專利名稱：一種從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶抑制劑是一類可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的貯藏器官，如種子、塊根和塊莖中，特別是豆科、木本科及茄科植物。此外，動物的血液、 精液、胰臟、初生乳汁、血清、雞蛋白、胎盤、尿中以及酵母菌、鏈霉菌屬等微生物中亦有胰蛋白酶抑制劑的存在。根據(jù)它們抑制的蛋白酶類型可分為絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、以及金屬蛋白酶抑制劑。由于它們能抑制昆蟲腸道內(nèi)以及一些病原微生物體內(nèi)的蛋白酶，因此蛋白酶抑制劑在植物對昆蟲和病原體的侵染防御系統(tǒng)中具有重要的作用。除此之外，它還被用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，或被用于癌癥、艾滋病病人的治療。將抑制劑基因轉(zhuǎn)入目的植物中，還可以提高植株的抗蟲、抗病能力。綠豆胰蛋白酶抑制劑是從大豆中分離純化得到的雙頭多功能蛋白酶抑制劑，除了具備其他蛋白酶抑制劑在抗蟲抗病方面的特點外，還有許多獨特的優(yōu)點。如比活力高而且穩(wěn)定，廣譜性強，對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽釋放酶等多種蛋白酶有較強的抑制作用。 而這些蛋白酶是一些農(nóng)業(yè)害蟲腸道的主要消化酶，因此，綠豆胰蛋白酶抑制劑在植物抗蟲方面的應(yīng)用有著廣闊的前景。近年來，綠豆胰蛋白酶抑制劑在國內(nèi)外研究較熱，主要集中于研究活性結(jié)構(gòu)中心， 抑制機理和基因克隆與轉(zhuǎn)化等方面。研究從綠豆中提取，分離，純化則很少，至于考慮嘗試其他更經(jīng)濟，有效的提取方法，國內(nèi)尚未看到有相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，能夠用較低成本分離純化較高純度的胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)
(1)將綠豆搗碎，加入ρΗ7·6的0. lmol/L PBS緩沖液，充分搗碎成糊狀；
(2)將上述糊狀液體靜置20min，用紗布過濾，收集抽提液，于75°C水浴加熱變性 30min，棄去沉淀；
(3)取上清液調(diào)pH至6.5，攪拌的同時加固體硫酸銨至70%飽和度，4°C過夜，將液離心 15min,棄去沉淀；
(4)沉淀用去離子水溶解，先后用IOkDa和30kDa的濾膜超濾，收集IOkDa 30kDa的組分；
(5)收集的組分用0.05mol/L, pH8. 0的Tris-HC透析過夜，濃縮后離心，收集上清液；
(6)另取殼聚糖用醋酸溶解，完全溶解后加入TweenSO；(7)加入乙酸乙酯，攪拌均勻后，再滴加spanSO，加熱到50°C反應(yīng)30min；
(8)接上述步驟，升溫至60°C，加入甲醛反應(yīng)30min；
(9)反應(yīng)完成后加入戊二醛，調(diào)節(jié)pH至9.0，升溫至80°C反應(yīng)Ih；
(10)反應(yīng)完成后進行抽濾，取濾渣用丙酮和無水乙醇洗后置于80°C干燥，得到微黃色的殼聚糖微珠；
(11)用上述步驟中的殼聚糖微珠作為吸附劑，用0.lmol/L, ph7. 8硼酸-硼砂緩沖液
平衡；
(12)取慈菇胰蛋白酶抑制劑粗提物上樣；
(13)先用硼酸-硼砂緩沖液4mL/min洗脫，再改用0.25mol/L,ph4. 0醋酸鈉一醋酸緩沖液，2mL/min 洗脫，最后用 0. 5 mol/L, pHl. 5 NaCl-HCl 緩沖液，2mL/min 洗脫；
該發(fā)明的方法簡便，易于操作，且有較高產(chǎn)率。
具體實施例方式
(1)取綠豆IOOg搗碎，加入300ml pH7. 6的0. lmol/L PBS緩沖液，充分搗碎成糊狀；
(2)將上述糊狀液體靜置20min，用紗布過濾，收集抽提液，于75°C水浴加熱變性 30min，棄去沉淀；
(3)取上清液調(diào)pH至6.5，攪拌的同時加固體硫酸銨至70%飽和度，4°C過夜，將液離心 15min,棄去沉淀；
