專利名稱：擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯類農(nóng)藥因其具有殺蟲譜廣、活性高、用量少、殘留量低等特點(diǎn)而在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、衛(wèi)生業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著一批高毒農(nóng)藥的禁用，菊酯類農(nóng)藥在中國(guó)的使用量越來(lái)越大，其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留也越來(lái)越引起人們的重視。目前擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留量檢測(cè)的常規(guī)方法有氣相色譜法和高效液相色譜法等。 這些方法的檢測(cè)限低、靈敏度高，已有相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)可供參考，但樣品前處理復(fù)雜、儀器昂貴、操作技術(shù)要求高，對(duì)于中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)控中要求的大批量樣品快速初篩工作無(wú)法勝任。免疫分析是一種快速、靈敏的用于痕量檢測(cè)的方法，近十年來(lái)研究應(yīng)用發(fā)展迅速， 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道約有60多種農(nóng)藥可用于酶免疫分析。由于免疫方法特異性強(qiáng)，多殘留分析就需要采用不同的農(nóng)藥抗體進(jìn)行多次檢測(cè)分析，這就增加了檢測(cè)成本和工作量，將單種藥劑的檢測(cè)研究發(fā)展為對(duì)多種類似化合物通用檢測(cè)篩選法，測(cè)定每類農(nóng)藥的總殘留量，是較為適用的現(xiàn)場(chǎng)篩選檢測(cè)方法。有鑒于此，本發(fā)明根據(jù)幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的共性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)制備了廣譜性抗體，并且可以建立針對(duì)多種常見(jiàn)菊酯類藥劑快速篩選檢測(cè)方法，本案由此產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法，該方法得到的多克隆抗體可用于對(duì)多種類似化合物同時(shí)進(jìn)行通用檢測(cè)篩選。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟
(a)合成人工抗原PBA溶于DMF中，加入等摩爾數(shù)的DCC和NHS，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，再將混合液慢慢滴加至含BSA的緩沖液，室溫磁力攪拌30min，然后在4°C溫度下反應(yīng)6 h，最后反應(yīng)液在4°C溫度下且pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析過(guò)夜；
(b)合成包被原；
(c)制備抗體取雄性新西蘭大白兔，在免子疫前1周采血制備陰性血清；免疫程序?yàn)?免疫劑量為每kg兔子體重1 mg免疫原，加入FCA將免疫原制成油包水乳濁液，在兔子背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射；隔2周進(jìn)行第2次免疫，免疫方法是先加入FICA將免疫原制成油包水乳濁液，再在兔子背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射；此后，每隔3周免疫1次，方法同第2次免疫； 從第4次免疫開始，每次免疫1周后在兔子耳緣靜脈采少量血，分離血清，采用間接非競(jìng)爭(zhēng) ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)；當(dāng)效價(jià)達(dá)2X IO4后，進(jìn)行最后一次免疫，用加倍量抗原的生理鹽水稀釋液在兔子耳緣靜脈注射，1周后心臟采血致兔子死，分離血清；采用硫酸銨二步沉淀法純化抗體，制成凍干粉于-20°C保存?zhèn)溆?。步驟(b)中合成包被原的方法為PBA溶于DMF中，加入等摩爾數(shù)的DCC和NHS，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，再將混合液慢慢滴加至含OVA的緩沖液，室溫磁力攪拌30min，然后在4°C溫度下反應(yīng)6 h，最后反應(yīng)液在4°C溫度下且pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析；
