專利名稱：特異多肽在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異多肽在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的人獸共患傳染病，其發(fā)病死亡率為100%。我國狂犬病死亡人數(shù)高居世界第二位，僅次于印度。導(dǎo)致狂犬病的病原體是彈狀病毒科狂犬病病毒屬的狂犬病病毒(Rabies Virus)。 完整的狂犬病病毒呈子彈形，長度大約為200納米左右直徑為70納米左右。整個(gè)病毒由最外層的脂質(zhì)雙分子層外膜、結(jié)構(gòu)蛋白外殼和負(fù)載遺傳信息的RNA分子構(gòu)成?？袢〔《具M(jìn)入人體后首先侵染肌細(xì)胞，在肌細(xì)胞中渡過潛伏期，后通過肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞之間的乙酰膽堿受體進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，然后沿著相同的通路進(jìn)入脊髓，進(jìn)而入腦， 并不延血液擴(kuò)散。病毒在腦內(nèi)感染海馬區(qū)、小腦、腦干乃至整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在灰質(zhì)大量復(fù)制，延神經(jīng)下行到達(dá)唾液腺、角膜、鼻粘膜、肺、皮膚等部位。狂犬病病毒對(duì)宿主主要的損害來自內(nèi)基小體，即為其廢棄的蛋白質(zhì)外殼在細(xì)胞內(nèi)聚集形成的嗜酸性顆粒。目前我國使用的狂犬病疫苗均是細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，主要包括滅活疫苗和減毒活疫苗兩種。由于疫苗的生產(chǎn)基于活病毒，因此在生產(chǎn)及使用中存在一定安全隱患。另外采用細(xì)胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)疫苗成本較高，導(dǎo)致國內(nèi)狂犬病疫苗價(jià)位偏高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異多肽在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽在制備輔助鑒定動(dòng)物是否感染狂犬病病毒的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種狂犬病疫苗，它的活性成分為含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽。所述疫苗還可包括弗氏完全佐劑或氫氧化鋁佐劑。所述疫苗可為通過如下方法制備得到的疫苗將所述多肽與弗氏完全佐劑完全乳化，得到疫苗。所述疫苗具體可為通過如下方法制備得到的疫苗⑴將所述多肽用pH7. 4 的PBS溶液溶解，使多肽的濃度為lmg/ml，即為抗原溶液；(2)將等體積的弗氏完全佐劑和所述抗原溶液分別吸入兩個(gè)注射器內(nèi)，兩注射器之間以一細(xì)膠管相連，然后交替推動(dòng)針管， 直至形成粘稠的乳劑為止，即為疫苗。所述疫苗具體可為通過如下方法制備得到的疫苗(1)將所述多肽用PH7.4的 PBS溶液溶解，使多肽的濃度為lmg/ml，即為抗原溶液；( 將等體積的所述抗原溶液和氫氧化鋁佐劑充分混勻，即為疫苗。所述氫氧化鋁佐劑具體可通過如下方法制備取5% (g/100ml)硫酸鋁水溶液250ml，在強(qiáng)烈攪拌下加入5% (g/100ml)氫氧化鈉水溶液100ml，用生理鹽水離心洗滌沉淀2次，再將沉淀懸入生理鹽水中使達(dá)250ml。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定動(dòng)物是否感染狂犬病病毒的試劑，它的活性成分為含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽。所述多肽可還包括序列表的序列3所示多肽片段和/或序列表的序列4所示多肽片段(各個(gè)多肽片段的位置關(guān)系可變)。所述多肽還可包括序列表的序列2所示多肽片段(各個(gè)多肽片段的位置關(guān)系可變)。
所述多肽中的各個(gè)所述多肽片段之間具體可用兩個(gè)甘氨酸殘基(Gly Gly)連接。
所述多肽具體可為如下(1)至(9)中的任意一種
(1)序列表的序列8所示的多肽；
(2)序列表的序列5所示的多肽；
(3)序列表的序列6所示的多肽；
(4)序列表的序列12所示的多肽；
(5)序列表的序列11所示的多肽；
(6)序列表的序列7所示的多肽；
(7)序列表的序列10所示的多肽；
(8)序列表的序列9所示的多肽；
(9)序列表的序列1所示多肽。
所述多肽可為活化后的多肽。所述活化的方法具體如下將所述多肽在含有15%
