專利名稱：使用nk細(xì)胞增效化合物提高治療性抗體功效的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及提高治療性抗體功效的方法和組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及治療性抗體與阻斷自然殺傷細(xì)胞的抑制性受體或刺激自然殺傷細(xì)胞的活化受體的化合物的聯(lián)合使用，從而使得哺乳動物患者的自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性效用增強(qiáng)，尤其是通過提升ADCC機(jī)制以增強(qiáng)在人類患者中的治療功效。
背景技術(shù)：
人類的許多治療方案都是建立在使用治療性抗體的基礎(chǔ)之上。這些包括，例如使用已開發(fā)的治療性抗體來使靶細(xì)胞衰竭，特別是病態(tài)細(xì)胞如病毒侵染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或其它病源細(xì)胞。這些抗體是典型的IgG類的單克隆抗體，典型的是具有人IgGl或IgG3 Fe部分。這些抗體可以是天然抗體或重組抗體，并且通常是"人源化"的小鼠抗體(即，包括 來自各種物種的功能域，典型的是人或非人靈長類的Fe部分、并帶有小鼠源的可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))?？蛇x替代的是，該單克隆抗體可以在具有人Ig位點的轉(zhuǎn)基因的小鼠中通過免疫作用而完全人源化，或通過由衍生自人類細(xì)胞的cDNA文庫獲得。該治療性抗體的一個特殊的例子是利妥昔單抗(rituximab)(美羅華Mabthera"3, Rituxan* )，它是一種由人Y I和K恒定區(qū)(因而帶有人IgGl Fe部分)與帶有CD20特異性的鼠可變區(qū)連接成的嵌合抗-CD20單克隆抗體。在過去的幾年中，利妥昔單抗已經(jīng)極大地改變了對B淋巴細(xì)胞增生性癌變，尤其是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治療方案。人源化的IgGl抗體的其它例子包括用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤(癌變)的阿來組單抗(alemtuzumab) (Campath-1 H'A_)、和用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗(trastuzumab)
(Herceptin1')。幵發(fā)中的治療性抗體的其它例子正在本領(lǐng)域中出現(xiàn)。治療性抗體的作用機(jī)制仍然是一個爭論的話題。注入抗體，導(dǎo)致帶有被該抗體特異性識別抗原的細(xì)胞的衰竭。該衰竭作用可以通過至少3種機(jī)制來介導(dǎo)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴型溶解、和通過作為抗體靶標(biāo)的抗原給出的信號對腫瘤生長的直接抗腫瘤抑制。盡管這些抗體代表了一種人類治療，尤其是對于治療腫瘤，的全新和有效的方法，但是它們并不都具有很強(qiáng)的療效。例如，盡管利妥昔單抗單獨(dú)施用(給予)或與化療藥物聯(lián)合施用(給予)顯示出對于治療中低度和高度NHL有效，但是30%至50%的低度NHL患者對于利妥昔單抗沒有臨床反應(yīng)。有人提出淋巴細(xì)胞表面上的CD20表達(dá)水平、治療期間存在的高腫瘤負(fù)荷、或血清中利妥昔單抗的低濃度可以解釋為什么在一些患者中利妥昔單抗沒有療效。然而，治療失敗的實際原因在很大程度上仍然是未知的。另外，由于施用治療性抗體的副作用，使得治療性抗體的使用受到了限制。例如，在患者中出現(xiàn)的發(fā)熱、頭痛、惡心、低血壓、哮喘、皮疹、感染和許多其它可能出現(xiàn)的副作用潛在地限制了施用抗體的可能劑量或頻率。
因此，提高治療性抗體的療效或者能夠減少抗體的使用劑量來實現(xiàn)療效從而盡量減少可能產(chǎn)生的副作用，是令人感興趣的。本發(fā)明將著手解決這些問題及其它需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明披露了增強(qiáng)治療性抗體功效的新方法。無須受下述理論的限制，我們認(rèn)為使用本發(fā)明方法所得到驚人的結(jié)果是由于當(dāng)注入治療性抗體時，它們在體內(nèi)能夠強(qiáng)化ADCC機(jī)制。實際上，本發(fā)明提供的全新的組合物和方法能夠克服目前與治療性抗體療效相關(guān)的困難。在本發(fā)明中可以看到來自個體的NK細(xì)胞由于缺少NK細(xì)胞的活化，S卩通過在抑制NK細(xì)胞上的抑制受體，而具有很差的治療性單克隆抗體(mAb)介導(dǎo)的ADCC。優(yōu)選地，ADCC機(jī)制的提高是通過施用阻斷在自然殺傷細(xì)胞上的抑制受體或刺激在自然殺傷細(xì)胞上的活化受體的化合物，從而促進(jìn)哺乳動物患者增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用來實現(xiàn)的。優(yōu)選的化合物是抗體或其片段。所述抗體或其它化合物可以與NK細(xì)胞的抑制性受體(例如殺傷細(xì)胞抑制性受體 (KIR或NKG2A/C)分子進(jìn)行反應(yīng)，或與其活化受體(例如NK細(xì)胞上的NKp30、NKp44或NKp46這樣的NCR)反應(yīng)，從而中和細(xì)胞的抑制作用并且增加了其ADCC活性。更具體而言，本發(fā)明披露了治療患者的方法，其中阻斷NK細(xì)胞抑制性受體或刺激其活化受體的化合物，優(yōu)選是抗體或其片段，與治療性抗體聯(lián)合施用于患者。本文中發(fā)明人證明了治療性抗體通過如共注射方式與優(yōu)選為抗體或其片段的這類化合物聯(lián)合施用，通過例如阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激NK細(xì)胞的活化受體而克服了 NK細(xì)胞的抑制，從而可以極大地增強(qiáng)其治療功效。 本發(fā)明還涉及包括治療性抗體和阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激NK細(xì)胞活化受體的化合物的藥物組合物，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段。