步驟(b)中另外一種合成包被原的方法為取6-氨基己酸、EDC和OVA溶于水中，用稀 NaOH調(diào)到溶液pH=7. 5，室溫下在暗中反應(yīng)18 h后用kphadex G-IO純化、冷凍并干燥保存，再溶于含體積比20%DMF的水溶液中；另將PBA先溶于DMF中，再緩慢滴加入到上述DMF 的水溶液中，然后再加入溶于DMF的DCC，調(diào)整DMF的最終濃度為30% (v/v);最后在室溫暗中反應(yīng)18 h，得到的混合物過(guò)濾除去沉淀，再透析。本發(fā)明中的化合物及其簡(jiǎn)稱的對(duì)應(yīng)關(guān)系表述如下N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，環(huán)二己基碳酰亞胺(DCC)，水溶性碳化二亞胺(EDC)，二甲基甲酰胺(DMF)，卵清蛋白(OVA)，牛血清蛋白(BSA)，弗氏完全佐劑(FCA)，弗氏不完全佐劑(FICA)，間苯氧基苯甲酸(PBA)。絕大多數(shù)農(nóng)藥是小分子物質(zhì)，只具有反應(yīng)原性，而沒(méi)有免疫原性。本發(fā)明通過(guò)活性酯法將半抗原PBA與BSA偶聯(lián)，這就相當(dāng)于在PBA與BSA之間搭了一座橋，從而避免了 BSA 大分子的屏蔽作用，將PBA作為抗原決定簇盡量暴露于免疫系統(tǒng)，獲得的高親和力抗體就可能識(shí)別含有PBA結(jié)構(gòu)的化合物。但“橋”結(jié)構(gòu)也有不利的影響，即免疫系統(tǒng)不僅識(shí)別半抗原，而且識(shí)別“橋”，因此制得的多克隆抗體中可能含有識(shí)別“橋”的抗體，本發(fā)明中的包被原采用6-氨基己酸法合成，在PBA與OVA之間引入一個(gè)6C “橋”，避免“橋”抗體對(duì)包被原的識(shí)別，從而提高了 IC-ELISA的靈敏度。本發(fā)明的抗體不僅能識(shí)別半抗原，而且識(shí)別含半抗原結(jié)構(gòu)在內(nèi)的大分子化合物， 抗體對(duì)氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等多種菊酯化合物都有一定的交叉識(shí)別。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
人工抗原的合成
免疫原的合成活性酯法0.0196 g PBA溶于2 ml DMF，加入等摩爾數(shù)的DCC，NHS，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將上述混合液慢慢滴加至含0.0900 g BSA的10 ml緩沖液(PBS CBS=4 1)， 室溫磁力攪拌30min，然后4°C反應(yīng)6 h，反應(yīng)液在4°C IL磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)透析過(guò)夜(換液4次)。透析后的溶液用BECKMAN而640紫外掃描儀掃描，并計(jì)算結(jié)合比。包被原的合成
采用活性酯法，具體制備方法與免疫原合成類似，其用量分別為ΡΒΑ0. 0301 g、 DCC0. 0722 g.NHSO. 0347 g、0VA0. 0805 g。透析后的溶液用 BECKMAN DU640 紫外掃描儀掃描，計(jì)算結(jié)合比?？贵w的制備與純化
取雄性新西蘭大白兔3只，體重1.5 kg左右，免疫前1周分別采血制備陰性血清。免疫程序首免，劑量為每kg兔子體重1 mg免疫原，加FCA將免疫原制成油包水(W/0)乳濁液，背部皮下多點(diǎn)注射；隔2周第2次免疫，加FICA ；此后，每隔3周免疫1次，方法同第2次免疫；第4次開始，每次免疫后1周兔耳緣靜脈采少量血，分離血清，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)2X104后，進(jìn)行最后1次免疫，用加倍量抗原的生理鹽水稀釋液耳緣靜脈注射，1周后心臟采血致死，分離血清。并采用硫酸銨二步沉淀法純化抗體，制成凍干粉，于-20°C保存?zhèn)溆?。?只兔子的陰性血清作IC-ELISA分析，0D450接近為0，表明兔子體內(nèi)不存在本研究半抗原對(duì)應(yīng)的抗體，3只兔子均可用于制備抗體的免疫動(dòng)物。經(jīng)過(guò)多次加強(qiáng)免疫后，以間接非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。實(shí)施例2:
人工抗原的合成以及抗體的制備與純化按照實(shí)施例1中的步驟進(jìn)行。包被原的合成采用如下方法
取6-氨基己酸0. 0693 g，EDC0. 0796 g,0VA0. 2072 g 溶于水中，用稀NaOH 調(diào)pH=7. 5， 室溫暗中反應(yīng)18 h后，用kphadex G-IO純化，冷凍，干燥保存。將上述樣品溶于含20%DMF 水中，另稱ΡΒΑ0. 1090 g溶于DMF中，慢慢滴加入到上述樣品中，然后再加入溶于DMF的DCC (0.0932g)，使DMF最終濃度為30%( ν/ν)室溫暗中反應(yīng)18 h，混合物過(guò)濾除沉淀，透析。透析后的反應(yīng)液用BECKMAN而640紫外掃描儀掃描，計(jì)算結(jié)合比。實(shí)施例3: 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立