(體積比)DMSO和0. 9mM氧化性谷胱甘肽的Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液中溶解，4°C靜置48小時(shí)。本發(fā)明還保護(hù)含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽，為如下⑴至(9)中的任意一種(1)序列表的序列8所示的多肽；(2)序列表的序列5所示的多肽；(3)序列表的序列6所示的多肽；(4)序列表的序列12所示的多肽；(5)序列表的序列11所示的多肽；(6)序列表的序列7所示的多肽；(7)序列表的序列10所示的多肽；(8)序列表的序列9所示的多肽；(9)序列表的序列1所示多肽。本發(fā)明提供的疫苗(合成肽疫苗)，由B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位組成。該疫苗可誘發(fā)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生保護(hù)性抗體，并引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而有效清除病毒，起到免疫保護(hù)作用。由于不涉及狂犬病活病毒，該疫苗安全可靠。并且，該疫苗的活性成分為短肽，可以人工合成，大大降低生產(chǎn)成本。


圖1為多肽III的質(zhì)譜鑒定圖譜。
圖2為多肽VI的質(zhì)譜鑒定圖譜。圖3為多肽VIII的質(zhì)譜鑒定圖譜。圖4為多肽IX的質(zhì)譜鑒定圖譜。圖5為多肽I的質(zhì)譜鑒定圖譜。圖6為多肽II的反相HPLC譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。標(biāo)準(zhǔn)CVS狂犬病毒中國藥品生物制品檢定所。實(shí)施例1、合成狂犬病抗原肽一、多肽的合成通過Merrifield固相合成技術(shù)，在應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)匹配肽合成儀上，用Fmoc化合物分別合成如下多肽(九種)多肽I (如序列表的序列1所示)、多肽II (如序列表的序列5所示)、多肽III (如序列表的序列6所示)、多肽IV(如序列表的序列7所示)、多肽 V (如序列表的序列8所示)、多肽VI (如序列表的序列9所示)、多肽VII (如序列表的序列 10所示)、多肽VIII (如序列表的序列11所示)和多肽IX(如序列表的序列12所示)。二、多肽的活化將步驟一合成的各個(gè)多肽分別進(jìn)行以下活化1、應(yīng)用三氟乙酸按照標(biāo)準(zhǔn)程序處理樹脂，從樹脂上切除多肽，并使氨基酸側(cè)鏈上的功能集團(tuán)脫封閉。2、取步驟1的多肽，在含有15% (體積比)DMSO和0.9mM氧化性谷胱甘肽的 Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液中溶解，4°C靜置48小時(shí)，促進(jìn)半胱氨酸之間二硫鍵的形成。3、將步驟2的多肽進(jìn)行HPLC純化HPLC純化所用的柱子長度為250毫米，內(nèi)徑為20毫米，填充物為C18硅膠，填充物型號(hào)為 Hedera 0DS-2 10um。共洗脫40分鐘，流速為15ml/min。洗脫液A為0. 1 % (體積比)三氟乙酸水溶液， 洗脫液B為0. 1% (體積比)三氟乙酸乙腈溶液。洗脫液總體積為100%，起始時(shí)刻的洗脫液為洗脫液A，終止時(shí)刻的洗脫液為洗脫液B，起始時(shí)刻和終止時(shí)刻之間的洗脫液為洗脫液 A和洗脫液B的混合液，洗脫過程中，洗脫液A由100 %線性下降至O %，洗脫液B由O %線性上升至100%，收集洗脫液B占洗脫液總體積的20% -60%的過柱后溶液。將各個(gè)多肽HPLC純化得到的過柱后溶液，制成凍干粉，即為各個(gè)純化后多肽，將其用于實(shí)施例2至實(shí)施例5中的各項(xiàng)試驗(yàn)。4、將步驟3的純化后多肽進(jìn)行質(zhì)譜和反相HPLC鑒定。(1)質(zhì)譜鑒定預(yù)期分子量4531. 39 ；流速0. 2毫升/分鐘；運(yùn)行時(shí)間1分鐘；
