專利名稱：：針對可溶型lox-1的單克隆抗體的制作方法針對可溶型L0X-1的單克隆抗體(本申請是2009年3月27日遞交的發(fā)明名稱為“針對可溶型L0X-1的單克隆抗體”的申請200780036077.2的分案申請)技術(shù)區(qū)域本發(fā)明涉及與作為氧化低密度脂蛋白(以下稱為“氧化LDL”)受體的凝集素樣氧化低密度月旨蛋白受體_1(Lectin-likeoxidizedlowdensitylipoproteinreceptor-1)(以下稱為“L0X-1”)的一部分?jǐn)嗔旬a(chǎn)生的可溶型分子(以下稱為“可溶型L0X-1”)具有特異性親和性而結(jié)合的單克隆抗體，以及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤。本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的用途。
背景技術(shù)：
：從不穩(wěn)定心絞痛到急性心肌梗塞，再到在合并有不穩(wěn)定心絞痛和急性心肌梗塞的心臟性粹死的一系列病態(tài)，概括地稱為急性冠脈綜合征(ACS)ο其均為由向心臟供給營養(yǎng)的冠狀動脈的動脈硬化所生成的粥樣斑(斑塊)崩解、在其上附著血栓，結(jié)果產(chǎn)生冠狀動脈狹隘和閉塞而發(fā)病的。在現(xiàn)代社會，急性冠脈綜合征逐漸增加，但由于大部分患者沒有任何先兆而突然發(fā)病，所以，大多數(shù)無法急救而突然死亡。另外，即使在迅速被送到醫(yī)院的情況下，為了搶救，大多必須進行緊急的經(jīng)皮經(jīng)管冠狀血管形成手術(shù)(PCI)，其醫(yī)療經(jīng)濟上的負(fù)擔(dān)不可估計。近年來逐漸明確，急性冠脈綜合征的發(fā)病起因于粥樣動脈硬化斑塊的破損或糜爛而持續(xù)產(chǎn)生的閉塞性血栓形成(非專利文獻I)。雖然已經(jīng)顯示在斑塊的破損、糜爛時，在血管壁內(nèi)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)起著重要作用，但在其中，已知由受到氧化變性的LDL(低密度脂蛋白)所引起的、以蛋白酶活性增加和凋亡(細胞死亡)為中心的血管壁功能障礙是其主要原因。L0X-1是作為該氧化LDL的受體蛋白質(zhì)被鑒定的物質(zhì)(非專利文獻2)。已知該L0X-1在機體內(nèi)通常作為膜蛋白質(zhì)而在細胞表面表達，但由蛋白酶的作用，在跨膜部分附近的細胞外結(jié)構(gòu)域被切斷而作為可溶型(S0Iuble)LOX-I在血中游離(非專利文獻3)。另外，由于在急性冠脈綜合征的急性期，該可溶型L0X-1的血中濃度顯著上升，所以有報告其作為急性冠脈綜合征的初步診斷標(biāo)記物的可能性(非專利文獻4)。因此，可以說如果能夠在早期階段正確地定量在血中存在的可溶型L0X-1量，就能夠預(yù)先防止急性冠脈綜合征(ACS)。另一方面，雖然有關(guān)于針對L0X-1的抗體的報告，但都停留在一般的記載，目前的現(xiàn)狀是，能夠在實現(xiàn)上述目的的ELISA等免疫化學(xué)測定系統(tǒng)中使用的具有高親和性的單克隆抗體尚沒有報告(專利文獻I3)。非專利文獻I=MedicalTribune,1999，Vol.32，No.31,p.6非專利文獻2=Nature,1997，Vol.386，p.73-77非專利文獻3Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.，2000，20(3)，p.715-720非專利文獻4Circulation,2005，112(6)，p.812-818專利文獻I:日本特開平9-98787號公報專利文獻2:日本特開2000-109435號公報專利文獻3:日本特表2002-510710號公報
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種特異性識別并結(jié)合作為人氧化LDL受體的L0X-1的可溶型分子的人可溶型L0X-1的單克隆抗體，特別是與人可溶型L0X-1的解離常數(shù)為IXIO-9(M)以下的、對人可溶型L0X-1具有高親和性的單克隆抗體。另外，本發(fā)明的目的還在于提供該單克隆抗體的用途，例如，提供利用了該抗體具有的對人可溶型L0X-1的特異親和性和結(jié)合性的免疫學(xué)試劑(例如，人可溶型L0X-1的特異性結(jié)合試劑或特異性檢測試劑)、和利用了該試劑的人可溶型L0X-1的特異性且高靈敏度的檢測方法。本發(fā)明的目的還在于，通過檢測或定量在血中存在的人可溶型L0X-1，提供診斷以心肌梗塞為代表的急性冠脈綜合征的方法、以及評價急性冠脈綜合征的治療藥物及其輔助藥物的藥效的方法。通過使用上述單克隆抗體檢測或定量在血中存在的人可溶型L0X-1，急性冠脈綜合征的診斷和針對急性冠脈綜合征的被試驗藥物的藥效評價能夠比以往方法容易而且早期地進行。因此，本發(fā)明的目的還在于提供單克隆抗體在這樣的急性冠脈綜合征的診斷和藥效評價中的用途。為了解決上述課題，本發(fā)明的發(fā)明人等進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)以與人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合為指標(biāo)而調(diào)制雜交瘤，由該由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體與人可溶型L0X-1的解離常數(shù)為1X10_9(M)以下，具有極高的親和性，還確認(rèn)如果根據(jù)使用了這些單克隆抗體的夾心ELISA法，能夠高靈敏度地檢測和測定反映急性冠脈綜合征病態(tài)的血中可溶型L0X-1的存在。根據(jù)這些見解，確信如果采用使用了本發(fā)明涉及的單克隆抗體的檢查試劑盒，就能夠進行急性冠脈綜合征的高精度診斷，還能夠以高精度評價針對急性冠脈綜合征的被檢驗藥物的藥效。本發(fā)明是基于這樣的見解而完成的發(fā)明，包含下述形態(tài)(I)單克降抗體(I-I)一種單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，具有與人可溶型L0X-1特異性結(jié)合的性質(zhì)。(1-2)如(I-I)所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，其特征在于，與人可溶型L0X-1的解離常數(shù)(Kd)為1X10_9(M)以下。(1-3)如(I-I)或(1-2)所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，其特征在于，由采用包括下述工序的方法調(diào)制的雜交瘤產(chǎn)生(I)將來自原核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域免疫非人動物的工序、(2)從該動物回收抗體產(chǎn)生細胞的工序、(3)融合該抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞的工序、(4)從上述工序中得到的融合細胞中選擇產(chǎn)生與上述人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤的工序、和(5)從該選擇出的雜交瘤中選擇產(chǎn)生與來自真核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤的工序。(1-4)由雜交瘤“Mouse-MousehybridomasLOX-1IA7”(保藏號FERMBP-10645)或“Mouse-MousehybridomasLOX-16B11”(保藏號FERMBP-10646)產(chǎn)生的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物。(1-5)如(I-I)(1-4)中任一項中所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，其中，單克隆抗體的一部分是與人可溶型L0X-1特異性結(jié)合的單克隆抗體的Fab’片段。(II)單克降抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物的用途上述單克隆抗體或其一部分能夠有效利用在血液等體液中存在的人可溶型L0X-1的高靈敏度檢測中，能夠應(yīng)用于急性冠脈綜合征的診斷。另外，這些單克隆抗體或其一部分能夠有效利用在急性冠脈綜合征的治療藥物或輔助治療藥物的藥效評價中。因此，在本發(fā)明中包含下述形態(tài)。