專利名稱：預(yù)防和治療pcv-2病毒的肽核酸及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸及其制劑。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是由德國學(xué)者Tischer I等1974年首次由多株連續(xù)傳代的豬腎細(xì)胞系(PK-15)中分離得到，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該病毒可以持續(xù)感染PK-15細(xì)胞，但不引起細(xì)胞病變，該病毒于1982年獲得命名。根據(jù)圓環(huán)病毒的致病性和核酸序列的不同，將PCV劃分為兩個型=PCV-1和PCV-2。目前認(rèn)為PCV-1不會引起疾病。豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)感染是近20年來發(fā)現(xiàn)的豬的一種新疾病，該病已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對養(yǎng)豬業(yè)的危害日益被人們重視。PCV-2可造成豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、皮炎和腎病綜合癥(Porcinedermatitisand nephropathy syndrome, PDNS)、繁殖障石尋(Reproductive failure)>A2型先天性震顫(Congenital tremors)、豬呼吸道病復(fù)合征(Porcine respiratorydisease complex, PRDC)以及豬增生性壞死性間質(zhì)性肺炎(Porcine proliferative andnecrotizing pneumonias)等疾病。1991年Clark E G首次報道在加拿大豬場發(fā)生斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭征(Post-weaning multisystemic wating syndrome, PMWS),此后該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大危害，尤其是引起發(fā)病豬群免疫抑制而倍受人們關(guān)注。我國由郎洪武等于2001年首次報道，從北京、河北的疑似PMWS的發(fā)病豬群中分離到PCV-2,王忠田等在對北 京、天津、廣東、深圳、山東、山西等地12個規(guī)?；B(yǎng)豬場進(jìn)行圓環(huán)病毒流行病學(xué)調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，11個豬場有PMWS的發(fā)生，表明PCV-2的感染已在我國規(guī)?；B(yǎng)殖場普遍存在。PCV-2感染能造成豬的生長緩慢，飼料報酬降低，同時侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫力下降，引起其他疾病的大爆發(fā)，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過各國研究人員幾十年的共同努力，基本清楚了 PCV-2的生物學(xué)特性、流行病學(xué)、感染的危害，但對其致病機(jī)制尚不清楚，同時如何防治PCV-2和研制PCV-2疫苗的成為當(dāng)前獸醫(yī)科研人員的研究熱點(diǎn)。PCV的分布極為廣泛，一般認(rèn)為，PCV的唯一宿主是豬。病豬和帶毒(隱性感染)豬是主要傳染源。病毒存在于感染豬的呼吸道、肺、脾和淋巴結(jié)中，主要從鼻液和糞便等廢物中排出病毒，感染公豬的精液被認(rèn)為是一種潛在的PCV-2病毒來源。PCV-2 —年四季均可發(fā)生，既可接觸感染、空氣傳播，也可經(jīng)胎盤垂直感染和通過口腔、呼吸道、鼻液、糞便等途徑水平傳播而感染不同年齡的豬群。育肥豬多表現(xiàn)為陰性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀。少數(shù)懷孕母豬感染PCV后，可經(jīng)胎盤垂直感染給仔豬，造成仔豬先天性震顫或斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。PCV常與PPV或豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)混合感染，造成許多附加癥狀，使疾病的診斷更趨于復(fù)雜化和多樣化。年齡在5 12周的仔豬感染后多表現(xiàn)為PMWS, 一般于斷奶后2 3天或I周開始發(fā)病，發(fā)病率20 % 60 %，病死率5 % 35 %。到目前為止，PCV-2引起各類疾病的發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，但許多研究證據(jù)表明，豬感染PCV-2可導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制，影響豬的免疫功能。PCV-2感染總是與淋巴器官的粒細(xì)胞炎性浸潤有關(guān)。PCV-2感染豬體后在豬體內(nèi)增殖，導(dǎo)致感染豬發(fā)生一系列臨床和組織病理學(xué)變化，主要存在于淋巴組織、肺、肝和腎等組織器官中，使淋巴組織(淋巴結(jié)、胸腺、扁桃體和脾)、肺、肝和腎出現(xiàn)以細(xì)胞浸潤為主要特征的炎性病理變化和淋巴細(xì)胞萎縮。McNeilly等(1996)通過研究PCV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞體外免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)對FC和補(bǔ)體受體或者吞噬作用沒有影響。在感染4d后對MHC-1類抗原有上調(diào)作用，8d后降低了細(xì)胞對MHC-2類抗原的表達(dá)。Darwich等將豬血液樣品用抗凝劑作用后，再用植物血凝素(PHA)和超抗原葡萄球菌腸毒素B (SEB)作用，PCV-2感染豬形成炎癥反應(yīng)能力受損和細(xì)胞因子合成下降，即PCV-2感染豬淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活途徑存在缺陷。