專利名稱：擬南芥熱激因子HSFA1d特異cDNA 片段的原核表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)擬南芥熱激因子HSFAld 特異cDNA片段(Δ C j tHsfAld)的原核表達(dá)載體pET32a_ Δ C~A tHsfAld及其在制備 Δ C-AtHsfAld重組蛋白中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
HsfAld是擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)家族成員之一?；谥参锊煌l(fā)育階段、不同組織和不同脅迫條件誘導(dǎo)下mRNA水平Hsf表達(dá)譜的分析數(shù)據(jù)，植物Hsfs被認(rèn)為能廣泛的參與熱、光照、臭氧、H2O2、鹽、干旱、冷、損傷和病原菌侵害等多種脅迫應(yīng)答，且不同的Hsf 成員可能受不同的脅迫條件所誘導(dǎo)、從而特異性地在不同的脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用(Miller and Mittler, 2006; Pascal et al.，2006)。因此，通過對(duì)不同Hsf成員在不同誘導(dǎo)條件下，不同Hsf家族成員mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)量的檢測(cè)，有助于探知各Hsf的功能。擬南芥有包括HsfAld在內(nèi)的21個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子家族成員，生物信息學(xué)的分析表明，它們具有相同的結(jié)構(gòu)域組成，包括DNA結(jié)合域、寡聚域、核定位信號(hào)和C末端的激活域。 對(duì)HsfAld序列相似性的分析表明，HsfAld與擬南芥中其它Hsf成員在DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上有較高的同源性。目前，有關(guān)逆境脅迫下HsfAld表達(dá)水平檢測(cè)的研究，主要集中在mRNA 水平，未涉及HsfAld特異抗體的制備和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)特性分析。Yamada等為了驗(yàn)證 HsfAld在體外與熱激轉(zhuǎn)錄元件HSE3的相互作用，將全長(zhǎng)HsfAld與pET3h融合，成功的表達(dá)了全長(zhǎng)HsfAld活性蛋白并檢測(cè)到其在體外與HSE3的相互作用(Yamada et al. , 2007)。 但此蛋白并未用于HsfAld抗體制備，且它針對(duì)的是HsfAld的全長(zhǎng)序列，未考慮特異性的因素，也不適合用于HsfAld特異抗體的制備和蛋白水平HsfAld的定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥熱激因子HSFAld特異cDNA片段Δ C-AtHsfAld 的原核表達(dá)載體pET32a- Δ C-AtHsfAld,該載體含有Τ7啟動(dòng)子和終止子、一個(gè)由6個(gè)氨基酸組成的組氨酸標(biāo)簽His-Tag和HsfAld的cDNA特異性片段序列Δ Cli^i^i/； 其中Δ CM tHsfAld基因的上游有T7啟動(dòng)子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，T7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠Δ/片段的起始密碼子上游是一個(gè)
由6個(gè)氨基酸組成的組氨酸標(biāo)簽序列His-Tag ；載體中的Δ CMiifei^i/基因來源于擬南芥(Arabidopsis thaiiana,生態(tài)型 Col) HsfAld 的 cDNA，在 GenBank 中的登錄號(hào)為 AT1G32330。利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，可實(shí)現(xiàn)Δ C-A tHsfAld蛋白的高水平表達(dá)，且在BL21系統(tǒng)中表達(dá)可溶性的Δ C-AtHsfAld蛋白，通過HisTrap親和柱和割膠純化的 Δ C-AtHsfAld重組蛋白質(zhì)，可用于HSFAld特異性抗體的制備。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案1、Δ C-AtHsfAld cDNA 片段的擴(kuò)增
從GenBank中查找擬南芥21個(gè)HSF家族成員的蛋白質(zhì)序列，通過Cluster XI. 0分析， 選取AtHsfAld蛋白質(zhì)序列中特異性區(qū)段，即氨基酸332-氨基酸485。并將該特異區(qū)段命名為Δ C-AtHsfAld0從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Δ Cjiifei^i/蛋白區(qū)段對(duì)應(yīng)的cDNA序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物