緩沖液A 含0. 1 % (體積百分含量)甲酸的水溶液；緩沖液B 含0. 1% (體積百分含量)甲酸的乙腈溶液。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明多肽II如序列表的序列5所示，多肽I如序列表的序列1所示、多肽III如序列表的序列6所示(見圖1)、多肽IV如序列表的序列7所示、多肽V如序列表的序列8所示、多肽VI如序列表的序列9所示(見圖2)、多肽VII如序列表的序列10 所示、多肽VIII如序列表的序列11所示(見圖3)，多肽IX如序列表的序列12所示(見圖 4)；多肽I如序列表的序列1所示(見圖5)。(2)反相 HPLC 鑒定的參數(shù)如下洗脫時(shí)間為25分鐘，流速為lml/min，上樣量為10uL，檢測(cè)波長為220nm。柱子型號(hào)為Kromasil 100-5C18，4. 6mmX250mm，5 micron。洗脫液A為0.1% (體積比)三氟乙酸水溶液，洗脫液B為0. (體積比)三氟乙酸乙腈溶液。洗脫液總體積為100%，起始時(shí)刻的洗脫液為洗脫液A，終止時(shí)刻的洗脫液為洗脫液B，起始時(shí)刻和終止時(shí)刻之間的洗脫液為洗脫液A和洗脫液B的混合液，洗脫過程中，洗脫液A由100%線性下降至0%，洗脫液B由0%線性上升至100%，收集洗脫液B占洗脫液總體積的10% -50%的過柱后溶液。多肽II的反相HPLC譜圖見圖6，分析結(jié)果見表1，純度為49.觀％。表1多肽II的反相HPLC分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用。
2.含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽在制備輔助鑒定動(dòng)物是否感染狂犬病病毒的試劑中的應(yīng)用。
3.—種狂犬病疫苗，它的活性成分為含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽。
4.一種輔助鑒定動(dòng)物是否感染狂犬病病毒的試劑，它的活性成分為含有序列表的序列 1所示多肽片段的多肽。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的應(yīng)用或疫苗或試劑，其特征在于所述多肽還包括序列表的序列3所示多肽片段和/或序列表的序列4所示多肽片段。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的應(yīng)用或疫苗或試劑，其特征在于所述多肽還包括序列表的序列2所示多肽片段。
7.如權(quán)利要求1至4中任一所述的應(yīng)用或疫苗或試劑，其特征在于所述多肽為如下 ⑴至(9)中的任意一種(1)序列表的序列8所示的多肽；(2)序列表的序列5所示的多肽；(3)序列表的序列6所示的多肽；(4)序列表的序列12所示的多肽；(5)序列表的序列11所示的多肽；(6)序列表的序列7所示的多肽；(7)序列表的序列10所示的多肽；(8)序列表的序列9所示的多肽；(9)序列表的序列1所示多肽。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的應(yīng)用或疫苗或試劑，其特征在于所述多肽為活化后的多肽。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用或疫苗或試劑，其特征在于所述活化的方法如下將所述多肽在含有15% DMSO和0. 9mM氧化性谷胱甘肽的Tris-HCl緩沖液中溶解，4°C靜置48小時(shí)。
10.含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽，為如下⑴至(9)中的任意一種(1)序列表的序列8所示的多肽；(2)序列表的序列5所示的多肽；(3)序列表的序列6所示的多肽；(4)序列表的序列12所示的多肽；(5)序列表的序列11所示的多肽；(6)序列表的序列7所示的多肽；(7)序列表的序列10所示的多肽；(8)序列表的序列9所示的多肽；(9)序列表的序列1所示多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異多肽在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了含有序列表的序列1所示多肽片段的多肽在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的疫苗(合成肽疫苗)，由B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位組成。該疫苗可誘發(fā)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生保護(hù)性抗體，并引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而有效清除病毒，起到免疫保護(hù)作用。由于不涉及狂犬病活病毒，該疫苗安全可靠。并且，該疫苗的活性成分為短肽，可以人工合成，大大降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C07K14/145GK102380094SQ20111030646
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者劉文軍, 孫蕾, 李晶, 楊利敏, 畢玉海 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所