圓環(huán)病毒可以誘導(dǎo)淋巴系統(tǒng)中的B細(xì)胞凋亡，使患豬處于免疫抑制狀態(tài)，這是導(dǎo)致混合感染和繼發(fā)感染的主導(dǎo)因素。Joagnin等認(rèn)為PCV-2的感染對免疫系統(tǒng)的效應(yīng)來講似乎是一把雙刃劍:一方面，PCV-2與其他病毒(如PRRSV和PPV)同時實(shí)驗(yàn)感染時，這些病毒可以刺激和活化免疫系統(tǒng)，增加了混合感染豬體內(nèi)的PCV-2的增殖；另一方面，嚴(yán)重的淋巴組織病損，包括淋巴細(xì)胞缺失和這些組織中免疫細(xì)胞亞群的其他變化，是嚴(yán)重發(fā)病豬的規(guī)律性特征，因此，PCV-2感染豬對其它免疫原不能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答成為本病致病機(jī)制的重要原因。Krakowka等對I日齡患病豬進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所有PCV-2和PPV混合感染豬都出現(xiàn)了 PMWS癥狀，在巨噬細(xì)胞中可檢測到PCV-2抗原，而PCV-2單獨(dú)感染豬不能復(fù)制出PMWS癥狀。PCV作為圓環(huán)病毒屬的代表種，無囊膜，單股環(huán)狀DNA，病毒粒子直徑為17 20nm，呈二十面體對稱。病毒粒子由衣殼蛋白和核酸組成，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒。在分類地位上屬圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病毒屬(Circovirus)。PCV-1與PCV-2在核苷酸序列上約有76%的同源性。PCV-1基因組為1759bp，PCV-2基因組為1768bp或1767bp。PCV-1有7個ORFs，均編碼大于5ku的蛋白質(zhì)。PCV-2通常含有11個ORFs，預(yù)計分別編碼1.Sku 35.SKu的蛋白質(zhì)，各閱讀框大小相差懸殊，且大部分ORF都有部分重疊，其中 0RF1、0RF5、0RF7 和 ORFlO 在正義鏈，0RF2、0RF3、0RF4、0RF6、0RF8、0RF9 和 ORFll位于負(fù)義鏈，這些基因表現(xiàn)為重疊基因，充分利用了病毒有限的遺傳物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，病毒基因組由2個相對排列的ORF和其間的基因間隔組成，其中較大的ORFl經(jīng)病毒正向DNA轉(zhuǎn)錄，為Rep基因，有945個堿基，編碼314個氨基酸，大小為35.6ku，編碼病毒復(fù)制酶相關(guān)蛋白(Itep);較小的0RF2經(jīng)病毒DNA互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄，為Cap基因，含有705個堿基，編碼234個氨基酸，編碼大小約27.9ku的主要結(jié)構(gòu)蛋白或衣殼蛋白。該結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒的核衣殼，其抗原性具有型特異性。PCV相同基因型不同毒株之間序列同源性大于90%，不同基因型毒株之間同源性為68% 79%。Rep蛋白由病毒的正向鏈轉(zhuǎn)錄而成的，是PCV基因中最大的閱讀框(ORFl)編碼而成，它編碼的復(fù)制酶蛋白在所有的圓環(huán)病毒中高度保守。Rep基因分別編碼R印(312個氨基酸，35.6ku)和R印’(168個氨基酸，19.2ku)。Rep蛋白和R印’蛋白是PCV病毒復(fù)制所必需的，Rep蛋白單獨(dú)不能啟動病毒復(fù)制，必須與R印’蛋白共同作用才能啟動PCV的復(fù)制。系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果表明，圓環(huán)病毒Rep蛋白可能是通過在微粒病毒的Rep蛋白和小RNA病毒樣編碼的RNA結(jié)合蛋白或原核生物的螺旋酶重組作用而產(chǎn)生。PCV-2的Rep基因位于第51 995位核苷酸，含有945個堿基，編碼315個氨基酸，編碼病毒的復(fù)制相關(guān)蛋白R印。Rep 185位 211位氨基酸區(qū)域內(nèi)存在PCV-1和PCV-2共有表位。 PCV-1與PCV-2相比較，R印蛋白相對比較保守，氨基酸序列同源性達(dá)86 %，這也是兩種血清型PCV病毒產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因所在。PCV-1R印蛋白僅有一個糖基化位點(diǎn)，位于20 22aa(NpS) ;PCV2R印蛋白則含有 3 個糖基化位點(diǎn)，23 25aa (NPS)，256 258aa (NQT)及 286 288aa (NAT)。Rep 蛋白具有與典型滾環(huán)復(fù)制(RCR)相關(guān)的3個保守基序以及結(jié)合dNTps的P環(huán)(P-1oop)結(jié)構(gòu)(序列為G-GKs)，這些結(jié)構(gòu)對于維持Rep蛋白的功能至關(guān)重要，突變或缺失均會影響病毒的復(fù)制，這也進(jìn)一步證明PCV病毒DNA進(jìn)行滾環(huán)式復(fù)制。 Cap蛋白即0RF2，分子量為27.8ku，位于DNA互補(bǔ)鏈上，編碼病毒衣殼蛋白，位于細(xì)胞核中，其N端富含精氨酸和堿性氨基酸，編碼234個氨基酸。該基因可能是在病毒感染細(xì)胞后由宿主所編碼的各種蛋白酶的參與下催化合成的中間產(chǎn)物，所編碼的蛋白是PCV-2囊膜的主要成分，目前對0RF2的研究已經(jīng)成為PCV-2研究的熱點(diǎn)。PCV-2與PCV-1的0RF2相似，其起始密碼子位于第1033位核苷酸或第1034位核苷酸，PCV-1和PCV-2的Cap基因都只有一個糖基化位點(diǎn)，分別位于PCV-2Cap蛋白的143_145aa(NYS)及PCV-1的102-104aa(NYS)。Cap基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位于第1238個核苷酸，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可連接ORFl的外顯子，第737位核苷酸為接翻譯的起始位點(diǎn)。