Sense primer 5' CGGAATTCTCTGAGATACAGTCATCATCACC3'； Antisense primer 5' CCGCTCGAGTAGGATTTTGCCTTGAGAGAT 3'； 上游引物(Sense primer) 5，端添加EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物(Antisense primer) 5'端添加BioI酶切位點(diǎn)。以擬南芥第一鏈cDNA為模版擴(kuò)增，通過PCR擴(kuò)增得到 Δ C-AtHsfAld 的 cDNA 片段。原核表達(dá)載體pET32a_ Δ C~A tHsfAld的構(gòu)建
(1)回收并純化ΔC-AtHsfAld的cDNA片段，并將其連接到TA克隆載體pMD18_T上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD18-T- Δ C-AtHsfAld ；
(2)EcoRI 和 XhoI 完全酶切 pMD18_T_ Δ C-AtHsfAld 和 pET32a，并分別回收 Δ 和載體片段pET3h，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和酶切檢測(cè)，獲得原核表達(dá)載體pET32a- Δ C-AtHsfAld0重組Δ C-AtHsfAld蛋白原核表達(dá)條件的優(yōu)化
用pET32a- Δ C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子菌落，用
IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)Δ C-AtHsfAld重組蛋白，并對(duì)表達(dá)時(shí)間、IPTG濃度和溫度條件進(jìn)行優(yōu)化，確定重組蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所表達(dá)的Δ C-AtHsfAld重組蛋白分子量為50 kDa左右，該蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件為為0. 5mM IPTG于誘導(dǎo)他。SDS-PAGE分析確定Δ C-AtHsfAld重組蛋白以可溶性的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞中。重組Δ C-AtHsfAld蛋白的純化
用HisTrap親和層析柱分離純化可溶性Δ C-AtHSFAld重組蛋白，利用不同濃度咪唑洗脫(5mM，10 mM,20 mM,30 mM,40 mM,50 mM,70 mM，100 mM，150 mM,200 mM，300 mM，350 mM, 400 mM,500 mM)親和層析柱，收集洗脫液。通過SDS-PAGE跑膠分析不同濃度咪唑洗脫液中的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一條雜帶和Δ C-AtHSFAld重組蛋白帶相距很近，無法通過親和層析去除，因而通過HisTrap親和之后的含有Δ C-AtHsfAld重組蛋白的洗脫溶液在SDS-PAGE 膠中分離后，通過割膠回收獲得相對(duì)較純的Δ C-AtHsfAld重組蛋白，可用于HsfAld特異抗體的制備。


圖1是擬南芥熱激因子他以似特異cDNA片段(Δ C-AtHsfAld)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。A是Δ C-AtHsfAld的特異cDNA片段的電泳檢測(cè)，以擬南芥第一鏈cDNA為模版擴(kuò)增，經(jīng) PCR 擴(kuò)增得到Δ C-A tHsfAld 的 cDNA 片段，M =Maker ； 1-10 Δ C~A tHsfAld 的特異 cDNA 片段擴(kuò)增帶；11 用水做模板做負(fù)對(duì)照；
B 是割膠回收獲得Δ C-AtHsfAlcI 的 cDNA 片段，M =Maker ；1 :Δ C-AtHsfAlcI 的 cDNA 片段。圖2是Δ C-AtHsfAld的cDNA片段TA克隆策略圖。
圖 3 是 PMD18-T- Δ C~A tHsfAld 質(zhì)粒電泳檢測(cè)圖。A 是 pMD18_T_ Δ C~A tHsfAld 質(zhì)粒的菌落PCR檢測(cè)，1-9 :pMD18-T- Δ C重組質(zhì)粒；10 負(fù)對(duì)照；M =Maker ；
B是重組質(zhì)粒pMD18-T- Δ C-AtHsfAid檢EcoRI和XhoI (單)雙酶切檢測(cè)，1 =XhoI酶切；2 =EcoRI 酶切；3 =EcoRI 和 XhoI 雙酶切；M =Maker0圖4是Δ C-AtHsfAld原核表達(dá)載體構(gòu)建策略圖。圖5是Δ C-AtHsfAld基因原核表達(dá)載體的電泳檢測(cè)圖。A是重組質(zhì)粒 pET32a- Δ C-AtHsfAld的菌落PCR檢測(cè)，M =Maker ； 1-9 挑取的單菌落；10 用水做模板做負(fù)對(duì)照；
B是重組質(zhì)粒pET32a- Δ C-AtHsfAlcI的雙酶切檢測(cè)，M =Maker ；1 =EcoRI和XhoI雙酶切 pET32a- Δ C-AtHsfAlcI0圖6是Δ C-AtHsfAld重組蛋白原核表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)形式的鑒定。A是Δ C-AtHsfAld重組蛋白表達(dá)條件的時(shí)間優(yōu)化。M =Maker ； 1 :pET32a未用 IPTG 誘導(dǎo)；2 :pET32a 使用 IPTG 誘導(dǎo)；3 :pET32a- Δ C-AtHsfAld 未用 IPTG 誘導(dǎo)；4 ρΕΤ3^ι-Δ用 IPTG 誘導(dǎo) 2h;5: ρΕΤ3^ι-Δ C用 IPTG 誘導(dǎo) 4h;6: pET32a- Δ C-Ji他/At/用 IPTG 誘導(dǎo) 8h ；
