專利名稱：一種特異識別血小板α_IIbβ₃的抗栓藥物RWR的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)多肽領(lǐng)域，具體地講，涉及一種能夠特異識別血小板表面整合素α IIb β 3的多肽及其制備和應用。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病如心肌梗死、腦梗塞是一種嚴重威脅人類健康的重大疾病，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達1500萬人，居各種死因首位。心腦血管疾病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復發(fā)率高，并發(fā)癥多即“四高一多”的特點，已成為人類死亡病因最高的頭號殺手。即使應用目前最先進、完善的治療手段，仍有50%以上心腦血管疾病幸存者生活不能自理。眾多心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展都和病理性血栓形成有關(guān)。迄今已用于臨床的血栓抑制劑有很多種。傳統(tǒng)的溶栓抗栓藥物雖具有一定的抑制血栓生成作用，但其局限性不容忽視。例如溶栓藥尿激酶、鏈激酶，TPA等在不同程度上存在著特異性差，需用量大，有出血傾向以及使用后再次栓塞等缺點，抗栓藥阿斯匹林對高切應力所致的血小板活化無抑制作用，而且當冠脈狹窄程度增加時抗栓效果減弱。而且現(xiàn)有絕大多數(shù)的抗血小板聚集藥，只能阻止血小板活化途徑中的一條通路，當某一特定通路被充分抑制時，血小板仍可通過其它途徑活化，引起血小板聚集?；趥鹘y(tǒng)血栓生成抑制劑的局限性，科學家們?nèi)栽诶^續(xù)研究新的血栓抑制劑，不斷探索療效確切、成本低廉的抗血栓藥。血栓形成的共同通路也即關(guān)鍵環(huán)節(jié)是纖維蛋白α鏈的RGD(Arg-Gly-Asp)模體特異識別血小板表面α IIb β 3受體，介導纖維蛋白與血小板的結(jié)合，該過程猶如鏈條，把相鄰的血小板連在一起，形成血栓。由于R⑶模體具有與α IIb β 3受體特異結(jié)合的特性，因此含有RGD序列的多肽即可以競爭性抑制纖維蛋白與血小板的結(jié)合，從而抑制血栓形成，即可以阻斷血栓形成的最后通路。RGD是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸組成的三肽。1984年P(guān)iersctAacher和 Ruoslahti首次確定了 RGD序列為人纖維連接蛋白與其受體結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)RGD廣泛存在于細胞識別系統(tǒng)?；|(zhì)蛋白中的RGD是與細胞表面特異受體相互作用的識別位點，這些細胞表面膜蛋白是廣泛分布的超級家族-粘附受體的成員，稱為整合素。整合素在正常情況下無活性，一旦在激素，細胞因子或其它因素的刺激下，其構(gòu)型和親合力發(fā)生改變，整合素受體與特異性配體的RGD結(jié)構(gòu)結(jié)合，引起細胞內(nèi)一系列生化改變，進而影響多種組織細胞功能的調(diào)控，包括細胞凋亡，分化，增殖，遷移，粘附，血小板聚集等一系列病理生理過程。國內(nèi)外對RGD多肽的生物學活性進行的大量研究，證明了 RGD多肽在疾病治療方面具有廣闊的應用前景。RGD及類似物對預防和治療心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松以及由細胞粘連異常而導致的腫瘤等疾病具有重要作用，人工合成的RGD多肽或化合物也具有類似的生物學活性，含有R⑶多肽已成為醫(yī)學研究的熱點。1991年J. Samanen等合成了一系列含有 RGD序列的小肽，經(jīng)過藥理活性試驗發(fā)現(xiàn)了它們可抑制纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，抑制血栓的形成。眾多實驗研究表明，RGD多肽作為ciIIbi33受體拮抗劑，可以阻斷血栓形成的最終通路，理論上具有徹底抑制血栓形成的功能。目前一些科學家通過人工合成一些RGD序列的小肽進行基礎(chǔ)及臨床試驗，已取得一定的成果。如RGDS，DRGDW，GRGDSPA等都可抑制纖維蛋白與血小板結(jié)合，抑制血栓形成。 