Rep基因的啟動子精確定位于第1353 1168位核苷酸，沒有發(fā)現(xiàn)PCV編碼蛋白對Cap基因轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。0RF2有702個堿基，分析PCV-1和PCV-2高免血清與病毒Cap蛋白的結(jié)合部位，結(jié)果表明PCV-1和PCV_2Cap蛋白169 183位氨基酸片段，能與PCV-1和PCV-2高免血清發(fā)生特異性結(jié)合；PCV_2Cap蛋白65 87位，113 139位和193 207位氨基酸片段，僅與PCV-2高免血清發(fā)生特異性結(jié)合，而與PCV-1高免血清不發(fā)生反應(yīng)，兩種血清型的Cap蛋白雖然有共同的抗原決定簇，但沒有抗原交叉性。Cap蛋白169 183位氨基酸區(qū)域內(nèi)，存在PCV-1和PCV-2共有表位；PCV2Cap蛋白65 87位，113 139位和193 207位氨基酸區(qū)域內(nèi)，存在3個或3個以上PCV-2型特異性表位。Cap基因可能是造成病毒遺傳特性發(fā)生根本性改變的惟一基因，因而推測其與病毒致病性密切相關(guān)，通過改變病毒的宿主嗜性及病毒蛋白與細(xì)胞蛋白因子的相互作用機(jī)制，而使病毒獲得不同的致病性。由于Cap蛋白具有以上特性，使其成為在分子水平上診斷PCV-2的最佳抗原，同時它在PCV-2血清學(xué)研究中發(fā)揮巨大的作用，成為PCV-2研究的熱點(diǎn)。反義核酸(antisense nucleic acid)是一段與祀基因(mRNA或DNA)的某段序列互補(bǔ)的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反義核酸通過堿基配對方式特異性的與病毒靶基因結(jié)合形成雜交分子，從而在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，或誘導(dǎo)RNase H識別并切割mRNA，進(jìn)而使其功能喪失。反義核酸包括反義RNA (antisense RNA)和反義DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列設(shè)計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力強(qiáng)等特點(diǎn)。反義核酸作為一種新的抗病毒、抗腫瘤藥物，掀起了一場藥理學(xué)領(lǐng)域的革命，即新的藥物受體mRNA通過新受體結(jié)合方式(Watson-Crick雜交)、引發(fā)新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng):(I)RNase H介導(dǎo)的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工和翻譯等?？梢哉f反義寡核苷酸(ODNs)療法比傳統(tǒng)的藥物治療手段有更高的特異性。從二十世紀(jì)70年代末到現(xiàn)在，在這三十年的時間中，反義核酸藥物已走出實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)入了實(shí)際臨床應(yīng)用。特別是第一個反義核酸藥物Fomivirsen通過FDA批準(zhǔn)上市后,人們對反義療法尤為關(guān)注。反義核酸作用原理基于堿基配對原則，可通過與靶RNA進(jìn)行堿基配對結(jié)合的方式參與對相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。其作用方式可能有:①反義RNA與病毒mRNA結(jié)合形成互補(bǔ)雙鏈阻斷核糖體與病毒mRNA的結(jié)合，從而抑制了病毒mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。②反義DNA能與祀基因形成一種三鏈核酸(triple helix nucleic acid),它通過作用于控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子、增強(qiáng)子和啟動子區(qū)，對基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。③反義核酸與病毒mRNA的結(jié)合可阻擋mRNA向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸。④反義核酸與病毒mRNA結(jié)合后使得mRNA更加易被核酸酶識別降解，從而大大縮短mRNA的半衰期。上述四種作用途徑都可表現(xiàn)為對病毒基因表達(dá)的抑制或調(diào)控，且這種調(diào)控是高度特異性的。反義核酸是通過堿基互補(bǔ)配對的原理來識別所打靶的基因，從理論來分析，研究人員以動物細(xì)胞為例，其染色體大約有幾十億對堿基，如果4個堿基(A、G、C和T)的數(shù)目大致相同，并在整個基因中隨機(jī)分布，那么按照統(tǒng)計學(xué)原理，大于17個堿基的反義核酸與非靶基因雜交的可能性不大，所以長度超過17個堿基的反義核酸分子與靶基因的結(jié)合可以說是唯一的，從而使反義核酸具有高度的特異性。研究表明，在細(xì)胞內(nèi)部一個拷貝的基因會產(chǎn)生200-300條mRNA，翻譯出10萬個具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。傳統(tǒng)藥物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某結(jié)構(gòu)域上的幾個作用位點(diǎn)，事實(shí)上蛋白的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜的，且在生物體內(nèi)，活性蛋白的空間結(jié)構(gòu)又是千變?nèi)f化的，以傳統(tǒng)藥物有限的幾種作用位點(diǎn)來控制靶分子的動態(tài)的和整體的功能很難達(dá)到理想的效果，因而不難看出傳統(tǒng)藥物的局限性。