B是Δ C-AtHsfAld重組蛋白表達(dá)條件的IPTG濃度和溫度優(yōu)化； C是Δ C-AtHsfAld重組蛋白表達(dá)形式的鑒定。圖7是Δ C-AtHsfAld重組蛋白的親和層析純化SDS-PAGE檢測(cè)圖，采用利用不同咪唑濃度通過HisTrap親和柱洗脫蛋白。圖8是通過SDS-PAGE割膠回收純化的Δ C-AtHsfAld重組蛋白，取150 mmol/L咪唑洗脫蛋白樣品進(jìn)行割膠回收。M =Maker ；1: Δ C-AtHsfAld重組蛋白。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中采用的試劑主要為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑，各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所用引物序列均在上海生工合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 擬南芥熱激因子HsfAld特異性cDNA片段(Δ C-AtHsfAld)的制備與檢測(cè)
從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb. cbi.pku. edu. cn/xiehe/datf/ browsefamily. phpfamiIyname=HSF)下載擬南芥 21 個(gè) Hsf 蛋白質(zhì)的序列，運(yùn)用 Cluster X 1. O進(jìn)行序列相似性分析，結(jié)果表明HsfAla、HsfAlb和HsfAle等3個(gè)序列與HsfAld相似性最高。為進(jìn)一步比較以上3個(gè)相似性高序列，對(duì)HsfAla、HsfAlb, HsfAle和HsfAld等4 個(gè)蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行了比對(duì)，選擇Ji他以A/ (AT1G32330)蛋白質(zhì)序列中氨基酸332-氨基酸485的特異性肽段，即Δ C-AtHsfAld。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Δ C-AtHsfAld肽段對(duì)應(yīng)的 cDNA序列(Δ C-AtHsfAld)。Δ C-AtHsfAld的擴(kuò)增策略見圖2。依據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得 Δ C片段對(duì)應(yīng)的cDNA序列，并針對(duì)該序列設(shè)計(jì)如下引物對(duì)
5Sense primer 5' CGGAATTCTCTGAGATACAGTCATCATCACC 3'；
Anti-sense primer 5' CCGCTCGAGTAGGATTTTGCCTTGAGAGAT 3'
上(Sense primer)、下(Anti-sense primer)游引物 5，端分別添加了 EcoRI 和 XhoI 酶切位點(diǎn)。以擬南芥第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)混合液組成為Taq反應(yīng) 10XBuffer, 2. 5μ , 50ng 的Δ C-AtHsfAld 特異性上下游引物(Sense primer 和 Anti-sense primer), 1. 6μ dNTP (2.5 mM),0. 1 μ 的 EX Taq DNA 聚合酶(5U/mL)，1· 5μ 擬南芥第一鏈cDNA，加ddH20使反應(yīng)終體積為25 μ 。PCR反應(yīng)條件為94°C加熱3分鐘，然后按照94°C、30秒，62°C、30秒，72°C、30s的程序進(jìn)行31個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在72°C延長(zhǎng)反應(yīng)10分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到Δ C-AtHsfAld片段的cDNA (圖 1A)，割膠回收Δ C-AtHsfAlcim異 cDNA 片段(圖 1B)。實(shí)施例2 Δ C j tHsfAld特異cDNA片段的TA克隆
回收得到的Δ C-AtHsfAld特異cDNA片段，用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒亞克隆到pMDlS-T (大連寶生物公司)載體上，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒的說明書進(jìn)行，反應(yīng)過夜后用反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α (購(gòu)自天根生化科技公司)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，在PCR反應(yīng)混合液中加入單菌落，50ng的特異性上下游引物(knse primer 和 Anti- sense primer), 1. 6μ dNTP (2.5 mM),0. 1 μ 的 Taq DNA 聚合酶(5U/mL)， IOXBuffer (2. 5μ )，加雙蒸水使反應(yīng)終體積為25ml。在PCR儀上于94°C加熱3分鐘，然后按照94°C、30秒，62°C、30秒，72°C、30秒的程序進(jìn)行四個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在72°C延長(zhǎng)反應(yīng)10分鐘的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。