新近的實驗研究表明，用氨基酸替代法研究RGD與血小板α IIbi3 3結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，用Val取代Arg將使RGD的活性降低10倍，用Ala取代Gly出現(xiàn)類似結(jié)果，用Glu取代 Asp將使其功能完全喪失。逆轉(zhuǎn)RGDS和RGDV序列將使其對血小板抑制功能完全喪失。另有實驗研究表明，GRGDSP六肽(Gvy-Ay-Gy-Asy-Ser-Pro)可直接抑制纖維蛋白(Fg)與血小板的結(jié)合；Eward等發(fā)現(xiàn)RGDS明顯抑制Fg和ADP激活的血小板結(jié)合；Rote等發(fā)現(xiàn)含RGD 序列的SC-4992呈量依賴抑制血栓形成，抑制ADP和花生四烯酸引起的血小板聚集。其中 RGD序列是高度保守的，是識別受體必需的。天然存在的含RGD的多肽和人工合成含RGD的小肽，一般都具有相似的功能，既可以抑制血栓形成、也具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松的功能。因此，RGD類似物作用廣泛但不特異，如何提高其作用的特異性及活性，是研究人員的關(guān)注熱點，也是本課題組多年來的研究重點。近年來，本實驗室通過突變Echistatin RGD模體周邊部分氨基酸，得到兩種不同的突變體，建立了這兩種突變體的基因工程生產(chǎn)工藝，并進行了藥效學研究，系統(tǒng)研究了 RGD周邊氨基酸的變化對其活性的影響，在RGD模體周邊氨基酸突變研究方面積累了不少的經(jīng)驗。研究表明，第四位氨基酸對其活性影響最大，以疏水氨基酸為佳，疏水性越強，其抑制纖維蛋白與aIIbi33結(jié)合力越強。本項研究即對RGD進行改造，增加兩個氨基酸，以增強其作用的特異性和高效性。本發(fā)明的目的，在于提供一種能夠特異識別和抑制血栓形成的多肽，從而克服現(xiàn)有血栓生成抑制劑及一些溶栓藥物存在的副作用大、特異性不強等問題，以期在臨床治療中發(fā)揮高效、特異抑制血栓形成的功效。本發(fā)明所述一種特異識別血小板α IIb β 3的抗栓藥物RWR，迄今尚未見有國內(nèi)外的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種全新的小分子多肽，對RGD進行改造。根據(jù)RGD能特異結(jié)合anbi33的特點，增加一個疏水性氨基酸和一個堿性氨基酸，第四位增加一個疏水性氨基酸W，第五位增加一個堿性氨基酸R，可提高其特異結(jié)合α IIbi3 3能力，又能以較小的分子量降低免疫原性，解決現(xiàn)有抗血栓制劑存在的缺陷。本發(fā)明所述小肽序列為 Arg-Gly-Asp-Trp-Arg,其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)為RGDWR，該化合物能顯著提高其生物學活性，降低RGD類似物的副作用。本發(fā)明的要點之一在于，提供一種新的小分子多肽設(shè)計與合成，將氨基酸序列設(shè)計為Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)為RGDWR，將其命名為RWR。本發(fā)明的要點之二在于，RWR作用機理獨特，與纖維蛋白原競爭ciIIbi33受體拮抗齊U，競爭性地抑制纖維蛋白原與血小板結(jié)合(即抑制血栓形成的最后共同通路)的作用，尤其是，課題組創(chuàng)造性引入第四位氨基酸W，第五位氨基酸R與RGD模體共同發(fā)揮作用，大大增強了 RGD的作用，提高了其活性和特異性，可以高效抑制任何激活劑引起的血小板聚集，因此它作用的徹底性和高效性是不言而喻的。
發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果在于，可以利用化學合成、基因工程與蛋白質(zhì)工程技術(shù)， 設(shè)計并制備一種小分子多肽，所述多肽具有明顯抑制血栓生成的作用，且具有副作用小，特異性強，活性高和較小的免疫原性；同時具有結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，易于合成的特點，具有廣闊的市場和臨床應用前景。實施方案以下實施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