由mRNA可翻譯出幾十到幾百個蛋白，反義核酸在mRNA水平對靶基因直接進(jìn)行調(diào)控，這個步驟相當(dāng)于將傳統(tǒng)藥物作用放大了數(shù)十到數(shù)百倍，可見反義核酸的調(diào)控是極其經(jīng)濟(jì)合理的。毒理學(xué)研究表明，反義核酸在體內(nèi)具有很低的毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時間有長有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險性。與傳統(tǒng)藥物相比，反義核酸藥物具有特異性強(qiáng)，效率高和毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，在抑制腫瘤生長和抗病毒復(fù)制等方面顯現(xiàn)出了良好的應(yīng)用價值。目前已有多個藥物進(jìn)入美國和歐洲市場，另還有30多種反義`核酸藥物正在進(jìn)行臨床前期的研究或開發(fā)后進(jìn)入了 1、II和III期實(shí)驗(yàn)。由于動物體內(nèi)存在大量的核酸外切酶，反義核酸若不經(jīng)過化學(xué)修飾，很快就被降解，失去活性。目前對反義核酸的化學(xué)修飾有很多方法，常見的有硫代修飾反義核酸及2’-甲氧基修飾反義核酸等。且目前硫代修飾藥物的研究最為全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同時可促進(jìn)核酸酶Rase H的活性，目前這種修飾方法已成功用于臨床的反義核酸藥物。但這些還只是第一代反義核酸的修飾方法，隨著技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，新的修飾途徑與方法被開發(fā)出來，使得反義核酸的研究進(jìn)入了第二、三代，其中肽核酸的修飾最為引人關(guān)注。肽核酸(peptidenucleic acids,PNAs),是一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA類似物，可序列特異的靶向作用于DNA的大溝槽，其骨架的結(jié)構(gòu)單元為N(2-氨基乙基)-甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接于主骨架的氨基N上。為反義核酸的第二代產(chǎn)品。PCV-2是目前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。PCV2不僅可造成豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥、皮炎和腎病綜合癥、繁殖障礙等諸多類型的疾病，該病毒還能導(dǎo)致免疫抑制，引起繼發(fā)感染，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。到目前為止，對該病還沒有理想的防控措施，開發(fā)預(yù)防和治療PCV2感染的新手段顯得尤為迫切，但PCV2在細(xì)胞中增殖不引起細(xì)胞病變，感染后會弓I起免疫抑制，疫苗研究至今沒有根本性突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的療效的用于預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸及其制劑。本發(fā)明所提供的肽核酸，由序列I和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸組成；序列1:5，-AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3，；序列2:5，-TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3，；序列3:5，-TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3，；序列4:5，-TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3，；序列5:5，-AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3，；序列6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’。其中，所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。本發(fā)明所提供的另一種肽核酸，由序列5和序列6所示的肽核酸組成；序列5:5，-AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3，；序列6:5，-TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3，。其中，所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。本發(fā)明的肽核酸可以制成肽核酸制劑:1、采用控釋制藥工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成結(jié)腸溶控釋微丸制劑；2、采用冷凍干燥制藥工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成注射用凍干制劑；3、采用凍干后再制粒工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成口服用水溶性顆粒劑。肽核酸制劑穩(wěn)定性分析高溫:流通蒸汽高溫105°C，20分鐘滅菌不影響其生物活性。極端溫度:50°C存放6個月不影響其生物活性。室溫:存放24個月不影響其生物活性。低溫:-20°C存放48個月不影響其生物活性。本發(fā)明針對PCV-2的Rep和Cap兩種主要蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計的病毒特異性的反義寡核苷酸序列，合成肽核酸以及用殼聚糖進(jìn)行修飾，使其具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的療效。