(II-I)如(I-I)(1-5)中任一項所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，其用于急性冠脈綜合征的診斷。(II-2)一種急性冠脈綜合征的診斷方法，具有使用(I-I)(1-5)中任一項所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，測定人體液中的可溶型L0X-1的工序。(II-3)如(I-I)(1-5)中任一項所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，用于急性冠脈綜合征的治療藥物或輔助治療藥物的藥效評價。(II-4)一種急性冠脈綜合征的治療藥物或輔助治療藥物的藥效評價方法，具有以投入有急性冠脈綜合征的治療藥物或輔助治療藥物的人體液為對象，使用(I-I)(1-5)中任一項所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，測定該人體液中的可溶型LOX-I的工序。(III)雜交瘤及其調(diào)制方法(III-I)產(chǎn)生(I-I)(1-5)中任一項所述的單克隆抗體的雜交瘤。(III-2)如(III-I)所述的雜交瘤，以人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性成分和來自CHO細胞的可溶型L0X-1的競爭性結(jié)合作為篩選指標(biāo)而調(diào)制。(III-3)如(II-I)或(II-2)所述的雜交瘤，其為“Mouse-MousehybridomasLOX-11A7”(保藏號FERMBP-10645)或“Mouse-MousehybridomasLOX-16B11”(保藏號FERMBP-10646)。(III-4)如(III-I)所述的雜交瘤的調(diào)制方法，包括下述工序(I)將來自原核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域免疫非人動物的工序、(2)從該動物回收抗體產(chǎn)生細胞的工序、(3)融合該抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞的工序、(4)從上述工序中得到的融合細胞中選擇產(chǎn)生與上述人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤的工序、和(5)從該選擇出的雜交瘤中選擇產(chǎn)生與來自真核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤的工序。(ΙΙΙ-5)利用(ΙΙΙ-4)所述的方法調(diào)制的雜交瘤。(ΙΙΙ-6)如(III-I)(ΙΙΙ-3)中任一項所述的雜交瘤，其利用(ΙΙΙ-4)所述的方法調(diào)制。(IV)人可溶型L0X-1檢測用試劑盒及其用涂(IV-I)一種人可溶型L0X-1檢測用試劑盒，包含(1-1)(1-5)中任一項所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物，作為針對人可溶型L0X-1的特異性結(jié)合試劑或人可溶型L0X-1的特異性檢測試劑。(IV-2)如(IV-I)中所述的試劑盒，其為急性冠脈綜合征診斷試劑盒。另外，該試劑盒可以改稱為“包含(I-I)(1-5)中任一項所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物的急性冠脈綜合征診斷試劑盒”。(V)人可溶型L0X-1的特異性檢測方法(V-I)一種人可溶型L0X-1的特異性檢測方法，具有將(I-I)(1_5)中任一項所述的單克隆抗體或其一部分或者它們的標(biāo)記物作為針對人可溶型L0X-1的特異性結(jié)合試劑或特異性檢測試劑使用的工序。由于血液中的可溶型L0X-1量與急性冠脈綜合征的病態(tài)相關(guān)聯(lián)而增加，所以，通過利用上述檢測方法，就能夠?qū)Ρ粰z驗者診斷急性冠脈綜合征病態(tài)的有無及其程度。發(fā)明的效果由于本發(fā)明的單克隆抗體特異性識別人可溶型L0X-1，并以高親和性結(jié)合，所以，在該人可溶型L0X-1的特異性檢測和特異性結(jié)合中有用。如果根據(jù)這樣的本發(fā)明的單克隆抗體、其一部分或者它們的標(biāo)記物(或包含它們的任意一種的人可溶型L0X-1檢測試劑)以及利用其的人可溶型L0X-1的特異性檢測法，就能夠以免疫化學(xué)的方法調(diào)查在機體組織或活體試樣中的可溶型L0X-1的表達分布和存在，從而能夠更詳細地解釋可溶型L0X-1的生理學(xué)作用及意義。另外，如果根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體、其一部分或者它們的標(biāo)記物(或包含它們的任意一種的人可溶型L0X-1檢測試劑)以及利用其的人可溶型L0X-1的特異性檢測法，就能夠以免疫化學(xué)方法或免疫組織學(xué)方法診斷與L0X-1的表達(表達亢進、表達不全/減少)而產(chǎn)生的各種疾病和病態(tài)。作為這些疾病或病態(tài)，可以例示伴隨L0X-1的表達亢進(或起因于表達亢進)的疾病或病態(tài)，例如動脈硬化和作為比其進一步進展的病態(tài)的例如心血管疾病(缺血性心臟病、心律不齊),即急性冠脈綜合征。特別是如實施例中所示，如果根據(jù)組合使用了本發(fā)明的2種單克隆抗體的雙抗體夾心ELISA，即使為每ImL人血清約O.Ing/mL的定量限度，也能夠測定人可溶型L0X-1的血中濃度。這樣的測定定靈敏度相當(dāng)于以往測定方法的大約10倍。具體實施例方式I.單克降抗體及其制造方法以下，通過闡明本發(fā)明中所使用的各種用語的意義，詳細說明本發(fā)明的單克隆抗體及其制造方法。在本發(fā)明中，所謂“L0X-1”，是來自哺乳動物的氧化LDL(0xdizedlowdensitylipoprotein)的受體。在這里，作為哺乳動物，可以列舉人、牛、山羊、兔、小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠等，但優(yōu)選為已經(jīng)在報告中記載的人、牛、兔、大鼠或小鼠的氧化LDL受體(Oxdizedlowdensitylipoproteinreceptor)(Nature,Vol.386,ρ·73-77,1997;脂質(zhì)生化學(xué)研究，Vol.39，ρ·83-84，1997；日本特開平9-98787號公報；GenBankAccessionNo.BAA81912；Biochem.J.，Vol.330(Pt.3)，p.1417-1422,1998)。具體而言，可以列舉具有在序列號I中記載的氨基酸序列的人L0X-1。這樣的L0X-1為帶有糖鏈的約50kDa的II型膜蛋白質(zhì)，從N末端開始，由細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，該細胞外結(jié)構(gòu)域進一步由頸結(jié)構(gòu)域(neckdomain)和凝集素樣結(jié)構(gòu)域(lectin-likedomain)的2個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(合計4個結(jié)構(gòu)域)。其中，凝集素樣結(jié)構(gòu)域作為氧化LDL的識別部位發(fā)揮作用(澤村達也，臨床檢查，Vol.45，No.3，P297)。在人L0X-1(序列號I)的情況下，具體而言，該氨基酸1-36區(qū)域相當(dāng)于細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，氨基酸37-57區(qū)域相當(dāng)于跨膜結(jié)構(gòu)域,氨基酸58-273區(qū)域相當(dāng)于細胞外結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明中，所謂“L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域”，意指上述L0X-1的全部結(jié)構(gòu)中“細胞外結(jié)構(gòu)域”的全部或其一部分。具體而言，意指在作為跨膜蛋白L0X-1中，在細胞膜的外側(cè)存在的部分結(jié)構(gòu)(部分區(qū)域)的全部或一部分。換言之，所謂“L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域”，意指除去了進入膜內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)域和與該結(jié)構(gòu)域連續(xù)的存在于細胞質(zhì)內(nèi)的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域的全部或一部分。