專利名稱：3F3Rmg重組融合蛋白及其制備方法與在犬狂犬病抗體檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及犬狂犬病病毒防治診斷領域，尤其是一種3F3Rmg重組融合蛋白及其制備方法與在犬狂犬病抗體檢測中的應用。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的所有溫血動物都易感的人獸共患病，一旦發(fā)病，病死率幾乎100%，它是人類病死率最高的急性傳染病之一?？袢〔《?G基因編碼的糖蛋白(glycoprotein，GP)是病毒唯一暴露在表面的蛋白，也是唯一既能刺激機體產(chǎn)生中和抗體又能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫的保護性抗原，同時還是狂犬病毒與宿主細胞受體結合的結構域，并與病毒毒力有關，在狂犬病毒致病和免疫中起著關鍵的作用。目前，尚無有效治療狂犬病的藥物，控制狂犬病主要以暴露前和暴露后的免疫為主，因此暴露前的有效診斷及監(jiān)測狂犬疫苗接種后是否產(chǎn)生有效的保護抗體，開展疫苗免疫效果評估都顯得十分重要。用于血清狂犬病毒抗體的檢測方法主要有熒光抗體試驗(FAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)、熒光抗體病毒中和試驗(FAVNT)、小鼠中和試驗 (MNT)等，但是，這些檢測方法要求較高，需要配備專門的儀器和專業(yè)技術人員，檢測成本昂貴，而且耗時相對較長，這極大地限制了其在基層單位的應用。我國幅員遼闊，農(nóng)村散養(yǎng)犬較多，在開展狂犬病免疫效果評估中，急需快速、簡便、可以現(xiàn)場使用的診斷試劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種3F3Rmg重組融合蛋白及其制備方法。本發(fā)明要解決的另一技術問題是提供一種上述3F3Rmg重組融合蛋白在制備檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒中的應用，該試劑盒操作簡單、靈敏度高、特異性強，適合犬狂犬病抗體的檢測。為解決上述技術問題本發(fā)明采用如下技術方案3F3Rmg重組融合蛋白，由 3F3ScFv和Rmg基因拼接而成的3F3Rmg融合基因所編碼。3F3Rmg融合基因具有序列表SEQ. ID. No. 1的堿基序列。上述3F3Rmg重組融合蛋白，具有序列表SEQ. ID. No. 2的氨基酸序列。上述3F3Rmg重組融合蛋白的制備方法，該制備方法包括以下步驟<1>利用特異性引物分別從pMD-3F3kFv和pMD_RV_G重組基因中分別擴增出 3F3ScFv和Rmg基因，采用SOE-PCR方法拼接成3F3Rmg融合基因；<2>將3F3Rmg融合基因插入到原核表達載體pET_Trx中，構建重組質粒 pET-I^rx-SFSRmG，轉化表達菌株BL21 (DE3)PlysS中，在IPTG的誘導下表達出3F3RmG融合蛋白。特異性引物為
3F3ScFv_U :cgc gga tcc cag gtg cag ttg gga gtg tea，3F3ScFv-D :ggt gca tcc ttc ate tat ttc caa ctt tgt ccc cga ；Rmg-U :aca aag ttg gaa ata gat gaa gga tgc acc aat ctg，Rmg-D :ccg gaa ttc tat aat gcc gtt gaa aat c&c0該制備方法還包括以下步驟<3>通過Ni+親和層析純化、谷胱甘肽法復性、透析和濃縮后獲得了具有生物學活性的3F3Rmg融合蛋白，經(jīng)紅細胞凝集試驗證實該融合蛋白既能夠與人紅細胞結合但不會發(fā)生凝集，又能夠與Rmg抗體反應，具有雙功能特性。人紅細胞為人A型、B型、AB型、0型紅細胞。上述3F3Rmg重組融合蛋白在制備檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒中的應用。檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒，該診斷試劑盒包括0. 2ug/ul的重組融合蛋白的診斷液和2%的人紅細胞溶液。該診斷試劑盒每劑包括診斷液50ul和人紅細胞溶液20ul。1988年，Kemp等首先報道了建立檢測HIV抗體的自體紅細胞凝集試驗快速檢測方法。只需采集待檢人一滴血，5min內即可得知結果，操作程序簡單，目測診斷結果，無需昂貴的特殊儀器和專門人員。其基本原理是以紅細胞作為指示劑，利用重組雙功能融合蛋白既能與紅細胞結合又能與被檢抗體/抗原結合，通過被檢樣品中抗體/抗原的橋聯(lián)作用，使紅細胞發(fā)生肉眼可見的凝集，根據(jù)紅細胞的凝集情況即可快速進行結果判定?；谏鲜鲈恚?本發(fā)明獲得了具有雙功能特性的狂犬病病毒3F3Rmg重組融合蛋白，它由抗人紅細胞表面抗原單鏈抗體基因(3F3ScFv，見序列表SEQ. ID. No. 7的堿基序列)和犬狂犬病病毒G基因主要抗原表位區(qū)基因(Rmg，見序列表SEQ. ID. No. 8的堿基序列)拼接而成的3F3Rmg融合基因所編碼。3F3Rmg重組融合蛋白既能與人紅細胞結合但不會發(fā)生凝集，又能與狂犬病G抗體反應，在抗體橋聯(lián)作用下發(fā)生肉眼可觀察到的凝集現(xiàn)象。應用該重組融合蛋白，發(fā)明人又制備了檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒，其操作簡單、靈敏度高且特異性強， 特別適合犬狂犬病抗體的檢測，滿足了基層現(xiàn)場使用快速、簡便的要求。