反應(yīng)完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落是否是陽性轉(zhuǎn)化子(圖3A)。將檢測(cè)正確的菌落，接種到5ml的帶有氨芐抗性的LB中，37°C培養(yǎng)10 個(gè)小時(shí)左右。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA(pMD18-T- Δ C-AtHsfAid),重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和 XhoI (單)雙酶切后檢測(cè)，檢測(cè)正確的重組質(zhì)粒帶有約500bp大小的條帶(圖;3B)。測(cè)序分析證明重組質(zhì)粒載體中插入的Δ Cj tHsfAld序列正確。實(shí)施例3 原核表達(dá)載體pET32a_ Δ C-AtHsfAld的構(gòu)建
pET32a- Δ C構(gòu)建策略如圖4所示，用EcoRI和XhoI (均來自Fermentas)切
開純化的原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET3h(購(gòu)自Novagen公司)和pMD18_ Δ C j^s/Wi/，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收PET3M被切割后產(chǎn)生的載體片斷(5. 9kb)及 pMD18- Δ Cj 他/Wi/被切割產(chǎn)生的Δ C-AtHsfAld 的 cDNA 片段(0. 5kb), 然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pET3h載體片斷和Δ C產(chǎn)生原核
表達(dá)載體pET32a- Δ C-AtHsfAld0用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5 α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐抗性(Amp，100 μ g/ml)的平板上，于37°C過夜培養(yǎng)，篩選Amp抗性重組子菌落，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR初步檢測(cè)(圖 5A)，將檢測(cè)正確的菌落，接種到5ml的帶有氨芐抗性的LB中，37°C培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)左右。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BioI雙酶切后檢測(cè)，檢測(cè)正確的重組質(zhì)粒帶有約500bp大小的條帶(圖5B)。實(shí)施例4 重組Δ C-AtHsfAld蛋白的表達(dá)與表達(dá)條件的優(yōu)化
將pET32a- Δ C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞。首先進(jìn)行時(shí)間的
優(yōu)化挑取單菌落加入2mL LB (含有Amp 100mg/L)中，37°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物到新的試管，每管2ml，37°C活化菌體濃度達(dá)OD6qq=O. 6-0. 8，分別加入1. OmM的IPTG于28°C誘導(dǎo)0，2h, 4h, 8h，12000 rpm離心30min收集每種處理的菌體，以washing buffer (10 mM Tris-HCl, pH7. 5)洗滌菌體，加入ΙΟΟμ 細(xì)菌蛋白裂解液并重懸菌體獲得總蛋白，加入 25μ 5 X loading buffer,煮沸5min進(jìn)行SDS-PAGE (圖6A)。再次進(jìn)行IPTG濃度和溫度的優(yōu)化對(duì)于IPTG濃度優(yōu)化，采用溫度是觀！，誘導(dǎo)時(shí)間是8h，IPTG濃度分別為0. 5 mM IPTG 和ImM IPTG ；對(duì)于溫度優(yōu)化，采用ImM IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間是8h。溫度分別為和37°C (圖6B)。最終確定表達(dá)條件為0. 5mM IPTG，和誘導(dǎo)時(shí)間是他。在進(jìn)行重組蛋白的大量表達(dá)時(shí)，挑取單菌落入1 L LB (含有Amp濃度為100 mg/ L)中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl值約為0.6;加0.5 mM IPTG誘導(dǎo)后8 h，離心收集菌體，用10 mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)洗滌菌體2次，加入30mL蛋白抽提緩沖液(磷酸鈉緩沖液(ρΗ 7. 4) 20 mM),懸浮菌體；在冰浴中超聲波破碎(工作4秒，停10秒，功率30 W，全程30 min)大腸桿菌菌體細(xì)胞。于4°C離心(18000 rpm)離心半小時(shí)，得到上清和沉淀，取上清液與沉淀，加入 5XSDS-PAGE上樣緩沖液，通過SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)的形式。SDS-PAGE電泳結(jié)果明重組Δ C-AtHSFAld蛋白以可溶性的形式存在于上清液中。實(shí)施例5 重組Δ C-AtHsfAld蛋白的純化