在人LOX-U序列號I)的情況下，如上所述，其氨基酸序列的58-273區(qū)域相當(dāng)于“L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域”的全部。所謂“人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分”，意指“L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域”的一部分，除了人L0X-1的氨基酸序列(序列號I)的85-273區(qū)域(序列號2)以外，可以列舉“可溶型L0X-1”等顯示可溶性的部分區(qū)域。在本發(fā)明中，所謂“可溶型L0X-1”，意指切斷(解離)膜中存在的L0X-1的一部分(通常是“細胞外結(jié)構(gòu)域”的一部分)而釋放(分泌)入血的L0X-1的一部分。更具體而言，所謂人可溶型L0X-1，是由人L0X-1的細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分構(gòu)成的可溶型感受器。作為相當(dāng)于人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的可溶型感受器分子的例子，可以例示由人L0X-1的氨基酸序列(序列號I)的88-273區(qū)域(序列號3)構(gòu)成的分子，或由該氨基酸序列(序列號I)的92-273區(qū)域(序列號4)構(gòu)成的分子。另外，在相當(dāng)于人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的分子中，包含位于人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的N端側(cè)的肽。作為該肽，具體而言，可以例示相當(dāng)于可溶型分子的氨基酸序列(序列號3)的1-10區(qū)域的肽(序列號5)和相當(dāng)于可溶型分子的氨基酸序列(序列號4)的1-10區(qū)域的肽(序列號6)。另外，這些肽分別相當(dāng)于人L0X-1的氨基酸序列(序列號I)的88-97區(qū)域和92-101區(qū)域。作為本發(fā)明對象的所謂“單克隆抗體”，是與上述人可溶型L0X-1特異性結(jié)合的單克隆抗體。在人血液中存在著具有L0X-1的一部分開裂生成的以序列號3或4表不的氨基酸序列的可溶型L0X-1，由于其量隨著急性冠脈綜合征的進展而增加，所以，認(rèn)為該可溶型L0X-1能夠成為反映該急性冠脈綜合征的診斷指標(biāo)，具體而言，能夠成為反映動脈硬化和起因于動脈硬化而發(fā)病的缺血性心臟病的病態(tài)的診斷指標(biāo)(林田等，Circulation,2005,112(6)，ρ·812-818)。因此，作為本發(fā)明的對象的“單克隆抗體”，適合地是對具有以序列號3或4表示的氨基酸序列的人可溶型L0X-1具有高親和性的抗體。對這樣的人可溶型L0X-1具有特異性結(jié)合性的本發(fā)明的“單克隆抗體”，能夠?qū)⑷薒0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分(包括天然體、重組體、合成物、細胞培養(yǎng)上清)作為免疫原使用而調(diào)制。具體而言，首先以人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分作為免疫原，另外，根據(jù)需要，與弗氏佐劑同時使用，在非人哺乳動物，優(yōu)選在小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、貓、犬、豬、山羊、綿羊、驢、馬或牛(包括人抗體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠那樣的為了產(chǎn)生來自其它動物的抗體而制出的轉(zhuǎn)基因動物)，更優(yōu)選在小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔的皮下內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、足墊內(nèi)或腹腔內(nèi)I次乃至數(shù)次地注射，由此施加免疫致敏。通常，從初次免疫起，每約I21日進行I4次免疫，自末次免疫約I10日后，能夠從被免疫致敏的該非人哺乳動物取得抗體產(chǎn)生細胞。施加免疫的次數(shù)和時間間隔能夠根據(jù)使用的免疫原的性質(zhì)而適當(dāng)變更。另外，作為在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、免疫原(半抗原)和篩選中所使用的“人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分”，例如，可以例示下述的物質(zhì)。另外，下述任何一種也可以是以高濃度包含人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的部分(fraction)。(甲)在細胞表面表達人L0X-1的細胞或者為了在細胞表面表達而人工建立的細胞株、或者培養(yǎng)為了在細胞表面表達人L0X-1而使用基因重組技術(shù)制成的基因重組細胞所得到的培養(yǎng)上清、或者從該培養(yǎng)上清純化得到的人可溶型L0X-1；(乙)培養(yǎng)為了將人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域作為蛋白質(zhì)表達而使用基因重組技術(shù)制成的基因重組細胞所得到的培養(yǎng)上清、或者從該培養(yǎng)上清純化得到的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域；或(丙)化學(xué)合成的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的N末端區(qū)域。具體而言，作為(甲)的人可溶型L0X-1，例如，可以列舉在細胞培養(yǎng)液中分泌的人可溶型L0X-1。這是因為在細胞培養(yǎng)液中分泌的可溶型L0X-1最接近天然的人可溶型L0X-1的緣故。該人可溶型L0X-1，如在實施例1(2)中記載的方法那樣，能夠采用基因工程的方法調(diào)制(參照日本特開2002-17353號公報等)。另外，作為(乙)的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域，可以列舉人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域(序列號I的氨基酸序列58-273區(qū)域)的一部分(例如序列號2)。該部分區(qū)域如在實施例1(1)中記載的方法那樣，能夠采用基因工程的方法調(diào)制。進而，作為(丙)的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的N末端區(qū)域，可以列舉具有在序列號5或6中記載的氨基酸序列的肽。當(dāng)該肽作為半抗原使用時，必須使之與牛血清白蛋白(BSA)等高分子結(jié)合。作為在本發(fā)明中所使用的免疫原，優(yōu)選為(乙)的來自大腸桿菌等原核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域。分泌單克隆抗體的雜交瘤的調(diào)制，可以按照科勒和米爾斯坦等的方法(Nature，1975，Vol.256，p.495-497)以及基于此方法的方法進行。即，使從如上述那樣免疫致敏的非人哺乳動物取得的脾臟、淋巴結(jié)、骨髓或扁桃體等，優(yōu)選在脾臟中包含的抗體產(chǎn)生細胞與優(yōu)選來自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人等哺乳動物，更優(yōu)選來自小鼠、大鼠或人的自身沒有產(chǎn)生抗體能力的骨髓瘤細胞進行細胞融合，由此能夠調(diào)制雜交瘤。作為在細胞融合中所使用的骨髓瘤細胞，例如，能夠使用來自小鼠的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/l-Ag4-l(NS-I)、P3/X63_Ag8.Ul(P3U1)、SP2/0_Agl4(Sp2/0、Sp2)、PAI、FO或BW5147;來自大鼠的骨髓瘤210RCY3_Ag.2.3;來自人的骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、DlRll或CEM-T15。