專利名稱：衍生自線性雞β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種衍生自線性雞β -防御素 4 (RL38)的抗菌肽GLI23及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體內(nèi)廣泛存在一種具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特異性防御系統(tǒng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，具有廣譜抗菌和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性?？咕挠捎谄渲饕ㄟ^物理滲透作用于細(xì)菌胞膜而產(chǎn)生抑菌或者殺菌作用，而細(xì)菌等微生物很難改變其自身磷脂雙分子層的胞膜結(jié)構(gòu)，因此使得抗微生物肽產(chǎn)生耐藥性的幾率大大降低。因此，抗菌肽的研究已成為基因工程和藥物開發(fā)等領(lǐng)域的研究熱點，具有極為廣闊的市場應(yīng)用前景。目前，上千種抗菌肽已經(jīng)從各種動植物體中提取出來，但作為抗生素替代品用于醫(yī)療領(lǐng)域的天然抗菌肽卻很少。限制天然抗菌肽成為抗生素替代物的一個重要原因是天然抗菌肽對于正常細(xì)胞，比如紅細(xì)胞等也造成溶血作用，那么，尋找一種提高抗菌肽細(xì)胞選擇性的方法勢在必行。細(xì)胞選擇性是抗菌肽對不同細(xì)胞的不同選擇性作用而言的。對有害微生物有抑制或殺傷作用，而對正常細(xì)胞沒有毒性的抗菌肽具有較高的細(xì)胞選擇性。抗菌肽的細(xì)胞選擇性越高，說明成為抗生素替代品的可行性越大。細(xì)胞選擇性可以用抗菌肽的治療指數(shù)來評價。防御素是參與機體最初防御活動的小分子多肽，是一類極為重要的內(nèi)源性抗菌肽，具有廣譜的抗菌活性，能有效地殺滅細(xì)菌、真菌、螺旋體和囊膜病毒，在機體的先天性免疫及獲得性免疫中均發(fā)揮著重要的作用。雞抗菌肽屬防御素，為防御素的一個亞類。 與其它動物抗菌肽類似，雞β-防御素在禽類的先天性免疫及獲得性免疫中也發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種衍生自線性雞β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的線性雞β -防御素4 (RL38)的氨基酸序列為Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro151015Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro ；202530Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu-NH23538
通過截取線性雞β-防御素4(RL38)的羧基末端的23個氨基酸，得到含有4個正電荷，疏水值為-0. 3的兩條多肽。獲得的一條肽GL23，其氨基酸序列為Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro161015;Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu—NH22023GL23的第一個氨基酸是甘氨酸以提高其穩(wěn)定性。再將GL23肽鏈中的四個半胱氨酸替換成異亮氨酸，得到GLI23，其氨基酸序列為Gly Lys lie Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu lie Arg Pro161015 ；Lys Tyr Ser lie lie Arg Trp Leu-NH22023其正電荷含量為4個，疏水值提高到0.03。三條肽的羧基末端酰胺化以提高一個正電荷并增加肽的穩(wěn)定性。通過截取或替代的方法簡化雞β -防御素4并提高其細(xì)胞選擇性，使其具有成為抗生素替代物的發(fā)展?jié)摿?。通過該方法在不降低抗菌肽殺菌活性的情況下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞之間的選擇性，提高了其成為抗生素替代物的發(fā)展?jié)摿Α?br> 具體實施例方式實施例1 抗菌肽的設(shè)計線性雞β -防御素4的氨基酸序列為Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro151015Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro ；202530Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu-NH23538通過截取線性雞β -防御素4 (RL38)的羧基末端的23個氨基酸，得到含有4個正電荷，疏水值為-0. 3，的兩條多肽。獲得的一條肽GL23，其氨基酸序列為Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro161015 ；Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu—NH22023GL23的第一個氨基酸是甘氨酸以提高其穩(wěn)定性。再將GL23肽鏈中的四個半胱氨酸替換成異亮氨酸，