上清液過0. 23um濾膜，用親和層析柱分離純化可溶性Δ C-AtHsfAld重組蛋白。參看His-Trap HP說明書，首先用5柱體積純水洗柱，用5柱平衡緩沖液(磷酸鈉緩沖液 (ρΗ7. 4)20 mmol/L,5 mM咪唑)平衡柱子，然后上蛋白樣品，用5柱體積濃度為5mM，10 mM, 20 mM,30 mM,40 mM,50 mM,70 mM,100 mM,150 mM,200 mM,300 mM,350 mM,400 mM,500 mM 的咪唑緩沖液(20 mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH7. 4,0. 5mM NaCl，咪唑)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，每管4mL。最后用分別用5柱體積純水和5柱體積20%乙醇洗柱。測(cè)定及各洗脫液中蛋白的濃度，用50ug跑SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的純度(圖7)。圖7的數(shù)據(jù)說明Δ C-AtHsfAld 重組蛋白在100mM、150mM的咪唑緩沖液中被洗脫下來，但是含有一條雜帶。采用割膠回收純的Δ C-AtHsfAld重組蛋白，其中采用100mM、150mM的咪唑緩沖液上樣，SDS-PAGE分離Δ C-AtHsfAld重組蛋白條帶。方法如下(1)透析袋的預(yù)處理剪取適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20cm)的透析袋(截留范圍為8000-12000Da)；置于大體積的^)(W/V)碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA (pH8. 0)中，煮沸10分鐘；蒸餾水徹底清洗透析袋；置于lmmol/L EDTA(pH8. 0)溶液中再次煮沸10分鐘；冷卻后4°C保存；(2)制膠將分離膠灌好后，直接灌上濃縮膠，不需要插梳子，在濃縮膠上留幾厘米空間的加樣；(3)將樣品直接加到濃縮膠上，形成一個(gè)藍(lán)色的樣品帶；(4)電泳時(shí)間一般池左右，濃縮膠時(shí)采用60V電壓，分離膠時(shí)采用90V電壓，電泳至溴酚藍(lán)全部跑出膠外；(5)將分離膠取出，采用氯化鉀(0. 25mol/L)進(jìn)行染色15min; (6)染色結(jié)束之后，將Δ C-AtHsfAld重組蛋白帶切下，再將膠切成小片狀，裝入透析袋；(7)將透析袋加入電泳緩沖液，放入電泳槽中。100V電壓電泳4-5h，目的蛋白即電洗脫到透析袋的緩沖液中；(8)洗脫完畢，吸出透析袋內(nèi)溶液，SDS-PAGE檢測(cè)電泳結(jié)果， 鑒定正確的蛋白溶液裝入干凈的透析袋中，用預(yù)冷的IXPBS溶液于4°C下透析過夜，其間換透析液2-3次，最終獲得純的Δ C-AtHsfAld重組蛋白，可用于AtHsfAld抗體的制備。
權(quán)利要求
1.擬南芥熱激因子HSFAld特異CDNA片段的原核表達(dá)載體，其特征在于該載體含有T7 啟動(dòng)子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)由6個(gè)氨基酸組成的組氨酸標(biāo)簽和HsfAld特異 cDNA 片段序列Δ C-AtHsfAlcI0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，其特征在于基因的上游有Τ7 啟動(dòng)子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，Τ7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠Δ C/基因片段的起始密碼子上游是一個(gè)由6個(gè)氨基酸組成的組氨酸標(biāo)簽序列 His-Tag0
3.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，載體中的熱激因子HSFAld特異cDNA片段來源于擬南芥，在GenBank中的登錄號(hào)為AT1G32330。
4.權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體在制備擬南芥熱激因子HSFAld特異肽段重組蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)擬南芥熱激因子HSFA1d特異cDNA片段(△C-AtHsfA1d)的原核表達(dá)載體pET32a--△C-AtHsfA1d及其應(yīng)用。該載體是含有擬南芥熱激因子HSFA1d特異cDNA片段的原核表達(dá)載體，本發(fā)明從擬南芥中擴(kuò)增出HSFA1d特異cDNA片段△C-AtHsfA1d，用用T7啟動(dòng)子控制它在大腸桿菌中的表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)以可溶性形式存在于上清中，通過HisTrap親和柱和割膠純化△C-AtHsfA1d重組蛋白質(zhì)，用于HSFA1d特異抗體的制備。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102363789SQ20111030649
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者嚴(yán)金平, 張道君, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)