本發(fā)明還涉及包括治療性抗體和阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激NK細(xì)胞的活化受體的化合物的試劑盒，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段。本發(fā)明還涉及將阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激NK細(xì)胞的活化受體的化合物(優(yōu)選為抗體或其片段)用于增加治療性抗體的治療功效，或用于提高用治療性抗體進(jìn)行治療的患者體內(nèi)的ADCC的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物(優(yōu)選為抗體或其片段)和治療性抗體用于制備治療疾病的藥物中的應(yīng)用。更具體而言，該疾病的治療需要消除(耗盡)靶細(xì)胞，優(yōu)選為患病的細(xì)胞，如病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或其它病原細(xì)胞。優(yōu)選地，該疾病是癌、傳染性疾病或免疫疾病。更優(yōu)選的是，該疾病選自包括癌癥、自身免疫疾病、炎癥、和病毒性的一組病癥。該疾病還涉及移植排斥，更為具體的是同種異體移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)。本發(fā)明還包括用于減少治療性抗體(例如通過Fe Y受體結(jié)合的抗體，優(yōu)選為CD16 (Fe y RIIIa))劑量的方法。例如，治療性抗體與阻斷NK細(xì)胞上的抑制性受體或刺激NK細(xì)胞上的活性受體的化合物的聯(lián)合施用可以允許使用低劑量的治療性抗體。這類抗體可以以比沒有該化合物時的推薦劑量少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或更低的劑量使用。另外，本發(fā)明提供了用于測定治療性抗體(例如由CD16結(jié)合的抗體)的有效治療量和減小劑量的方法。該方法包括i)將第一濃度的治療性抗體與靶細(xì)胞和NK細(xì)胞共同孵育，并且沒有阻斷NK細(xì)胞上的抑制性受體或刺激其上的活化受體的化合物存在；ii)將第二較低濃度的治療性抗體與靶細(xì)胞和NK細(xì)胞共同孵育，并且存在阻斷NK細(xì)胞上的抑制性受體或刺激其上的活化受體的化合物；iii)測定步驟ii)中所觀察到的靶細(xì)胞的消除(耗竭)是否與步驟i)中所觀察到的消除一樣多。如果觀察到步驟ii)與步驟i)同樣有效，那么可以改變化合物和治療性抗體的相對濃度，并且觀察消除(耗竭)情況，從而確定適用于特定患者的不同條件，例如針對患者的不同需要最大程度地消除靶細(xì)胞，并盡量減少治療性抗體的劑量或盡量減少化合物的劑量。
在一個特定方面，本發(fā)明提供了一種在有需要的人類患者體內(nèi)治療疾病的方法，包括a)對所述患者施用阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物；以及b)對所述患者施用可以通過CD16進(jìn)行結(jié)合的治療性抗體。在一個實施例中，將該治療性抗體和化合物同時施用于患者。在另一實施例中，在施用治療性抗體I周內(nèi)、4日內(nèi)、3日內(nèi)或同日內(nèi)(即24小時內(nèi))將該化合物施用于該患者。在另一實施例中，該疾病是癌、傳染性(感染性)疾病或免疫疾病。在一個實施例中，該方法進(jìn)一步包括一個附加步驟，其中在施用該化合物之前或之后測量患者體內(nèi)的NK細(xì)胞的活性或數(shù)量。在另一個實施例中，該附加步驟包括i)在施藥之前從患者體內(nèi)獲得NK細(xì)胞；ii)在有該化合物/無該化合物的情況下，將NK細(xì)胞在存在一種或多種可被該治療性抗體識別的靶細(xì)胞的情況下孵育；以及iii)測量該化合物對NK細(xì)胞消除(消耗)靶細(xì)胞能力的影響；當(dāng)發(fā)現(xiàn)該化合物增強(qiáng)了 NK細(xì)胞消除靶細(xì)胞的能力時表明該化合物適用于該方法，并且該方法適用于該患者。在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括一治療性抗體(例如可以通過CD16結(jié)合的抗體)，一個抑制NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物，以及藥物可接受的一個載體。另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括一治療性抗體(例如通過CD16結(jié)合的抗體)，以及一種或多種阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物。對于任何上述方法、組合物、或試劑盒,在一個實施例中該治療性抗體具有人IgGl或IgG3 Fe片段。在另一個實施例中，該化合物是抗體或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體是單克隆抗體或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體不與放射性部分或毒性部分結(jié)合。在另一個實施例中，該化合物抑制NK細(xì)胞的抑制性受體。在另一個實施例中，該化合物刺激NK細(xì)胞的活化受體。在另一個實施例中，該化合物是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體或化合物可以是如Fab片段、Fab’2片段、⑶R和ScFv的抗體片段或衍生物。在一個實施例中，該治療性抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其片段。在另一個實施例中，該治療性抗體是利妥昔單抗(rituximab)或坎帕斯(Campath)。在另一個實施例中，該抗體是利妥昔單抗，并且所述抗體以每周少于375mg/m2的劑量施用。在另一個實施例中，該抗體是坎帕斯，并且該抗體以每周少于90mg的劑量施用。在一個實施例中，該化合物與NKG2、KIR2DL或KIR3DL人受體中的至少一個結(jié)合，并且抑制相關(guān)的NKG2-、KIR2DL-或KIR3DL-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性抑制作用。