肽的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述重組載體或權(quán)利要求4或6所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品的應(yīng)用；或權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2或3所述多肽的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述重組載體或權(quán)利要求4或6所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡體現(xiàn)在如下I)-5)中的任意一種1)降低腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位、促進(jìn)磷酯酰絲氨酸外翻、激活細(xì)胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡；2)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡；3)降低腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位；4)促進(jìn)磷酯酰絲氨酸外翻；5)激活細(xì)胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶；所述腫瘤細(xì)胞具體為子宮頸癌細(xì)胞，所述子宮頸癌細(xì)胞尤其優(yōu)選為HeLa細(xì)胞。
10.一種抑制腫瘤生長產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2或3所述多肽的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述重組載體或權(quán)利要求4或6所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制癌細(xì)胞生長的短肽及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的多肽能夠造成人類子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的凋亡，因此該短肽可能成為良好的低副作用的抗癌藥物。
文檔編號C07K14/47GK103030688SQ20111029791
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者夏斌, 林堅(jiān), 任曉白, 魏賀佳 申請人:北京大學(xué)