<實施例DArg-Gly-Asp-Trp-Arg的合成、純化與鑒定應用9-芴甲氧羰基(Fmoc)方法，采用Wang樹脂(Wang Resin)多肽合成載體， 首先將Arg的羧基通過酰胺鍵與wang-Resin連接，然后根據(jù)五肽序列從C端向N端延伸肽鏈，每步縮合都加入縮合劑如苯并三氮唑-N，N, N, N-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，1-羥基-苯并-三氮唑(HOBt)，縮合后用20%的DMF( 二甲基甲酰胺)溶液去除Fmoc保護基。 肽鏈合成后，用TFA(三氟乙酸)在室溫下攪拌，震蕩，過濾，在去除側(cè)鏈保護基的同時，使肽鏈從樹脂上解離下來。利用茚三酮試劑檢測脫保護和縮合的完全程度。合成的RWR經(jīng) RP-HPLC (反相高壓液相色譜)C18反相色譜柱純化，0. TFA和乙腈(0-30% )梯度洗脫， 流速lOmL/min，檢測波長215nm，純度大于90%。應用ESI-MS，元素分析確證其結(jié)構(gòu)與理論值一致。<實施例2> 體外抗栓作用的活性實驗及量效關(guān)系研究于清晨空腹經(jīng)肘靜脈采人血，以3. 8%枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑的體積比為 9 1)，室溫下，1000r/min離心8min，取上層血漿即為富血小板血漿(PRP platelet-rich plasma)，分離PRP。將余血再以3000r/min離心lOmin，取上層血漿得貧血小板血漿(PPP platelet-poor plasma)，用 PPP 調(diào)整 PRP，使血小板數(shù)約為 25 萬 / μ L。取 PRP400 μ L,分別加入NS (陰性對照)及不同濃度的替羅非班(Tirofiban) (200、100、50、25、12. 5 μ M陽性對照)/小肽RWR(100、50、20、12. 5、6· 25 μ M終濃度)50 μ 1，采用比濁法測定血小板聚集率 (測定儀為Helena的Packs-4型血小板聚集儀)，37°C以900r/min，在血小板聚集儀上攪拌，孵育2min后分別加入二磷酸腺苷(ADP) 50 μ 1，同時開始測定。所有接觸血液用品均為一次性塑料制品。 結(jié)果表明，RffR在體外對ADP誘導的家兔血小板聚集具有明顯抑制作用。隨著劑量增加，作用增強，呈現(xiàn)出量效相關(guān)性。各劑量組與對照組比較，均有顯著性差異(P < 0. 05)。 RWR 的 IC5tl 值為 19. 7 μ mol/L ；替羅非班的 IC5tl 值為 39. 5 μ mol/1，見表 1。表1RWR、Tirofiban對ADP誘導血小板聚集的IC5tl值
權(quán)利要求
1.一種小分子多肽RWR，其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)為RGDWR，即Arg-Gly-Asp-Trp-Arg。
2.制備權(quán)利要求1所述多肽RWR的方法，其特征是，該方法采用9-芴甲氧羰基法，首先將Arg的羧基通過酰胺鍵與Wang樹脂多肽合成載體連接，然后在縮合劑作用下根據(jù)五肽序列從C端向N端延伸肽鏈，縮合后用20%的二甲基甲酰胺溶液去除9-芴甲氧羰基保護基； 肽鏈合成后，用三氟乙酸在室溫下攪拌，震蕩，過濾，在去除側(cè)鏈保護基的同時，使肽鏈從樹脂上解離下來，利用茚三酮試劑檢測脫保護和縮合的完全程度；合成的產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC C18 反相色譜柱純化，得到RWR。
3.權(quán)利要求1所述多肽RWR在制備治療血栓性疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種小分子多肽，對RGD三肽進行改造，根據(jù)RGD特異結(jié)合αIIbβ3的特點，在其N端增加疏水性氨基酸和堿性氨基酸，第四位增加一個疏水性氨基酸W，第五位增加一個堿性氨基酸R，該小肽序列為Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)為RGDWR，可提高其特異結(jié)合αIIbβ3能力，又能以較小的分子量降低免疫原性，解決現(xiàn)有抗血栓制劑存在的缺陷。
文檔編號C07K7/06GK102351948SQ20111032182
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者劉海桃, 孫海飚, 常冰梅, 楊利軍, 楊濤, 王惠珍, 趙海霞 申請人:山西醫(yī)科大學