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤克隆的篩選通過下述方法進行首先，在例如微量滴定板中培養(yǎng)雜交瘤，利用RIA和ELISA等免疫測定法測定可見到增殖的孔的培養(yǎng)上清對上述非人動物的免疫致敏中使用的免疫原(上述(甲)(丙)的任意一個，優(yōu)選以(乙)的方法調(diào)制得到的來自原核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分)的反應(yīng)性，選擇產(chǎn)生對該免疫原產(chǎn)生顯示特異性親和性單克隆抗體的克隆。在該方法中，通常采用將免疫原固相化、使用以酶標(biāo)記的第二抗體檢測與其結(jié)合的培養(yǎng)上清中的抗體的非競爭法ELISA。但是，由于該非競爭法也檢測非特異性結(jié)合，所以，難以僅檢測特異性結(jié)合的抗體。而且，一般而言，以大腸桿菌等原核生物的細胞表達蛋白質(zhì)時，其立體結(jié)構(gòu)與天然的不同。對于以大腸桿菌表達的人LOX-I細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，大多變成沉淀物。因此，雖然可以使用該沉淀和上清的懸濁液作為免疫原，但在該情況下，預(yù)想產(chǎn)生的抗體也大多包含與不同于天然的人可溶型L0X-1的沉淀等變性蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人階段性地進行下述的⑴和(2)的篩選，其結(jié)果，選擇得到了與天然型的人可溶型L0X-1具有極高親和性而結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤。(I)使雜交瘤培養(yǎng)上清中的抗體與固相化的第二抗體結(jié)合，在其中首先添加來自原核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，使之與以生物素標(biāo)記的人可溶性L0X-1競爭反應(yīng)，選擇產(chǎn)生與來自原核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分反應(yīng)的抗體的雜交瘤。(2)使用上述所選擇的雜交瘤的培養(yǎng)上清，使其中所含的抗體與固相化的第二抗體結(jié)合，并使來自真核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分和以生物素標(biāo)記的人可溶性L0X-1與之競爭反應(yīng)，選擇產(chǎn)生與來自真核細胞的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分反應(yīng)的抗體的雜交瘤。由雜交瘤制造單克隆抗體能夠通過下述方法進行體外培養(yǎng)雜交瘤或在小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔等非人哺乳動物、優(yōu)選在小鼠或大鼠、更優(yōu)選在小鼠的腹水中等中培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)上清或哺乳動物的腹水中分離。在體外培養(yǎng)的情況下，結(jié)合所培養(yǎng)的細胞種的特性、試驗研究的目的和培養(yǎng)方法等各種條件，使雜交瘤增殖、維持和保存，能夠使用用于使單克隆抗體在培養(yǎng)上清中產(chǎn)生而使用的那樣的已知營養(yǎng)培養(yǎng)基或從已知的基本培養(yǎng)基衍生調(diào)制的所有的營養(yǎng)培養(yǎng)基而實施。作為基本培養(yǎng)基，例如，可以列舉Ham’F12培養(yǎng)基、MCDB153培養(yǎng)基或低鈣MEM培養(yǎng)基等低鈣培養(yǎng)基以及MCDB104培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、D-MEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、ASF104培養(yǎng)基或RD培養(yǎng)基等高鈣培養(yǎng)基等，該基本培養(yǎng)基，根據(jù)目的，可以含有例如血清、激素、細胞因子和/或各種無機或有機物質(zhì)等。單克隆抗體的分離、純化能夠通過將上述的培養(yǎng)上清或腹水供給飽和硫酸銨、離子交換色譜(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白或蛋白A柱等親和色譜等而進行。本發(fā)明的單克隆抗體，可以是具有IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgAUIgA2)>IgD或IgE的任意亞型的單克隆抗體。優(yōu)選是IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4),更優(yōu)選是IgGl或IgG2，特別優(yōu)選是IgGl。在本發(fā)明中，所謂“單克隆抗體的一部分”，是上述本發(fā)明的單克隆抗體的一部分，意指與該單克隆抗體同樣具有與人可溶型L0X-1特異性結(jié)合性的區(qū)域(以下，也將其簡稱為“抗體片段”)。作為這樣的片段，具體而言，可以列舉對上述人可溶型L0X-1具有特異性結(jié)合性的Fab(fragmentofantigenbinding)、F(ab，)2、Fab’、單鏈抗體singlechainFv(以下表示為“scFv”)、2倍體化V區(qū)片段(以下表示為Diabody)、二硫化物穩(wěn)定化抗體(disulfidestabilizedFv;以下表不為“dsFv”)、dAd(singledomainantibody)、包含CDR的妝等(ExpertOpiniononTherapeuticPatents,第6卷，第5號，第441456頁，1996年)。Fab是由H鏈的N末端側(cè)約一半和L鏈全部構(gòu)成的分子量約5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。該Fab能夠通過以木瓜蛋白酶在IgG的鉸鏈區(qū)分解交聯(lián)2根H鏈的2個二硫鍵(S-S鍵)上部的肽部分而調(diào)制，在本發(fā)明中所使用的Fab也能夠以木瓜蛋白酶處理上述本發(fā)明的單克隆抗體而得到?；蛘咭材軌蛲ㄟ^將編碼上述本發(fā)明的單克隆抗體的Fab的DNA插入動物細胞用表達載體中，將該載體導(dǎo)入動物細胞中使之表達而制造Fab。F(ab’)2是2個Fab’區(qū)域以鉸鏈部分結(jié)合而構(gòu)成的分子量約10萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。該F(ab’)2可以通過以胃蛋白酶分解IgG的鉸鏈區(qū)的2個S-S鍵的下部而調(diào)制，在本發(fā)明中所使用的F(ab’)2也能夠以胃蛋白酶處理上述本發(fā)明的單克隆抗體而得到?；蛘咭材軌蛲ㄟ^將編碼該單克隆抗體的F(ab’)2的DNA插入動物細胞用表達載體中，將該載體導(dǎo)入動物細胞中使之表達而制造F(ab’)2。Fab’是切斷上述F(ab’)2的鉸鏈之間的S-S鍵而得到的分子量約5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。在本發(fā)明中所使用的Fab’能夠通過以還原劑二硫蘇糖醇處理上述本發(fā)明的單克隆抗體的F(ab’)2而得到?；蛘咭材軌蛲ㄟ^將編碼該單克隆抗體的Fab’的DNA插入動物細胞用表達載體中，將該載體導(dǎo)入動物細胞中使之表達而制造Fab’。scFv是使用適當(dāng)?shù)碾慕宇^(以下表示為P)連接一根VH和一根VL得到的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并為具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。在本發(fā)明中所使用的scFv中包含的VH和VL可以是上述本發(fā)明的單克隆抗體的VH和VL。本發(fā)明中所使用的scFv能夠通過從生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤取得編碼VH和VL的cDNA，構(gòu)建scFv表達載體，導(dǎo)入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使之表達而制造。