得到GLI23，其氨基酸序列為Gly Lys lie Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu lie Arg Pro161015 ；Lys Tyr Ser lie lie Arg Trp Leu-NH22023其正電荷含量為4個，疏水值提高到0.03。通過改造獲得的GL23和GLI23均具有較高的細(xì)胞選擇性。三條肽的羧基末端酰胺化以提高一個正電荷并增加肽的穩(wěn)定性。實施例2 抗菌肽的合成和生物活性測定使用多肽合成儀，利用固相合成法合成上述抗菌肽，并對抗菌肽的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定分析。2. 1抗菌活性將肽配置成為一定儲存液以備使用。利用平板計數(shù)法測定幾種抗菌肽的最小殺菌濃度。以IOmM磷酸鈉溶液(pH 7.4)作為稀釋液，使用二倍稀釋法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100 μ 1置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后分別添加等體積的待測菌液 (IO6個/ml)于各孔中。37°C恒溫培養(yǎng)池。然后取適量上述液體稀釋涂于瓊脂板上，37°C 恒溫培養(yǎng)1 后計數(shù)。以肽殺菌的最小肽的濃度作為最小殺菌濃度(LC)。2. 2溶血活性采集人的新鮮血液lmL，肝素抗凝后溶解到anlPBS溶液中，IOOOg離心5min，收集紅細(xì)胞；用PBS洗滌3遍，再用IOml PBS重懸；取50 μ L紅細(xì)胞懸液與50 μ L用PBS溶解的不同濃度的抗菌肽溶液混合均勻，在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育Ih ； Ih后取出，4°C、IOOOg離心 5min ；取出上清液用酶標(biāo)儀在570nm處測光吸收值；每組取平均值，并比較分析。其中50 μ L 紅細(xì)胞加50 μ 1 PBS作為陰性對照；50 μ L紅細(xì)胞加50 μ 1 0. Tritonx-100作為陽性對照。最小溶血濃度是抗菌肽引起5%溶血率時的抗菌肽濃度。2. 3治療指數(shù)細(xì)胞選擇性可以用抗菌肽的治療指數(shù)來評價。治療指數(shù)定義為抗菌肽的最小溶血濃度與最小殺菌濃度的幾何平均數(shù)的比值。例如當(dāng)肽的濃度在Κ8μΜ仍然沒有溶血，那么通常用256μΜ(Κ8μΜΧ2)作為其最小溶血濃度用于計算。治療指數(shù)值越大，該抗菌肽對細(xì)菌微生物具有更高的抑菌活性而同時又保持較低的細(xì)胞毒性，說明抗菌肽具有更高的細(xì)胞選擇性。表1為RL38及GL23和GLI23的氨基酸組成及物理特征。經(jīng)過質(zhì)譜法對分子量進(jìn)行分析，理論分子量和實際分子量吻合。表2為抗菌肽的細(xì)胞選擇性。通過表2可以看出3條抗菌肽對革蘭氏陰性和陽性菌都表現(xiàn)出了較高的抑菌活性，其中總體上抑菌活性的高低順序是RL38 = GLI23 > GL23。 RL38最小溶血濃度為16uM，說明其具有較高的溶血活性，而GL23和GLI23在時仍沒有表現(xiàn)出溶血活性，說明二者在細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞之間具有一定選擇性。表1抗菌肽的氨基酸片段、分子量、電荷和疏水值
權(quán)利要求
1.一種衍生自線性雞β-防御素4 (RL38)的抗菌肽GLI23的制備方法，其特征在于，方法如下線性雞β-防御素4的氨基酸序列為Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro151015Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro ；202530Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu-NH2 3538通過截取線性雞β-防御素4 (RL38)的羧基末端的23個氨基酸，得到含有4個正電荷， 疏水值為-0. 3，的兩條多肽；其中獲得的一條肽GL23，其氨基酸序列為Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro 161015 ；Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu—NH22023再將GL23肽鏈中的四個半胱氨酸替換成異亮氨酸， 得到GLI23，其氨基酸序列為Gly Lys lie Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu lie Arg Pro 161015。Lys Tyr Ser lie lie Arg Trp Leu—NH2 2023
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種衍生自線性雞防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23的制備方法制得的一種抗菌肽GLI23，其特征在于，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種衍生自線性雞β-防御素4(RL38)的抗菌肽GLI23及其制備方法。本發(fā)明采用定點氨基酸片段截取和氨基酸替代的方法，簡化線性雞β-防御素4得到兩條多肽。對其抗菌和溶血活性進(jìn)行測定，計算其治療指數(shù)，評價兩條肽對細(xì)胞的選擇性。研究發(fā)現(xiàn)，截取肽GL23和氨基酸替換后的肽GLI23都具有明顯的殺菌活性。并且與雞β-防御素4相比，二者的溶血活性顯著降低。尤其是GLI23，其治療指數(shù)高達(dá)76.1。通過該方法在不降低抗菌肽殺菌活性的情況下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞之間的選擇性，提高了其成為抗生素替代物的發(fā)展?jié)摿Α?br> 文檔編號C07K14/465GK102382186SQ20111030858
公開日2012年3月21日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者單安山, 董娜, 馬清泉 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)