具體實(shí)施例方式主要材料與試劑病毒 毒株P(guān)CV-2毒株:WS01株，毒價為105.20TCID50,由楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞株Dulac細(xì)胞,楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)施例1針對PCV-2的肽核酸體外抗病毒效果分析從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索出PCV-2的基因組，用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析，綜合考慮序列的保守性，G+C%含量，堿基分布特點(diǎn)，然后從中挑選出合適的區(qū)域設(shè)計反義核酸，然后根據(jù)反義核苷酸合成肽核酸。采用肽核酸的合成工藝進(jìn)行肽核酸的人工合成。Rep-ι:5，-AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3’Rep-2:5， -TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3，Rep-3:5’ -TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3’Cap-1:5’ -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3’Cap-2:5， -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’Cap-3:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’1.1以不同濃度分析它們抗病毒效果取生長狀態(tài)良好的Dulac細(xì)胞，用胰酶消化后，鋪板于24孔細(xì)胞板中，0.5mL/孔(2.0X105個細(xì)胞)，5% C02 37°C條件下培養(yǎng)24h后吸去培養(yǎng)液，加入0.1mL的105TCID50PCV-2 WSOl株感染上述細(xì)胞，感染后24h，每孔加入300 μ I待篩選藥物，以完全培養(yǎng)基作稀釋液，肽濃度(0.05 μ Μ, 0.1 μ Μ, 0.2 μ Μ, 0.4 μ Μ, 0.8 μ Μ, 1.6 μ Μ),每個藥物梯度設(shè)4個平行孔。加藥處理24h后收集上清和細(xì)胞，運(yùn)用TaqMan探針Real-time PCR法定量檢測各處理組中PCV2病毒拷貝數(shù)。同時設(shè)病毒感染陽性對照組，空白對照組，細(xì)胞陰性對照組。本發(fā)明參考Chung等提供的引物，采用real-time PCR定量檢測PCV2。弓丨物PCV2-1: 5' -TAGGTTAGGGCTGT-GGCCTTA-3'弓丨物PCV2-2: 5' -TTCTCCCGCACTTTCGGATAT-3'探針PCV2probe:5' -ATCTCATCATGTCCACCGCCCAGGA-3' -fluorescin以下述公式來計算不同的肽核酸對PCV-2病毒復(fù)制產(chǎn)生的抑制率。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸，由序列I和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸組成；序列 1:5’ -AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3’ ；序列 2:5，-TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3，；序列 3:5，-TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3，；序列 4:5’ -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3’ ；序列 5:5’ -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’ ；序列 6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGAITTC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽核酸，其特征在于:所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。
3.一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸，由序列5和序列6所示的肽核酸組成；序列 5:5’ -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’ ；序列 6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽核酸，其特征在于:所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。
5.一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸制劑，其活性成分為權(quán)利要求1-4任一所述的肽核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽核酸制劑， 其特征在于:還包含可藥用載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸，由序列1和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸組成；或由序列5和序列6所示的肽核酸組成。本發(fā)明還公開了含有所述肽核酸的肽核酸制劑。本發(fā)明針對PCV-2的Rep和Cap兩種主要蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計的病毒特異性的反義寡核苷酸序列，合成肽核酸以及用殼聚糖進(jìn)行修飾，使其具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的療效。
文檔編號C07K14/00GK103102397SQ20111035182
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者韓健寶 申請人:韓健寶