dsFv指的是使分別將VH和VL中的I個氨基酸殘基取代為半胱氨酸殘基而得到的多肽通過S-S鍵結(jié)合得到的片段。取代為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基能夠按照由Reiter等公開的方法(ProteinEngineering,7,697(1994)),基于抗體的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測來選擇。在本發(fā)明中所使用的dsFv中包含的VH和VL可以是本發(fā)明的單克隆抗體的VH和VL。本發(fā)明中所使用的dsFv能夠通過從生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤取得編碼VH和VL的cDNA，插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體而構(gòu)建dsFv表達載體,將該表達載體導(dǎo)入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使之表達而制造。Diabody是抗原結(jié)合特異性相同或不同的scFv形成2倍體的抗體片段,是具有對相同抗原的2價抗原結(jié)合活性或?qū)Σ煌乖奶禺惪乖Y(jié)合活性的抗體片段。例如，在本發(fā)明的單克隆抗體中特異性反應(yīng)的2價Diabody，能夠通過取得編碼本發(fā)明的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼具有310個殘基的肽接頭的scFv的DNA，將該DNA插入動物細胞用表達載體中，再將該表達載體導(dǎo)入動物細胞中而使Diabody表達而制造。包含⑶R的肽，由包含VH或VL的⑶R的至少I個區(qū)域以上而構(gòu)成。多個⑶R能夠通過直接或適當(dāng)?shù)碾慕宇^而結(jié)合。包含本發(fā)明所使用的CDR的肽，能夠通過取得編碼本發(fā)明的單克隆抗體的VH和VL的cDNA后，構(gòu)建編碼CDR的DNA，將該DNA插入動物細胞用表達載體中，再將該表達載體導(dǎo)入動物細胞中使該載體表達而制造。另外，包含CDR的肽也能夠通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法制造。作為“單克隆抗體的一部分”，可以優(yōu)選列舉以胃蛋白酶處理本發(fā)明的單克隆抗體(IgG)而得到的F(ab’)2。作為表示單克隆抗體或其一部分對抗原的親和性的指標(biāo)所使用的解離常數(shù)(Kd)，能夠按照各種方法解析。例如，使用以各種標(biāo)記劑標(biāo)記的抗原的Scatchard法、使用市售的測定試劑盒Biacore系統(tǒng)(Amersham-Pharmacia公司生產(chǎn))或類似的試劑盒，按照在該試劑盒中附加的使用說明書和實驗操作方法而能夠容易地解析。使用這些方法而求出的Kd值以M(摩爾)表示。被試驗的單克隆抗體的解離常數(shù)(Kd值)越小，表示具有越強的親和性。在本發(fā)明作為對象的單克隆抗體或其一部分中，包含與人可溶型L0X-1的解離常數(shù)(Kd)為1X10_9(M)以下、優(yōu)選為5X10,(M)以下、更優(yōu)選為2XICTici(M)以下的與人可溶型L0X-1特異性結(jié)合的人單克隆抗體或其一部分。本發(fā)明作為對象的單克隆抗體或其一部分的解離常數(shù)如果在IXIO-9(M)以下，則對人可溶型L0X-1的親和性非常高，因此能夠達到以往不能達到的人可溶型L0X-1的高靈敏度的檢測和定量。特別是如果根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體，則能夠克服健康正常人血清中的可溶型L0X-1濃度很低而采用以往的測定方法不能正確測定的問題。另一方面，雖然報告了使用類似免疫原得到的單克隆抗體(W001/64862)，但是其為以治療為目的的人型抗體，公開的任一種單克隆抗體的解離常數(shù)也顯示大于IX10_8(M)的值。認(rèn)為這種程度的解離常數(shù)，在測定健康正常人或慢性期之類的血清中的可溶型L0X-1濃度低的被檢驗者時，從靈敏度方面考慮，不能達到作為診斷標(biāo)記物的目的(參照實施例5(9))。本發(fā)明作為對象的單克隆抗體中，作為更適合的抗體，如在實施例中所示的那樣，可以列舉由雜交瘤6B11或1A7產(chǎn)生的單克隆抗體。由這些雜交瘤6B11和1A7產(chǎn)生的各單克隆抗體的“解離常數(shù)(Kd)”表示如下。[表I]I克隆抗體Kd(XlO-10M)1A7—5.I—6B11I3.4—關(guān)于該雜交瘤6B11和1A7,分別作為“Mouse-MousehybridomasL0X_llA7”和“Mouse-MousehybridomasL0X_16Bll”，在2006年7月26日被國際保藏在住所為日本國茨城縣筑波市東I丁目I番I中央第6的國家高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院國際專利生物保藏中心。各雜交瘤的受領(lǐng)號和保藏號如下。[表2]雜交瘤的表示受領(lǐng)號保藏號^“Mouse-MousehybridomaFERMABP-10645FERMBP-10645sLOX-11A7”“Mouse-MousehybridomaFERMABP-10646FERMBP-10646sLOX-16B11”II.可溶型L0X-1檢測用試劑盒和使用其的可溶型L0X-1的特異性檢測方法上述的本發(fā)明的單克隆抗體及其一部分(抗體片段)與人可溶型L0X-1具有高親和性而特異性結(jié)合。因此，如果采用本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段，利用免疫測定法，就能夠選擇性且特異性檢測人可溶型LOX-I。因此，本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段，能夠作為調(diào)查人可溶型L0X-1的組織定位及其表達程度、或檢測可能在被檢驗試樣中存在的人可溶型L0X-1的用于定量的免疫學(xué)試劑(例如，免疫電泳用試劑和免疫測定用試劑等)有效地利用。即，上述本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段，在利用免疫電泳法或免疫測定法檢測和測定人可溶型L0X-1時，能夠作為對人可溶型L0X-1的特異性結(jié)合試劑或特異性檢測試劑(免疫學(xué)試劑)有效地使用。在這里，作為免疫測定法的例子，可以列舉直接或間接的競爭試驗或非競爭試驗(例如夾心法等)。另外，在免疫電泳法或免疫測定法中，包含蛋白質(zhì)印跡法、熒光抗體法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA法)、免疫組織染色法和免疫細胞染色法等免疫組織化學(xué)染色法(ABC法、CSA法等)、免疫沉降法等(単々口一>抗體実験^二工了>，講壇社Scientific(1987);続生化學(xué)実験講座5，免疫生化學(xué)研究會(東京化學(xué)同人(1986)等)。本發(fā)明提供用于利用免疫電泳法或免疫測定法特異性檢測或測定人可溶型L0X-1的試劑盒。該本發(fā)明是用于利用抗原-抗體反應(yīng)檢測和測定被檢試樣中的人可溶型L0X-1的存在或其量的試劑盒，其特征在于，包含上述本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段作為對人可溶型L0X-1的特異性結(jié)合試劑成分或特異檢測試劑成分。另外，也可以使用對人可溶型L0X-1具有特異性結(jié)合的其一部分(抗體片段)代替本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段。本發(fā)明的單克隆抗體或其一部分(抗體片段)，作為免疫測定用的試劑，既可以原樣使用，也可以以結(jié)合在固體支持體上的形態(tài)使用。在這里，作為使這些單克隆抗體或抗體片段結(jié)合的固體支持體，能夠任意使用本領(lǐng)域公知的固體支持體，例如，可以列舉玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然/改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂和磁石等。另外，在這些固體支持體中，包括反應(yīng)皿的孔、試管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝酸纖維素帶、膜、乳膠顆粒等。