具體實施例方式一、3F3Rmg重組融合蛋白的制備1.重組PCR引物設計(引物均由北京博邁德公司合成)根據(jù)重疊延伸PCR的原理和狂犬病毒G基因與3F3kFv基因序列，設計4條重組PCR引物(見表1)。其中引物3F3kFv-U/3F3kFv-D用于擴增合成3F3kFv基因，引物 Rmg-U/Rmg-D 用于擴增合成 Rmg 基因。3F3ScFv 3，末端 15 個堿基(ggt gca tcc ttc ate) 和Rmg 5’端15個堿基(aca aag ttg gaa ata)為互補序列用于基因的拼接，拼接順序為 3F3Rmg0 3F3ScFv-U 中 “gga tcc” 禾口 Rmg-D 中 “gaa ttc” 的部分為引入的 BamHI、EcoRI 酶切位點。表13F3ScFv、Rmg基因引物序列
權利要求
1.一種3F3Rmg重組融合蛋白，其特征在于由3F3ScFv和Rmg基因拼接而成的3F3Rmg 融合基因所編碼。
2.根據(jù)權利要求1所述3F3Rmg重組融合蛋白，其特征在于所述3F3Rmg融合基因具有序列表SEQ. ID. No. 1的堿基序列。
3.根據(jù)權利要求2所述3F3Rmg重組融合蛋白，其特征在于具有序列表SEQ.ID. No. 2 的氨基酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述3F3Rmg重組融合蛋白的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟<1>利用特異性引物分別從pMD-3F3kFv和pMD_RV_G重組基因中分別擴增出3F3kFv 和Rmg基因，采用SOE-PCR方法拼接成3F3Rmg融合基因；<2>將3F3Rmg融合基因插入到原核表達載體pET_Trx中，構建重組質粒 pET-I^rx-SFSRmG，轉化表達菌株BL21 (DE3)PlysS中，在IPTG的誘導下表達出3F3RmG融合蛋白。
5.根據(jù)權利要求4所述的3F3Rmg重組融合蛋白的制備方法，其特征在于所述特異性引物為3F3ScFv-U :cgc gga tcc cag gtg cag ttg gga gtg tea，3F3ScFv-D :ggt gca tcc ttc ate tat ttc caa ctt tgt ccc cga ；Rmg-U :aca aag ttg gaa ata gat gaa gga tgc acc aat ctg，Rmg-D :ccg gaa ttc tat aat gcc gtt gaa aat
6.根據(jù)權利要求5所述的3F3Rmg重組融合蛋白的制備方法，其特征在于該制備方法還包括以下步驟<3>通過Ni+親和層析純化、谷胱甘肽法復性、透析和濃縮后獲得了具有生物學活性的 3F3Rmg融合蛋白，經(jīng)紅細胞凝集試驗證實該融合蛋白既能夠與人紅細胞結合但不會發(fā)生凝集，又能夠與Rmg抗體反應，具有雙功能特性。
7.根據(jù)權利要求6所述的3F3Rmg重組融合蛋白的制備方法，其特征在于所述人紅細胞為人A型、B型、AB型、0型紅細胞。
8.根據(jù)權利要求1至7任一所述3F3Rmg重組融合蛋白在制備檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒，其特征在于該診斷試劑盒包括0. 2ug/ul的所述重組融合蛋白的診斷液和2%的人紅細胞溶液。
10.根據(jù)權利要求9所述的檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒，其特征在于該診斷試劑盒每劑包括所述診斷液50ul和所述人紅細胞溶液20ul。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種3F3Rmg重組融合蛋白及其制備方法，該重組融合蛋白由3F3ScFv和Rmg基因拼接而成的3F3Rmg融合基因所編碼，具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列。它的雙功能特性使得其既能與人紅細胞結合但不會發(fā)生凝集，又能與狂犬病G抗體反應，在抗體橋聯(lián)作用下發(fā)生肉眼可觀察到的凝集現(xiàn)象。應用該重組融合蛋白制備的檢測犬狂犬病抗體紅細胞凝集試驗診斷試劑盒，其操作簡單、靈敏度高且特異性強，特別適合犬狂犬病抗體的檢測，滿足了基層現(xiàn)場使用快速、簡便的要求。
文檔編號C07K19/00GK102492042SQ20111043491
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權日2011年12月22日
發(fā)明者吳健敏, 周松峰, 廖文軍, 白安斌, 袁書智, 覃紹敏, 陳鳳蓮, 馬玲, 黃紅梅 申請人:廣西南寧惠朋動物藥品有限責任公司, 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所