在另一個實施例中，該化合物阻斷選自包括KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB1、NKG2A、NKG2C、NKG2E 和 LILRB5 的一組 NK 細(xì)胞的抑制性受體。在另一個實施例中，該化合物與KIR2DL人受體的共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒的抑制作用。在另一個實施例中，該化合物與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3人受體的共同決定簇結(jié)合，并且抑制KIR2DL1-、KIR2DL2-和KIR2DL3-介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性抑制作用。在另一個實施例中，該化合物抑制在第80位(位點80)具有賴氨酸(Lys)殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL1受體的結(jié)合，并且抑制在第80位(80位點)具有天冬酰胺(Asn)殘基的HLA-C等位基因分子與人KIR2DL2和KIR2DL3受體的結(jié)合。在另一個實施例中，該化合物與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200結(jié)合到同一抗原決定簇上。在另一個實施例中，該化合物與由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200競爭結(jié)合到人NK細(xì)胞在表面的KIR受體上。在另一個實施例中，該化合物是由雜交瘤DF200產(chǎn)生的單克隆抗體DF200或其片段。在一個實施例中，該化合物與選自包括NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D的一組中的一個受體結(jié)合。在另一實施例中，該化合物是選自包括AZ20、A76、Z25、Z231JPBAB281的一組中的一個單克隆抗體衍生的，或與之競爭。 另一方面，本發(fā)明提供了一種選擇用于與治療性抗體聯(lián)合施用的化合物的方法，所述方法包括i)提供一種抑制NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體的待測化合物；ii)在NK細(xì)胞存在的條件下，在有/無該待測化合物時，將治療性抗體與可被該治療性抗體特異性識別的靶細(xì)胞一起孵育；以及iii)測定該化合物對于NK細(xì)胞消除靶細(xì)胞能力的影響；其中測出該化合物增強(qiáng)NK細(xì)胞消除靶細(xì)胞的能力時，則表明該化合物適用于該方法。在一個實施例中，該化合物將該治療性抗體摧毀靶細(xì)胞的能力增強(qiáng)50%、60%、70 %、80 %、90 %、100 %,200 %,300 0AAOO %>500%或更高。在另一個實施例中，該化合物選自包括抗體、抗體片段、單克隆抗體、單克隆抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體和人抗體的一組物質(zhì)。在另一個實施例中，該靶細(xì)胞是癌細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞、或構(gòu)成自身免疫疾病基礎(chǔ)的細(xì)胞。在另一個實施例中，該治療性抗體是利妥昔單抗(rituximab)或坎帕斯(CAMPATH)。另一方面，本發(fā)明提供了一種提高施用于患者體內(nèi)可以由CD16結(jié)合的治療性抗體的治療功效的方法，所述方法包括在施用所述治療性抗體之前、同時或之后對所述患者施用阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體的有效治療量的化合物。在一個實施例中，該化合物通過增強(qiáng)所述患者的ADCC提高了治療功效。


圖I :單克隆抗體DF200與不同人KIR2DL受體的一個共同決定簇相結(jié)合。圖2 :用抗KIR2DL單克隆抗體(抗KIR2DL mAb)在ClR Cw4靶上以效應(yīng)物/靶比率為4/1進(jìn)行溶解重構(gòu)。單克隆抗體DF200抑制KIR2DL-介導(dǎo)的在Cw4陽性靶細(xì)胞上二的KIR2DL1陽性NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性(重構(gòu)溶解)的抑制作用。圖3 :通過將一個KIR2DL1陽性NK克隆的Rituxan介導(dǎo)到一個Cw4陽性EBV細(xì)胞系上，通過阻斷KIR/HLA相互作用來增強(qiáng)ADCC。針對在5ug/ml抗⑶20抗體(美羅華，Rutixan)和10ug/mlEB6抗體(抗KIR2DL1)存在下；Rutixan單獨(dú)作用；EB6單獨(dú)作用；或沒有任何抗體存在下，以各種效應(yīng)物/靶比率(從I到4)對于Cw4陽性EBV轉(zhuǎn)化的(CD20陽性)靶細(xì)胞系測試KIR2DL1的NK克隆細(xì)胞溶解關(guān)系。當(dāng)存在抗KIR2DL抗體(EB6)時，極大地增強(qiáng)了 ADCC。圖4 :通過將一個KIR2DL1陽性NK克隆的坎帕斯(Campath)介導(dǎo)到一個Cw4陽性EBV細(xì)胞系上，通過阻斷KIR/HLA相互作用來增強(qiáng)ADCC。針對在坎帕斯和100ug/ml EB6抗體(抗KIR2DL1)存在下；坎帕斯單獨(dú)作用；EB6單獨(dú)作用；或沒有任何抗體存在下，對Cw4陽性EBV轉(zhuǎn)化的(CD20陽性)靶細(xì)胞系測試KIR2DL1的NK克隆細(xì)胞溶解關(guān)系。當(dāng)存在抗KIR2DL1抗體(EB6)時，極大地增強(qiáng)了 ADCC。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種用于增加治療性抗體功效的方法。本發(fā)明尤其披露了一種化合物的應(yīng)用，該化合物優(yōu)選為抗體或其片段，它可增強(qiáng)NK細(xì)胞的效力，優(yōu)選通過阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或激活其活化受體可以顯著提高治療性抗體的功效。