單克隆抗體或抗體片段與這些固體支持體的結(jié)合方法也是公知的，本發(fā)明也能夠適用該公知的方法。另外，本發(fā)明的單克隆抗體及其抗體片段，作為免疫電泳用和免疫測定用等免疫學(xué)試劑，既可以原樣使用，也可以采用以任意標(biāo)記劑標(biāo)記的標(biāo)記物的形態(tài)使用。作為在本發(fā)明中能夠使用的標(biāo)記劑，可以廣泛地列舉作為向單克隆抗體結(jié)合的標(biāo)記劑在本領(lǐng)域公知的酶(例如堿性磷酸酯酶(ALP)、過氧化物酶(HRP)等)、放射性同位素(例如125I、3H、14C等)、熒光性化合物(例如熒光素異硫氰酸鹽(FITC)、四甲基若丹明異硫氰酸鹽(RITC)等)、化學(xué)發(fā)光性化合物和生物發(fā)光性化合物等。另外，以這些作為標(biāo)記劑使用的免疫測定法，稱為酶免疫分析(EIA)、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、熒光免疫分析、發(fā)光免疫分析等。優(yōu)選以酶作為標(biāo)記劑使用的免疫測定法(EIA、ELISA)，具體而言，可以列舉使用堿性磷酸酯酶(ALP)作為酶、使用化學(xué)發(fā)光底物APS-5(phosphoricacidmono-[(4-chloro-phenylsulfanyl)-(10-methyl-10H-acridin-9-ylidene)-methyl]esterdisodiumsalt(LumigenAPS-5,OrientalYeastCo.，Ltd.)作為檢測用的顯色底物的ELISA法,和使用過氧化物(HRP)作為酶、使用比色底物四甲基聯(lián)苯胺作為檢測用的顯色底物的ELISA法。本發(fā)明提供的適合的人可溶型L0X-1檢測用試劑盒，是使用與人可溶型L0X-1特異性結(jié)合的2個單克隆抗體的夾心ELISA用的試劑盒。在該試劑盒中，至少包含在固體支持體上被固定化的本發(fā)明的單克隆抗體或其片段、以上述標(biāo)記劑標(biāo)記的本發(fā)明的單克隆抗體或其片段、以及與該標(biāo)記劑反應(yīng)而顯色、發(fā)熒光或發(fā)光的底物。此時，作為標(biāo)記劑，優(yōu)選上述的酶，特別可以列舉堿性磷酸酯酶(ALP)，另外，作為底物，可以優(yōu)選列舉APS-5。根據(jù)這樣的夾心ELISA，能夠以更高的靈敏度檢測可溶型L0X-1。另外，采用這些標(biāo)記劑的標(biāo)記方法和間接由標(biāo)記化進行的修飾方法、以及它們的檢測方法等，能夠按照自身公知的方法進行(《単々口一>抗體》巖崎辰夫他著，講壇社Scientific,1984年；《酵素免疫測定法》第2版，石川榮治他著，醫(yī)學(xué)書院，1982年等)。在本發(fā)明的試劑盒中，除上述本發(fā)明的單克隆抗體、其抗體片段或者它們的標(biāo)記物外，根據(jù)免疫電泳法或免疫測定法等的用途，還可以包含適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)液、稀釋液、洗凈液、人可溶型L0X-1的標(biāo)準(zhǔn)液、轉(zhuǎn)印溶液、電泳溶液、反應(yīng)停止液、抗體檢測試劑、標(biāo)記活性測定試劑、染色液、反應(yīng)板、硝酸纖維素過濾器、聚丙烯酰胺凝膠等。另外，在這里，作為抗體檢測試劑，可以列舉與本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的二次抗體，例如，以放射性物質(zhì)或酶等標(biāo)記的抗IgG抗體和蛋白質(zhì)A等。通過利用包含與本發(fā)明的單克隆抗體、抗體片段或它們標(biāo)記物結(jié)合或檢測的試劑的上述試劑盒，按照一般的免疫電泳法和免疫測定法，能夠簡便、特異且高靈敏度地檢測和測定人可溶型L0X-1。因此，本發(fā)明還提供一種人可溶型L0X-1的特異性測定方法，其特征在于，使用本發(fā)明的單克隆抗體、抗體片段或者它們的標(biāo)記物作為對人可溶型L0X-1的特異性結(jié)合試劑或特異性檢測試劑。本發(fā)明的測定方法必須是將上述本發(fā)明的單克隆抗體、抗體片段或者它們的標(biāo)記物作為對人可溶型L0X-1的特異性結(jié)合試劑或特異性檢測試劑使用的方法，在該限定內(nèi)，其它的基本操作等沒有特別限制，能夠廣泛采用在通常的免疫電泳法或免疫測定法中慣用的方法。因此，利用本發(fā)明的單克隆抗體、抗體片段或者它們的標(biāo)記物的抗原-抗體反應(yīng)，以及產(chǎn)生的抗原-抗體結(jié)合物和抗體檢測試劑的反應(yīng)條件也沒有特別限制，可以采用通常的免疫反應(yīng)中的條件。通常，可以列舉在45°C以下、優(yōu)選約在440°C、更優(yōu)選在2540°C左右的溫度條件下，pH在約59左右下、約O.540小時、優(yōu)選I20小時左右放置或孵育的方法。本發(fā)明提供的適合的人可溶型L0X-1的測定法，是使用與人可溶型L0X-1特異性結(jié)合的2個單克隆抗體的夾心ELISA法(雙抗體夾心ELISA法)。該方法是使被檢驗試樣和人可溶型L0X-1的標(biāo)準(zhǔn)液(抗原)與固定有與人可溶型L0X-1特異性結(jié)合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段的固體支持體(固相化抗體)結(jié)合，接著使其與用標(biāo)記劑標(biāo)記的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段(標(biāo)記抗體)反應(yīng)，使固相化抗體-抗原(人可溶型L0X-1)-標(biāo)記抗體的夾心型復(fù)合體形成，基于由其標(biāo)記劑與底物的反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)光而檢測或定量這樣形成的復(fù)合體的方法。由于本發(fā)明的單克隆抗體、其抗體片段和它們的標(biāo)記物特異性識別人可溶型L0X-1且以高親和性結(jié)合，所以，利用含有該抗體的上述試劑盒的人可溶型L0X-1測定法，除了用于被檢試樣(例如血液、尿等)和各種組織中的人可溶型L0X-1的特異性檢測和定量、人可溶型L0X-1表達組織的分布測定、以及利用了親和性的人可溶型L0X-1的純化以夕卜，在伴隨人可溶型LOX-I表達的增加(或起因于人L0X-1表達的增加)的各種疾病的免疫化學(xué)和免疫組織學(xué)的診斷中有用。如在現(xiàn)有技術(shù)欄中所述的那樣，L0X-1作為氧化LDL受體發(fā)揮功能，在動脈硬化病變中的粥樣斑塊的形成中，在通過聚集在血管內(nèi)膜的巨噬細胞中的氧化LDL受體(L0X-1)攝入而產(chǎn)生膽固醇酯在細胞內(nèi)的蓄積中占有主要作用。另外，在實際中，顯示在覆蓋動脈硬化初期病變的血管內(nèi)皮細胞和進行的動脈硬化斑塊的內(nèi)膜平滑肌細胞和巨噬細胞中，L0X-1的表達被增強。這樣，通過氧化LDL受體(L0X-1)攝入氧化LDL，不僅關(guān)系到在血管內(nèi)皮細胞中的功能障礙，而且也關(guān)系血管平滑肌細胞的功能障礙和巨噬細胞的泡沫細胞化，與動脈粥樣硬化的進展有密切關(guān)系。而且，顯示L0X-1的一部分在細胞外結(jié)構(gòu)域的膜近處部位被切斷，在血液中作為可溶型分子(可溶型L0X-1)存在。這樣，由于可溶型L0X-1的血中濃度反映體內(nèi)細胞中的L0X-1的表達的程度，所以作為反映急性冠脈綜合征的病態(tài)的診斷標(biāo)記物而受到關(guān)注，認(rèn)為通過對其進行測定，能夠早期診斷急性冠脈綜合征(MedicalTribune,1999，Vol.32，No.31，p6!Circulation,2005，112(6)，p.812-818)。因此，如果根據(jù)利用了包含上述本發(fā)明的單克隆抗體、其抗體片段或者它們的標(biāo)記物的試劑盒的人可溶型L0X-1測定法，就能夠通過測定被檢者的血液中的人可溶型L0X-1而對該被檢者診斷急性冠脈綜合征的危險程度。特別是在急性冠脈綜合征的復(fù)發(fā)危險程度的診斷中也有效(W02007/072896)。另外，如上所述，由于人可溶型L0X-1的血中濃度成為反映急性冠脈綜合征病態(tài)的生物標(biāo)記物，所以，通過將該濃度作為指標(biāo)，能夠評價針對急性冠脈綜合征的被檢藥物的藥效。具體而言，如果根據(jù)利用了包含本發(fā)明的單克隆抗體、其抗體片段或者它們的標(biāo)記物的試劑盒的人可溶型L0X-1測定法，例如，在急性冠脈綜合征的臨床試驗中，通過測定被檢者血液中的人可溶型L0X-1，就能夠容易地判斷治療藥物對該被檢者的藥效。