(4)沉淀用5ml去離子水溶解，先后用IOkDa和30kDa的濾膜超濾，收集IOkDa 30kDa 的組分；
(5)收集的組分用0.05mol/L,pH8. 0的Tris-HCl透析過夜，濃縮后離心，收集上清液；
(6)另取殼聚糖1.5g用300mL 0. 5%醋酸溶解，完全溶解后加入1. 5ml的Tween80 ；
(7)加入0.8ml乙酸乙酯，攪拌均勻后，再滴加Iml的span80，加熱到50°C反應(yīng)30min ；
(8)接上述步驟，升溫至60°C，加入&ι136%甲醛反應(yīng)30min；
(9)反應(yīng)完成后加入10mU%的戊二醛，調(diào)節(jié)pH至9.0，升溫至80°C反應(yīng)Ih；
(10)反應(yīng)完成后進行抽濾，取濾渣用丙酮和無水乙醇洗后置于80°C干燥，得到微黃色的殼聚糖微珠；
(11)用上述步驟中的殼聚糖微珠作為吸附劑，用0.lmol/L, ph7. 8硼酸-硼砂緩沖液
平衡；
(12)取慈菇胰蛋白酶抑制劑粗提物上樣；
(13)先用硼酸-硼砂緩沖液4mL/min洗脫，再改用0.25mol/L,ph4. 0醋酸鈉一醋酸緩沖液，2mL/min 洗脫，最后用 0. 5 mol/L, pHl. 5 NaCl-HCl 緩沖液，2mL/min 洗脫；
洗脫后得到的提純液，用考馬斯亮藍G-250染色法測定其含量，得到其胰蛋白酶抑制劑的得率為0. 5%。
權(quán)利要求
1.一種從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于有以下步驟 Sl將綠豆，搗碎，過濾，鹽析，離心，取沉淀溶解，超濾，透析，離心，制得綠豆胰蛋白酶抑制劑粗提物；S2將殼聚糖用醋酸溶解；S3在S2所述溶解液加入Tween-80、乙酸乙酯和span80，加熱到50°C反應(yīng)30min ；S4將S3所述溶解液升溫至60°C，加入甲醛反應(yīng)30min ；S5在S4反應(yīng)完成后加入戊二醛，調(diào)節(jié)pH至9. 0,升溫至80°C反應(yīng)Ih ；S6在S5反應(yīng)完成后進行抽濾，取濾渣用丙酮和無水乙醇洗后置于80°C干燥，得到微黃色的殼聚糖微珠；S7以殼聚糖微珠為親和載體進行親和層析。
2.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于Sl 所述粗提物，搗碎時要加入0. lmol/L, pH7. 6的PBS緩沖液。
3.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于Sl 所述粗提物，用70%飽和度的硫酸銨鹽析。
4.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于Sl所述粗提物，分別用IOkDa和30kDa的濾膜超濾。
5.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于Sl 所述粗提物，透析需用0. 05mol/L, pH8. 0的Tris-HCl為透析平衡液。
6.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于S7 所述親和載體，以0. lmol/L, ph7. 8硼酸-硼砂緩沖液平衡。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于親和層析先用0. lmol/L，ph7. 8硼酸-硼砂緩沖液洗脫，再改用0. 25mol/L，ph4. 0醋酸鈉一醋酸緩沖液，2mL/min洗脫，最后用0. 5 mol/L, pHl. 5的NaCl-HCl緩沖液洗脫。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從綠豆中分離純化胰蛋白酶抑制劑的方法。通過綠豆，搗碎，過濾，鹽析，離心，取沉淀溶解，超濾，透析，離心，制得綠豆胰蛋白酶抑制劑粗提物，用殼聚糖微粒為親和載體，做親和層析純化，得到較高提取率的胰蛋白酶抑制劑，且成本較低，操作簡便。
文檔編號C07K1/30GK102432681SQ20111039580
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月4日
發(fā)明者蔡少娟 申請人:汕頭市中乾網(wǎng)絡(luò)科技有限公司