實際上，本發(fā)明人證明了多種治療性抗體的療效可以通過直接作用于NK細(xì)胞受體(如，抑制性受體)上抗體的共同作用而極大地增強(qiáng)。因此，本發(fā)明涉及一種在有需要的患者體內(nèi)治療疾病的方法，包括a)給所述患者施用一種可以阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體的化合物，優(yōu)選為一種抗體或它的一個片段；以及b)對所述患者施用一種治療性抗體。所述治療性抗體可以通過NK細(xì)胞的⑶16結(jié)合，優(yōu)選通過它的Fe區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，所述治療性抗體具有人IgGl和IgG3 Fe部分，特別是單克隆抗體或它的片段，進(jìn)一步優(yōu)選為人源化抗體、人抗體或嵌合抗體，或其片段，例如利妥昔單抗(rituximab)。所希望的是阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，可以在施用(給予)治療性抗體之前、同時、或之后施用于(給予)患者。不同抗體的施用方法依賴于它們的生物利用率和藥物代謝動力學(xué)。優(yōu)選在施用該化合物一周內(nèi)施用治療性抗體，該阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的化合物優(yōu)選為抗體或其片段，更優(yōu)選是在5天或2天內(nèi)施用。優(yōu)選地，該治療性抗體在施用阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的化合物之前或同時施用，優(yōu)選為抗體或其片段。另一方面，本發(fā)明涉及一種在接受治療性抗體治療的患者體內(nèi)提高ADCC的方法，所述方法包括對所述患者施用所述治療性抗體之前、同時或之后施用足夠量的提高ADCC的化合物，該化合物阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體，優(yōu)選為抗體或其片段。所述治療性抗體可以通過NK細(xì)胞上的⑶16結(jié)合，優(yōu)選通過它的Fe區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，所述治療性抗體是人IgGl或IgG3片段，特別是單克隆抗體或其片段，更優(yōu)選為個人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其片段，例如利妥昔單抗。另一方面，本發(fā)明涉及一種提高患者體內(nèi)的治療性抗體功效的方法，所述方法包括對所述患者施用所述治療性抗體之前、同時或之后施用一定量的阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段，該劑量足以提高所述治療性抗體的功效。所述治療性抗體可以通過CD16結(jié)合，優(yōu)選通過其Fe區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，所述治療性抗體是人IgGl或IgG3 Fe片段，特別是單克隆抗體或其片段，更優(yōu)選人抗體，人源化抗體或嵌合抗體，或其片段，例如利妥昔單抗。定義在本文中，除非另有說明下面的術(shù)語具有其界定的含義。本文中，"NK"細(xì)胞是指與非常規(guī)性免疫相關(guān)的淋巴細(xì)胞亞群。NK細(xì)胞可以通過一定的特征和生物性能來加以識別如特異性表面抗原(包括⑶16、⑶56和/或⑶57)的表達(dá)，在細(xì)胞表面上a/0或y/S TCR復(fù)合物的缺乏，聯(lián)接到不表達(dá)"自體"MHC/HLA抗原的細(xì)胞并通過激活特異性的細(xì)胞溶解酶殺死細(xì)胞的能力，殺死用于表達(dá)NK活化受體的配體的腫瘤細(xì)胞或其它病態(tài)細(xì)胞的能力，以及釋放被稱作細(xì)胞因子的蛋白分子以刺激或抑制免疫應(yīng)答的能力。利用本領(lǐng)域熟知的方法，任何這些特征和活性都可以用于識別NK細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語"抗體"是指多克隆或單克隆抗體。依賴于重鏈上恒定區(qū)的類型，抗體可分為5個主要類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類別中的一些可以進(jìn)一步劃 分為亞類或同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等等。一種典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包括一個四聚物(四聚體)。每個四聚物由兩對同樣的多肽鏈對構(gòu)成，每對(多肽鏈)具有一個"輕"鏈(約25kDa)和一個"重"鏈(約50-70kDa)。每個鏈的N末端定義一個約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，該可變區(qū)主要負(fù)責(zé)抗原識別?？勺冚p鏈(\)和可變重鏈(Vh)兩術(shù)語分別是指這些輕鏈和重鏈。相應(yīng)于不同種類的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱作"a、" " S、" " e、" " Y、"和"ii"。不同類別的免疫球蛋白的亞單位(亞基)結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象已為所公知。IgG和/或IgM是本發(fā)明中優(yōu)選的抗體類別，特別優(yōu)選為IgG，由于它們是在生理條件下是最常見的抗體，由于它們在實驗室條件下最容易制備，并且由于IgG可以被Fe Y受體特異性識別。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。特別優(yōu)選的是人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、或其它的-人-適宜的抗體。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"治療性的一個抗體或多個抗體"特別是指具有能夠消除(凋亡)患者體內(nèi)靶細(xì)胞功能的任何抗體。尤其是，治療性抗體特異性結(jié)合到存在于靶細(xì)胞表面的抗原上，如腫瘤特異性抗原主要或唯一出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞上。