另外，如果根據(jù)上述人可溶型L0X-1測定法，就能夠通過測定該被檢者的血液中的人可溶型L0X-1，容易地判斷被檢藥物對急性冠脈綜合征患者的治療效果。實施例以下，列舉實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限定。實施例I「標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的調(diào)制I作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如下述所示那樣調(diào)制⑴人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域、和(2)來自CHO細胞的可溶型L0X-1。(I)LOX-I細胞外結(jié)構(gòu)域蛋白將編碼人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的序列(序列號2)重組入pQE載體(Qiagen)中，制作質(zhì)粒(pQE_hL0X_l)，將其導(dǎo)入大腸桿菌(高速轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，NipponGene株式會社生產(chǎn))。在含有氨節(jié)青霉素100V-g/mL和硫酸卡那霉素25μg/mL的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基50mL中培養(yǎng)一晚，制作起始物質(zhì)，將其移入IL培養(yǎng)基后，添加O.5mol/LIPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，培養(yǎng)4小時。離心分離培養(yǎng)基(SOOOmirT1,10分鐘),在IOmL含有0.5mL的Proteaseinhibitorcocktail(Sigma生產(chǎn))和20mg溶菌酶的緩沖液A(含有ImMEDTA的0.05MTris鹽酸緩沖液，pH8.0)中懸浮所收集的大腸桿菌，冰冷下放置I小時。接著，以超聲波處理(I分鐘10次)破碎，離心^ΟΟΟπιΓ1，15分鐘)，收集沉淀。以8mL緩沖液B(含有8M尿素、O.IMNaH2PO4·2H20的0.OlMTris鹽酸緩沖液，ρΗ8·O)將該不溶性成分溶化，在其中加入8mLNi-NTAagarose凝膠(Qiagen生產(chǎn))，室溫混合I小時。接著，將凝膠移入空柱(I.IidX13cm)，以含有20mmol/L咪唑的緩沖液B充分洗凈后，以含有250mmol/L咪唑的緩沖液B洗脫L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(sLOX-1-D)。將該蛋白質(zhì)洗脫成分對O.05mol/L磷酸鹽緩沖液(PH9.0)透析。將透析時加入的尿素濃度以4、2、1和Omol/L階段性降低，進行蛋白質(zhì)的重新折疊。通過透析，使全部成分的90%以上沉淀，最終得到的人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)可溶成分(稱為“sLOX-1-D”)為2.4mg/15mL。以SDS-PAGE檢查得到的sLOX-1-D，幾乎為一條帶，確認(rèn)是幾乎單一的sLOX-1-D。(2)來自CHO細胞的可溶型L0X-1在人L0X-1表達CHO細胞的培養(yǎng)液中被分泌的sL0X_l，認(rèn)為最接近天然的人可溶型L0X-1。因此，編碼人L0X-1的cDNA重組入pVP22/myc_his載體(Invitrogen生產(chǎn))中，制作PVP22/myc-his-LOX-1,并將其轉(zhuǎn)染CHO細胞，制成穩(wěn)定細胞(stablecell)(人L0X-1(帶有C-myc-his標(biāo)簽)表達CHO細胞)。在加入了20mL培養(yǎng)液(含有IOvol%FCS(FetalCalfSerum)和O.04g/dLG-418的Ham’sF_12培養(yǎng)基)的培養(yǎng)瓶(80cm2)中培養(yǎng)(37°C,5%CO2)該人L0X-1(帶有C-myc-his標(biāo)簽)表達CHO細胞，按照下述方法由該培養(yǎng)細胞進行傳代。首先，每34日將培養(yǎng)的燒瓶更換培養(yǎng)基，直到細胞成為密集狀態(tài)時，進行胰蛋白酶-EDTA處理，將集聚的細胞移到幾個培養(yǎng)瓶中，進行傳代培養(yǎng)。另外，細胞冷凍保存一部分，其它部分用于擴大培養(yǎng)。在擴大培養(yǎng)中，在加入了約5XIO6個細胞的3層培養(yǎng)瓶(500cm2，培養(yǎng)液150mL)中37°C培養(yǎng)46日，再更換為無血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)2日后，將該培養(yǎng)上清進行超濾(O.22μm過濾器)，加入O.33mL濃縮10倍的ProteaseinhibitorcocktaiI,冷凍保存。收集該L0X-1(附有C-myc-his標(biāo)簽)表達CHO細胞培養(yǎng)上清，硫酸銨鹽析、透析、濃縮后，使用Ni-NTAagarose(Qiagen生產(chǎn))柱進行親和性純化。從Ni-NTAagarose柱洗脫時，精細改變咪唑濃度為5、10、20、50和100mmol/L，進行洗凈，并使用250mmol/L的咪唑洗脫采取目的蛋白質(zhì)(來自CHO細胞的sLOX-Ι)。實施例2「TR_FIA法和使用該方法的抗體價及親和性的測定]作為抗體的篩選法，構(gòu)建了TR-FIA(time-resolvedfluoroimmunoassay)法。該方法的原理如下在第二抗體固相化板上加入被檢抗體試樣，使生物素標(biāo)記的抗原(生物素標(biāo)記的sLOX-1-D)與其結(jié)合，生成復(fù)合體，以銪(Eu)標(biāo)記的抗生物素蛋白(或Eu標(biāo)記抗生物素蛋白鏈菌素)標(biāo)記生成的復(fù)合物(第二抗體-抗sLOX-Ι抗體-生物素標(biāo)記sLOX-1-D)，通過時間分辨熒光法檢測(參照圖I)。在該反應(yīng)體系中，添加在實施例1(1)或⑵中調(diào)制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(sLOX-1-D或來自CHO細胞的sLOX-Ι)，使之與生物素標(biāo)記的sLOX-1-D競爭，抑制被檢抗體試樣與生物素標(biāo)記的sLOX-1-D的結(jié)合，由此能夠測定被檢抗體試樣對上述各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(sLOX-1-D或來自CHO細胞的sLOX-Ι)的親和性。(I)sLOX-1-D的生物素化(生物素標(biāo)記sLOX-1-D的調(diào)制)使用生物素化試劑(sulfo-NHS-LC-biotin，Pierce生產(chǎn))將實施例I(I)中調(diào)制的人LOX-I細胞外結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(sLOX-1-D)生物素化。即，按照手冊進行下述的方法。⑴在0.25mL反應(yīng)緩沖液(0.I摩爾/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4)中溶解0.06mgsL0X-l-D(3X10_9摩爾)，在其中加入溶解了0.025mgsulfo-NHS-LC-biotin(4.5X1(T8摩爾)(Pierce生產(chǎn))的0.025mL反應(yīng)緩沖液。(ii)室溫攪拌2小時進行反應(yīng)。(iii)反應(yīng)后，通過凝膠過濾(ro-10，Amersham生產(chǎn))分離取得目的物(生物素標(biāo)記sLOX-1-D)，然后濃縮。(2)第二抗體固相化板的調(diào)制作為第二抗體，使用以MAPS-II試劑盒(BioRad生產(chǎn))由山羊抗鼠IgG血清(柴山羊)純化而得到的IgG成分(15.8mg/mL)。使用該IgG成分時，在固相化緩沖液(含有0.05g/dL氮化鈉的0.05摩爾/L的Tris緩沖液，pH7.8)中調(diào)制為10ug/mL，在微量滴定板(maxisoapfluoro,Nunc生產(chǎn))的各孔中分別注入100iiL。室溫靜置一晚以上后，以封閉緩沖液(在IOOmL精制水和加入IOOmL固相化緩沖液溶解20g/dL蔗糖和blockase(I包4g，雪印乳業(yè)))洗凈2次，再加入200UL封閉緩沖液，靜置5小時以上。吸引封閉緩沖液，將該板減壓下室溫干燥，作為第二抗體固相化干板(4°C保管)。