根據(jù)方陣滴定原則，確定抗原抗體最佳工作濃度。在最佳工作條件下，測(cè)定不同濃度 PBA對(duì)2種包被原與抗體結(jié)合反應(yīng)抑制率(190,1=10(^(005^ — ODi^VODwmL以抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)回歸分析，建立回歸方程I=B lgC+A， 計(jì)算抑制中濃度I5tl和檢測(cè)下限11(1。特異性分析
分別測(cè)定氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯等菊酯類農(nóng)藥對(duì)抗體反應(yīng)的I5tl值，PBA的I5tl與菊酯類其它農(nóng)藥I5tl的百分比值，即為交叉反應(yīng)率。表1不同農(nóng)藥對(duì)抗體的抑制力
權(quán)利要求
1.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(a)合成人工抗原PBA溶于DMF中，加入等摩爾數(shù)的DCC和NHS，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，再將混合液慢慢滴加至含BSA的緩沖液，室溫磁力攪拌30min，然后在4°C溫度下反應(yīng)6 h，最后反應(yīng)液在4°C溫度下且pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析過(guò)夜；(b)合成包被原；(c)制備抗體取雄性新西蘭大白兔，在免子疫前1周采血制備陰性血清；免疫程序?yàn)?免疫劑量為每kg兔子體重1 mg免疫原，加入FCA將免疫原制成油包水乳濁液，在兔子背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射；隔2周進(jìn)行第2次免疫，免疫方法是先加入FICA將免疫原制成油包水乳濁液，再在兔子背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射；此后，每隔3周免疫1次，方法同第2次免疫； 從第4次免疫開始，每次免疫1周后在兔子耳緣靜脈采少量血，分離血清，采用間接非競(jìng)爭(zhēng) ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)；當(dāng)效價(jià)達(dá)2X IO4后，進(jìn)行最后一次免疫，用加倍量抗原的生理鹽水稀釋液在兔子耳緣靜脈注射，1周后心臟采血致兔子死，分離血清；采用硫酸銨二步沉淀法純化抗體，制成凍干粉于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟 (b)中合成包被原的方法為PBA溶于DMF中，加入等摩爾數(shù)的DCC和NHS，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜， 再將混合液慢慢滴加至含OVA的緩沖液，室溫磁力攪拌30min，然后在4°C溫度下反應(yīng)6 h， 最后反應(yīng)液在4°C溫度下且pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟(b)中合成包被原的方法為取6-氨基己酸、EDC和OVA溶于水中，用稀NaOH調(diào)到溶液 pH=7. 5，室溫下在暗中反應(yīng)18 h后用kphadex G-IO純化、冷凍并干燥保存，再溶于含體積比20%DMF的水溶液中；另將PBA先溶于DMF中，再緩慢滴加入到上述DMF的水溶液中，然后再加入溶于DMF的DCC，調(diào)整DMF的最終濃度為30% (ν/ν)；最后在室溫暗中反應(yīng)18 h， 得到的混合物過(guò)濾除去沉淀，再透析。
全文摘要
本發(fā)明提供一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(a)合成人工抗原；(b)合成包被原；(c)制備抗體。本發(fā)明的抗體不僅能識(shí)別半抗原，而且識(shí)別含半抗原結(jié)構(gòu)在內(nèi)的大分子化合物，抗體對(duì)氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等多種菊酯化合物都有一定的交叉識(shí)別。本發(fā)明根據(jù)幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的共性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)制備了廣譜性抗體，并且可以建立針對(duì)多種常見(jiàn)菊酯類藥劑快速篩選檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C07K16/06GK102363634SQ201110362539
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者周昱, 張縉, 徐敦明, 方恩華, 林立毅, 黃蓬英 申請(qǐng)人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心