優(yōu)選地，治療性抗體包括人Fe部分或能夠與人Fe受體相互作用。治療性抗體可以通過如ADCC或其它各種方法(手段)對準(zhǔn)靶細(xì)胞，并且可以是"裸露的"，即不帶有連接部分(conjuigatedmoieties)，或與諸如放射性標(biāo)記物或毒素這些化合物結(jié)合。術(shù)語"特異性結(jié)合到"是指抗體在競爭性結(jié)合測試中優(yōu)選可以結(jié)合到結(jié)合伴侶(binding partner)上,例如當(dāng)用蛋白或其抗原決定部位的重組形式、或分離的NK或相關(guān)靶細(xì)胞的表面上存在的天然蛋白進(jìn)行測試時的活性NK受體如NKp30、NKp44或NKp46，或人Fcy受體。競爭性結(jié)合測試及用于測定特異性結(jié)合的其它方法在下文中會進(jìn)一步描述，同時也是本領(lǐng)域所公知的。"適用于人的"抗體是指可以安全用于人，例如本文中所描述的治療方法中的任何抗體、衍生抗體、或抗體片段。適用于人的抗體包括所有類型的人源化抗體、嵌合抗體、或完全的人抗體，或任何至少抗體的一部分來源于人的抗體或者是經(jīng)過修飾后的抗體從而避免當(dāng)使用天然的非-人抗體時誘發(fā)免疫應(yīng)答。"免疫原性片段"在本文中是指能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的任意多肽或肽片段，如(i)抗體結(jié)合所述片段和/或結(jié)合含有所述片段的任何形式的分子(包括膜聯(lián)受體及由其衍生的突變體)的產(chǎn)生，(ii)涉及T-細(xì)胞與包括任何MHC分子及由所述片段衍生的肽的雙分子復(fù)合物反應(yīng)的T-細(xì)胞應(yīng)答的刺激，(iii)轉(zhuǎn)染的載體(如表達(dá)編碼哺乳動物免疫球蛋白基因的噬菌體或細(xì)菌)的結(jié)合?？蛇x替代的，免疫原性片段也可以指能夠激發(fā)免疫應(yīng)答如上文所述的任何結(jié)構(gòu)，如通過共價連接子(共價連接物)結(jié)合到載體蛋白上的肽片段，在氨基酸序列中包括所述肽片段的嵌合重組體多肽結(jié)構(gòu)，以及尤其包括用cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該cDNA的序列中包括所述片段的編碼。對于本發(fā)明的目的，"人源化"抗體是指這樣的一個抗體，其中由一種或多種人免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)區(qū)和可變結(jié)構(gòu)區(qū)通過如⑶R這樣的結(jié)合區(qū)與一種動物免疫球蛋白融合在一起。設(shè)計這樣的人源化抗體是為了保持非人抗體的結(jié)合特異性，從中導(dǎo)出各個結(jié)合區(qū)，但要避免對于非人抗體的免疫反應(yīng)。"嵌合抗體"是指一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其一部分已經(jīng)被改變、替代或交換使得抗原結(jié)合位點(可變區(qū))是與一個不同的或改變后的類、效應(yīng)物功能和/或種、或者一個完全不同的分子的恒定區(qū)相連，這些分子可以為嵌合抗體如酶、毒素、激素、生長 因子、藥物等賦予全新的性能；或(b)可變區(qū)或其一部分被改變、替代或與一種具有不同的或經(jīng)改變的抗原特異性的可變區(qū)進(jìn)行交換。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，嵌合抗體仍保存免疫球蛋白的Fe區(qū)域，優(yōu)選為人Fe區(qū)域，從而可以與靶細(xì)胞表面上的人Fe受體相互作用。在本發(fā)明的上下文中，"增強(qiáng)、""活性、"或"活化的"NK細(xì)胞是指生物活性的NK細(xì)胞，更特殊的是指具有溶解靶細(xì)胞能力的NK細(xì)胞。例如一種"活性"NK細(xì)胞能夠殺死表達(dá)NK活化受體-配體，并且不表達(dá)"自身"MHC/HLA抗原(KIR不相容細(xì)胞)的細(xì)胞。用于重新導(dǎo)向殺傷實驗的適宜的靶細(xì)胞的實例有P815細(xì)胞和K562細(xì)胞，但是很多細(xì)胞類型也可以使用并且是本領(lǐng)域所公知的(參見，如Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186 1129-1136 ；Vitale et al. (1998)J. Exp. Med. 187 :2065-2072 ；Pessino et al. (1998)J. Exp. Med. 188 :953-960 ；Neri et al. (2001)Clin. Diag. Lab. Immun. 8 :1131-1135)。"增強(qiáng)、""活性、"或"活化的"細(xì)胞也可以通過任何與NK活性相關(guān)的其它性能或本領(lǐng)域公知的活性來識別，如細(xì)胞因子(例如IFN-Y和TNF-a)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量的增加。針對本發(fā)明的目的，"增強(qiáng)、""活性、"或"活化的"NK細(xì)胞尤其是指體內(nèi)的沒有通過刺激抑制性受體而被抑制的NK細(xì)胞、或在該細(xì)胞中例如通過刺激活化受體來克服這樣的抑制作用的NK細(xì)胞。如本文中所使用的，術(shù)語"活性NK受體"是指NK細(xì)胞表面上的任意分子，當(dāng)受刺激時，其引起與NK活性相關(guān)的、本領(lǐng)域所公知的性能或活性的可測量的增加，如細(xì)胞因子(如IFN-Y和TNF-a)的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量的增加、在本說明書中的其它處描述的在重新導(dǎo)向殺傷實驗中導(dǎo)向靶細(xì)胞的能力、或刺激NK細(xì)胞增殖的能力。術(shù)語"活性KIR受體"包括但不局限于NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、IL-12R、IL-15R、IL-18R 和 IR-21R。如在本文中所使用的，術(shù)語"活性NK受體"不包括IL-2受體(IL-2R)。