(3)抗體量(抗體價)的測定方法以洗凈液(含有0.01g/dLTween20和0.05g/dL氮化鈉的生理食鹽水)2次洗凈在⑵中調(diào)制的第二抗體固相化板后，在各孔中加入50iiL被檢抗體試樣和IOOiiL標(biāo)記抗原混合液(生物素標(biāo)記sLOX-1-D和Eu標(biāo)記抗生物素蛋白的等量混合物)，在4°C孵育16小時，洗凈3次。接著，加入150iiL增強試劑(以精制水使1.39g鄰苯二甲酸氫鉀、6.Og醋酸、19.3mgT0P0(tri-n-octylphosphineoxide)、4.59mgNFA(2-naphthoyltrifluoroacetone)和I.OgTritonX-100成為1L),由多標(biāo)記計數(shù)器(1420ArboSX，Wallach生產(chǎn))測定被固定在固相的銪(Eu)的時間分辨熒光強度。這樣，根據(jù)熒光強度帶來100000個讀數(shù)的被檢抗體的稀釋倍數(shù)，能夠求出被檢抗體試樣的抗體價。另外，在本測定中，作為在試劑調(diào)制等中使用的試驗緩沖液，可以列舉含有0.5g/dLBSA,0.05g/dL氮化鈉、0.98mg/dLDTPA、0.IgTween80和0.9g/dL氯化鈉的0.05摩爾/L的Tris緩沖液(pH7.4)。(4)抗體對人可溶型L0X-1的親和性的評價方法(抑制曲線)在⑵調(diào)制的第二抗體固相化板的孔中加入50UL被檢抗體試樣的稀釋液、50uL人可溶型L0X-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(sLOX-1-D或來自CHO細胞的sL0X_l),50uL標(biāo)記抗原混合液(生物素標(biāo)記sLOX-1-D和Eu標(biāo)記抗生物素蛋白的等量混合物)后，4°C孵育一晚，3次洗凈。接著，加入150iiL增強試劑，由多標(biāo)記計數(shù)器(1420ArboSX,Wallach生產(chǎn))測定被固定在固相的銪(Eu)的時間分辨熒光強度。階段性改變配合的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度，測定被檢抗體試樣和生物素標(biāo)記sLOX-1-D的結(jié)合，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(sLOX-1-D或來自CHO細胞的sL0X_l)的濃度制成抑制曲線。根據(jù)抑制曲線數(shù)據(jù)的Scatchard分析,能夠求出被檢抗體對人可溶型L0X-1的親和性(解離常數(shù)，Kd)。實施例3「單克降抗體的制作I(I)免疫原作為免疫原，將在實施例I(I)中調(diào)制的sLOX-1-D(包含沉淀的懸濁液)、和位于人L0X-1細胞外結(jié)構(gòu)域的N端側(cè)的由序列號5和6表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽(肽I、肽2)作為半抗原。這是由于相比于大腸桿菌等，實施例I(2)的來自CHO細胞的sLOX-1在培養(yǎng)液中的含量非常少，而且培養(yǎng)液中的夾雜物多，所以在將該sLOX-1作為抗原使用時，難以確保必須量的緣故。將上述半抗原和牛血清白蛋白(BSA，Sigma生產(chǎn))的結(jié)合物作為免疫原使用。為了與交聯(lián)試劑結(jié)合，在各肽的C端導(dǎo)入Cys。使用交聯(lián)試劑N_(e-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺酯(sulfo-EMCS，Pierce生產(chǎn))在BSA上導(dǎo)入馬來酰亞胺基，使其與上述含有SH基的肽段反應(yīng)，得到半抗原-BSA結(jié)合物。S卩，在ImL反應(yīng)緩沖液(0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，PH7.0)中溶解27mgBSA(4X10_7摩爾)，在其中加入0.2mL溶解了8.2Imgsulfo-EMCS(2X10_5摩爾)的反應(yīng)緩沖液。室溫攪拌反應(yīng)90分鐘。反應(yīng)后，使用凝膠過濾柱(ro-10，Amersham生產(chǎn))對反應(yīng)液總量進行凝膠過濾，分離取得馬來酰亞胺化BSA。在2mL導(dǎo)入馬來酰亞胺基的BSA溶液(總量的1/2)中，加入在0.5mL反應(yīng)緩沖液中溶解的序列號5所示的肽I(其中，在C端導(dǎo)入Cys，8.68mg，6.8X1(T6摩爾)，室溫攪拌I.5小時后，在4°C反應(yīng)一夜。對精制水透析后，冷凍干燥(肽1-BSA)。另外，對序列號6所示的肽2(帶有Cys)8.33mg(6.6X10_6摩爾)，使用導(dǎo)入馬來酰亞胺基的BSA溶液2mL進行同樣的反應(yīng)(肽2-BSA)。(2)免疫作為免疫動物，使用A/J小鼠(68周齡，雌性，1020g(體重)，由日本SRC獲得)。使用20只A/J小鼠，分為5組，每組4只[1-1組(No.11011104)、2-1組(No.2101-2104)、3-1組(No.31013104)、4_1組(No.41014104)、5_1組(No.51015104)]。在生理食鹽水中溶解免疫原(sLOX-1-D、肽I-BSA和肽2-BSA)，加入等量的弗式完全佐劑(Difco社)使之乳化。如表3所示，將約100ug/100uL該乳液向各小鼠腹腔內(nèi)以3周間隔投與4次。[表3]權(quán)利要求1.ー種單克隆抗體、所述單克隆抗體的片段、或者所述單克隆抗體或其片段的標(biāo)記物，其特征在于所述單克隆抗體由保藏號為FERMBP-10646的“Mouse-MousehybridomasLOX-16B11”雜交瘤產(chǎn)生，具備與具有序列號2所示的氨基酸序列的人可溶型LOX-I特異性結(jié)合的特性，與人可溶型LOX-I的解離常數(shù)(Kd)為IX10_9(M)以下，所述單克隆抗體的片段選自對所述人可溶型LOX-I具有特異性結(jié)合的特性的Fab(fragmentofantigenbinding)、FLab’)2、Fab'、scFv〈singlechainFvノ、21首體化V區(qū)片段(Diabody)、dsFv(disulfidestabilizedFv)、dAd(singledomainantibody)以及包含⑶R的肽中的至少ー種，所述單克隆抗體或其片段的標(biāo)記物以選自酶、放射性同位素、熒光性化合物、化學(xué)發(fā)光性化合物和生物發(fā)光性化合物中的至少ー種標(biāo)記。2.一種雜交瘤，其特征在干其為產(chǎn)生與人可溶型LOX-I的解離常數(shù)(Kd)為1X10_9(M)以下的單克隆抗體的、保藏號為FERMBP-10646的“Mouse-MousehybridomasLOX-16B11，，。3.ー種人可溶型LOX-I檢測用試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體、權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的片段或者權(quán)利要求I所述的標(biāo)記的單克隆抗體或其片段。4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于其為急性冠脈綜合征診斷試劑盒。全文摘要本發(fā)明提供一種特異性識別人可溶型LOX-1的單克隆抗體，特別是提供一種與人可溶型LOX-1的解離常數(shù)(Kd)為1×10-9(M)以下的單克隆抗體。該抗體能夠由采用包括下述工序的方法調(diào)制的雜交瘤產(chǎn)生(1)將來自原核細胞的人LOX-1細胞外結(jié)構(gòu)域免疫非人動物的工序，(2)從該動物回收抗體產(chǎn)生細胞的工序，(3)融合該抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞的工序，(4)從上述工序中得到的融合細胞中選擇產(chǎn)生與上述人LOX-1細胞外結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤的工序，和(5)從該選擇出的雜交瘤中選擇產(chǎn)生與來自真核細胞的人LOX-1細胞外結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤的工序。文檔編號C07K16/28GK102675461SQ201110363199公開日2012年9月19日申請日期2007年7月27日優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日發(fā)明者中村昌弘,久米典昭,太田英樹,小南悟郎申請人:鹽野義制藥株式會社