確定NK細(xì)胞是否有活性或增殖與否的方法在下文中將詳細(xì)描述，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。如在本文中所使用的，術(shù)語"抑制"或"抑制性"NK受體是指NK細(xì)胞表面上的任意分子，當(dāng)受刺激時，其引起與NK活性相關(guān)的、領(lǐng)域所公知的特性或活性的可測量的減少，如細(xì)胞因子(如IFN-Y和TNF-a)的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量的增加、或在本說明書中的其它處描述的在重新導(dǎo)向殺傷實驗中溶解靶細(xì)胞的能力。這樣的受體的實例包括KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRBl、NKG2A、NKG2C、NKG2E和LILRB5。確定NK細(xì)胞是否有活性的方法在下文中將加以詳細(xì)描述，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。在本發(fā)明中，術(shù)語"阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活化受體"是指某些化合物(優(yōu)選為抗體、其片段或衍生物)的能力，優(yōu)選是指直接與至少一種如KIR、NKG2A/C、NKp30、NKp44、NKp46或其它本文中所列的抑制性或活性NK細(xì)胞受體的相互作用、或者中和來自受體的抑制性信號(在抑制性受體的情況下)或來自受體的刺激信號(在活化受體的情況下)。對于抑制性受體，優(yōu)選的化合物為能夠阻斷HLA和受體之間的相互作用的化合物，優(yōu)選為抗體或其片段。當(dāng)該化合物是抗體時，該抗體可以是多克隆抗體、或優(yōu)選為單克隆抗體。它們可以通過雜交瘤或通過基因工程化的用以表達(dá)所需的可變區(qū)和恒定區(qū)的重組(體)細(xì)胞來產(chǎn)生。該抗體可以是單鏈抗體或保留該抗原特異性以及如Fab片段、Fab’2片段、CDR和ScFv這些更低級的鉸鏈區(qū)或其可變區(qū)的其它抗體衍生物。這些可以是多功能抗體、重組(體)抗體、人源化抗體或它們的變體。在本發(fā)明的上下文中，"共同決定簇"是指由一組相關(guān)受體如人KIR2DL受體組 的多個成員共有的決定簇或抗原決定部分(簇)。該決定簇或抗原決定部分(簇)可以表現(xiàn)為由所述成員共有的肽片段或構(gòu)象抗原決定部分(簇)。在一個特定實施例中，該共同決定簇包括被單克隆抗體DF200、NKVSFl或EB6所識別的抗原決定部分(簇)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語抗體與一個共同決定簇的"結(jié)合"是指一個抗體與所述的決定簇具有特異性和/或親和性的結(jié)合，例如位于人NK細(xì)胞表面上的其它不相關(guān)的構(gòu)象或決定簇或結(jié)構(gòu)基本上是不通過高親和性或特異性結(jié)合的。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明單克隆抗體對所述決定簇的結(jié)合可以與所述抗體與其它抗原決定部分或決定簇的結(jié)合區(qū)分開來。能夠結(jié)合于NK細(xì)胞的抑制性受體并阻止其刺激作用的化合物從而成為"中和"或"抑制性"化合物，優(yōu)選為抗體，在這個意義上它們阻斷，至少部分阻斷通過NK細(xì)胞的抑制性受體(如KIR或NKG2A/C受體)所介導(dǎo)的抑制性信號通路。更為重要的是，該抑制性活性可以對于幾種類型的KIR或NKG2A/C受體表現(xiàn)出來，從而這些化合物(優(yōu)選為抗體)可以用于各種患者，并且具有很高的療效。術(shù)語"重組(體)"，當(dāng)用于如細(xì)胞、或核酸、蛋白、或載體時，是指該細(xì)胞、核酸、蛋白、或載體通過弓I入外源的核酸或蛋白或經(jīng)改造的天然核酸或蛋白而已經(jīng)被修飾，或該細(xì)胞衍生自經(jīng)這樣修改過的細(xì)胞。從而，例如，重組(體)細(xì)胞表達(dá)的基因在天然(非重組)形式的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)，或表達(dá)的天然基因本應(yīng)為異常表達(dá)、低量表達(dá)或完全不表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，病人或患者包括各種哺乳動物患者或病人，更優(yōu)選為人類患者或病人。治療性抗體本發(fā)明涉及NK細(xì)胞增效化合物與治療性抗體的聯(lián)合使用。大量治療性抗體中的任意一種都可以用于本發(fā)明?；旧?，任何抗體，無論是"裸露的"或與放射性標(biāo)記物、毒素、或其它部分(moiety)結(jié)合的，或無論是全長或片段，或無論是真抗體或抗體的修飾衍生物都可以使用。優(yōu)選地，該方法是用于增強(qiáng)治療功效，在其中NK細(xì)胞的活性對所施用治療性抗體的療效起一定作用-但不必是唯一的，并且優(yōu)選的抗體或片段自然應(yīng)包括、或經(jīng)修改后包括人Fe區(qū)域或能夠被人Fe受體(如Fe Y受體)特異性抗體識別的其它區(qū)域。本發(fā)明的化合物能用于增強(qiáng)治療性抗體消除表達(dá)被該治療性抗體特異性識別的抗原的祀細(xì)胞的能力。相應(yīng)地，至少部分是由能夠被治療性抗體作為祀標(biāo)的細(xì)胞所引起或惡化的任何疾病或病癥都可以用本文中描述的方法來治療。靶細(xì)胞的特定例子包括與過敏、自身免疫疾病、同種異體反應(yīng)等相關(guān)的腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞、同種異體細(xì)胞、病態(tài)的免疫活性細(xì)胞(如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、呈現(xiàn)抗原的細(xì)胞等)，或甚至是健康的細(xì)胞(如在抗血管生成治療方案中的內(nèi)皮細(xì)胞)。在本發(fā)明的上下文中，最優(yōu)選的靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞。該治療性抗體可以，例如，介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用或細(xì)胞溶解，特別是通過抗體依賴型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)。ADCC需要用于IgG的Fe部分的白細(xì)胞受體(Fe y R)，其功能是將IgG致敏的+抗原與帶有Fe Y R的細(xì)胞毒性細(xì)胞結(jié)合，并且用以啟動細(xì)胞活化機(jī)制。因此，該治療性抗體能夠形成免疫復(fù)合物。例如，免疫復(fù)合物可以是被治療性抗體覆蓋的腫瘤靶點。更具體而言，該抗體能夠通過CD16結(jié)合，優(yōu)選通過它的Fe區(qū)域結(jié)合。確定治療性抗體是否與CD16這樣的Fe y受體相結(jié)合可以使用任何適宜的方法來測試，例如通過確定與重組產(chǎn)生的CD16多 肽或其片段的結(jié)合，可選固定在一個載體(支撐物)上，或例如通過確定該治療性抗體與已知表達(dá)⑶16或懷疑其表達(dá)⑶16的細(xì)胞的結(jié)合。該治療性抗體可以是多克隆、或優(yōu)選為單克隆。它們可以由雜交瘤或通過基因工程化的用于表達(dá)所需的可變區(qū)和固定區(qū)的重組(體)細(xì)胞來產(chǎn)生。該抗體可以是單鏈抗體或保留有抗原特異性和低級鉸鏈區(qū)的其它抗體衍生物，或它們的變體。這些可以是多功能抗體、重組抗體、人源化抗體，它們的片段或變體。所述的其片段或衍生物優(yōu)先選自Fab片段、Fab’ 2片段、CDR和ScFv。優(yōu)選的片段是抗原結(jié)合片段。包括抗原片段的治療性抗體也可以包括但不限于雙特異性抗體；一種適宜的雙特異性抗體的例子是包括一個對CD16特異的抗原結(jié)合區(qū)和一個對腫瘤抗原特異的抗原結(jié)合區(qū)。其它的包括多片段的抗體形式包括將兩個不同抗體的結(jié)合區(qū)結(jié)合到一個單獨(dú)的多肽鏈上的重組(體)雙特異性抗體衍生物，也稱作 BiTE (Kufer P，et al TRENDS in Biotechnology 2004 ；22(5) :238-244 ;和Baeuerle et al,Current Opinion in Molecular Therapeutics 2003 ；5 (4) :413-419,其披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中。)治療性抗體通常對表面抗原(例如膜抗原)具有特異性。最優(yōu)選的治療性抗體是對腫瘤抗原(例如被腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的分子)如⑶20、⑶52、ErbB2(或HER2/Neu)、⑶33、⑶22、⑶25、MUC-1、CEA、KDR、aV^3等，特別是對淋巴瘤抗原(例如⑶20)具有特異性。該治療性抗體具有優(yōu)選為人或非人靈長類的IgGl或IgG3Fc部分，更優(yōu)選為人IgGl。在一個實施例中，該抗體包括在其Fe部分的修飾，它們在ADCC時增強(qiáng)抗體與NK細(xì)胞的相互作用。這樣經(jīng)修飾的治療性抗體("經(jīng)改變的抗體")通常包括優(yōu)選在Fe區(qū)域的修飾，它們可以改進(jìn)該抗體與一種或多種Fe Y R的結(jié)合親和性。用于改變抗體對于一種或多種FcyR的改變的結(jié)合方法在本領(lǐng)域是公知的，可以參見如PCT申請公開號為 WO 2004/016750(國際申請?zhí)枮?PCT/US2003/025399)、WO 99/158572、WO 99/151642、W098/123289.W0 89/107142,WO 88/107089 和美國專利第 5，843，597 號和第 5，642，821 號，將它們的全部內(nèi)容通過弓I證合并于本申請中。本發(fā)明中確認(rèn)的治療性抗體，如用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的D2E7 (Cambr i dgeAntibody Technology Group, pic(Cambridge, UK)/BASF(Ludwigshafen, Germany))> 或英利昔單抗(Infliximab) (Centocor, Inc.，Malvern, PA;用于治療克隆氏病(Crohn，sdisease)和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、或在國際專利申請PCT/US2003/025399 (將全部內(nèi)容以參考文獻(xiàn)方式合并于本申請中作為參考)中披露的抗體可以用在本專利申請的上下文中教導(dǎo)的方法加以修飾或改進(jìn)，并且用于治療典型的使用這些抗體治療的疾病中。在一些實施例中，本發(fā)明提供了經(jīng)改變的抗體，它們對于活性Fe Y R(即Fe Y RIII)具有改變了的親和性(更高或更低的親和性)。在某些優(yōu)選的實施例中，提供了對于Fe Y R具有更高親和性的經(jīng)改變的抗體。優(yōu)選的是這樣的修改也具有改變的Fe-介導(dǎo)的效應(yīng)物(效應(yīng)因子)功能。影響Fe-介導(dǎo)的效應(yīng)物(效應(yīng)子)功能的修改是本領(lǐng)域所公知的(參見，如美國專利第6，194，351號，將其全部內(nèi)容通過引證合并于本文中)?？梢孕揎椀陌被岚ǖ幌抻诟彼?29、脯氨酸331和賴氨酸322。脯氨酸329和/或331和賴氨酸322可以優(yōu)選被丙氨酸取代，然而，也可考慮用其它氨基酸取代。參見國際申請公開號WO 00/142072和美國專利第6，194，551號，將其全部內(nèi)容通過引證合并于本文中。因此，F(xiàn)e區(qū)域的修改可以包括對在抗體Fe區(qū)域發(fā)現(xiàn)的氨基酸進(jìn)行的一種或多種改變。這樣的改變可以導(dǎo)致抗體具有改進(jìn)的抗體介導(dǎo)的效應(yīng)物(效應(yīng)子)功能、對其它Fe受體(如Fe活性受體)改進(jìn)的結(jié)合能力、改進(jìn)的ADCC活性、改進(jìn)的Clq結(jié)合活性、改進(jìn)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒活性、或它們的任意組合。在一個實施例中，該抗體被Fe Y受體特異性識別，這樣的Fe Y受體如FCGR3A (也稱作CD16、FCGR3、免疫球蛋白G Fe受體III ;IGFR3、對于IgG的Fe片段的受體、低親和性IIIa ;參見如0MM146740)，F(xiàn)CGR2A(也稱作CD32、CDw32、對于IgG的Fe片段的受體、低親和性IIa, FCG2、免疫球蛋白G Fe受體II ;參見如OMIM 146790) ;FCGR2B(也稱作CD32、對于IgG的Fe片段的受體、低親和性IIb ;FCGR2B、FC-y-RIIB ;參見如OMIM 604590)，F(xiàn)CGlRA (也稱作CD64 ;對于IgG的Fe片段的受體、高親和性Ia ； IGFRl ;參見如OMM146760 ；IgG的FCGRl片段、高親和性Ic、免疫球蛋白G Fe受體1C、IGFRC ;參見如OMIM601503);或FCGRlB (也稱作CD64、對于IgG的Fe片段的受體、高親和性Ib ;免疫球蛋白GFe 受體 IB ； IGFRB ;參見如 OMIM 601502)。 本發(fā)明典型的治療性抗體是利妥昔單抗(rituximab)、阿來組單抗(alemtuzumab)和曲妥珠單抗(trastuzumab)。這些抗體可以根據(jù)已經(jīng)批準(zhǔn)用于人類患者的臨床規(guī)范進(jìn)行使用。治療性抗體的其它特定的例子包括例如，抗CD22單克隆抗體(epratuzumab)、巴利昔單抗(basiIiximab)、達(dá)利珠單抗(dacIizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、Iabetuzumab> 司韋單抗(sevirumab)、tuvurimab、中白利珠單抗(palivizumab)、英利昔單抗(infliximab)、奧馬佐單抗(omalizumab)、依法珠單抗(efalizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、克立昔單抗(clenoliximab)等?？蛇x地，當(dāng)刺激NK細(xì)胞的活化受體的化合物是細(xì)胞因子時，該治療性抗體是除利妥昔單抗(rituximab)或赫賽汀(herceptin)之外的抗體，或者可選的是除抗-CD20或抗-HER2/神經(jīng)鞘(neu)抗體之外的抗體。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的治療性抗體的其它例子包括抗-鐵蛋白抗體(美國專利申請第2002/0106324號)、抗-P140和抗-sc5抗體(W002/50122)、和抗_KIR(殺傷細(xì)胞抑制性受體)抗體(該KIR 受體在 Carrington 和 Norman 的 The KIR Gene Cluster,May 3, 2003 中加以描述，可以在以下網(wǎng)址得到http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/books),將上述每一文獻(xiàn)披露的內(nèi)容通過引證合并于本文中。治療性抗體的其它例子列于下表中，其中任意一種(和其它種)都可以用于本方法。應(yīng)該明了，無論是否列于下表中或在本說明書的其它地方描述過，任何能夠消除靶細(xì)胞的抗體，優(yōu)選通過ADCC，都可從本方法受益，并且下表I對其中所列的抗體、所列的靶目標(biāo)或抗體的表示說明均不是窮舉的。表I:治療性抗體

權(quán)利要求
1.一種選擇與治療性抗體聯(lián)合施用的化合物的方法，所述治療性抗體能夠經(jīng)由所述治療性抗體的Fe部分通過⑶16結(jié)合且介導(dǎo)ADCC，所述方法包括 i)提供一種阻斷NK細(xì)胞的選自NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3的抑制性受體的抗體； )在存在NK細(xì)胞、并在存在/不存在所述阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的抗體的情況下，將所述治療性抗體與可被所述治療性抗體特異性識別的靶細(xì)胞一同孵育； iii)測定所述阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的抗體對于所述NK細(xì)胞消除所述靶細(xì)胞能力的影響； 其中測出所述阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的抗體增強(qiáng)所述NK細(xì)胞消除所述靶細(xì)胞的能力時，表明所述阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體的抗體適用于所述方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述化合物將所述治療性抗體摧毀所述靶細(xì)胞的能力增強(qiáng)30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述化合物將所述治療性抗體摧毀所述靶細(xì)胞的能力增強(qiáng)50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述化合物選自包括抗體、抗體片段、單克隆抗體、單克隆抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體和人抗體的一組物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞或構(gòu)成自身免疫疾病基礎(chǔ)的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中所述治療性抗體是利妥昔單抗或坎帕斯。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及用于增加治療性抗體功效的方法和組合物。通過提高ADCC機(jī)制來增強(qiáng)它們的療效。更具體而言，本發(fā)明涉及將治療性抗體與阻斷NK細(xì)胞的抑制性受體或刺激其活性受體的化合物聯(lián)合使用，從而增加治療性抗體在人類患者體內(nèi)的治療功效。
文檔編號C07K16/28GK102772798SQ201110414480
公開日2012年11月14日 申請日期2004年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
發(fā)明者安德烈亞·韋拉爾迪, 弗朗索瓦·羅馬涅 申請人:佩魯賈研究大學(xué), 依奈特制藥公司