專利名稱：一種類短短芽孢桿菌及其制備的蛋白系列的方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種類短短芽孢桿菌及其制備的蛋白系列的方法和用途。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病的死亡率一直居于第二位，其中血栓性疾病是發(fā)病率、致殘率和死亡率最高的。血栓性疾病是指循環(huán)血液中有血栓形成及血栓從局部脫落隨血流至前方血管內(nèi)，阻塞或部分阻塞血管腔，導(dǎo)致血栓栓塞的ー類疾病。針對血栓性疾病，現(xiàn)行采用的臨床療法共有三種即外科手木、抗栓療法和溶栓療法。手術(shù)治療必須明確栓塞的位置，實(shí)施起來比較困難并存在危險(xiǎn)性；抗栓療法是運(yùn)用藥物控制血栓再形成，而對已經(jīng)形成的血栓無效；溶栓治療是使用藥物溶解已經(jīng)形成的血栓，使被阻塞的血管重新疏通。目前溶栓治療是研究的重點(diǎn)。
溶栓療法是利用溶栓劑直接溶解血栓或通過激活血液中的血纖維蛋白溶解酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白溶酶來催化血栓的主要基質(zhì)血栓纖維蛋白水解。臨床上已正式批準(zhǔn)使用的溶栓劑大致分成三代，第一代鏈激酶(Streptokinase)、尿激酶(Urokinase);第ニ代阿尼普酶(Anistreplase)、重組型組織纖溶酶原激活劑(Alteplase, recombinanthuman tissue-type plasminogen activator);第三代瑞替普酶(Reteplase)、替奈普酶(Tenectep Iase)、拉諾替普酶(Lanotep Iase)、葡萄球菌激酶(Staphy Iokinase )。上述藥物在治療血栓病上已經(jīng)取得了顯著的成績，但離理想的溶栓藥物還有一定的距離，其缺點(diǎn)是溶栓特異性不高，半衰期短，容易引起內(nèi)出血等。理想的溶栓藥物應(yīng)該具有安全、有效、給藥方便、特異性強(qiáng)、半衰期長、能溶解陳舊血栓，復(fù)發(fā)率低、無出血等副反應(yīng)、價(jià)格合理等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服已有抗血栓藥物存在的溶栓特異性不高，半衰期短，容易引起內(nèi)出血等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種類短短芽孢桿菌GYZC01，用其制備的分子量大于7000D的蛋白質(zhì)系列可用于制備溶血栓藥物，效果良好。本發(fā)明的另ー個目的是提供類短短芽孢桿菌制備蛋白質(zhì)系列的方法。本發(fā)明的一種類短短芽孢桿菌，其分類命名為類短短芽孢桿菌{Brevibacillusparabrevis) GYZCOl，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為=CCTCC NO: M 2011461，保藏日期為2011年12月11日。本發(fā)明的類短短芽孢桿菌(Brevibacillus parabrevis) GYZC01是ー種存在于土壤中的革蘭氏陽性菌,是從貴州大學(xué)蔡家關(guān)校區(qū)的土壌中分離到ー株細(xì)菌，在普通瓊脂平板中能生長，最適培養(yǎng)溫度為300C，菌落呈灰黃色，菌體長3-4微米、寬0. 5-0. 8微米，需氧，能利用檸檬酸鹽、銨鹽，不能利用硝酸鹽，能水解酪蛋白、明膠，能利用葡萄糖、果糖、麥芽糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，不能分解乳糖，其蛋白質(zhì)系列具有溶血栓的作用，經(jīng)鑒定，菌株GYZC01為類短短芽孢桿菌(Brevibacillusparabrevis)。
所述的類短短芽抱桿菌{Brevibacillusparabrevis) GYZCOl 的 16S rRNA 具有SEQ ID NO :I的序列，將所得序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，其系列與份AaciBw1S parabrevis M3; AB215101菌株具有99%的相似性，與其他Brevibacillus parabrevis菌株的相似性在97-98. 5%之間。由此判斷GYZCOl屬于新菌株。進(jìn)ー步用MEGA5. O建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，也證明GYZCOl為新菌株。所述的ー種類短短芽孢桿菌制備蛋白質(zhì)系列的方法，將含有類短短芽孢桿菌GYZCOl的細(xì)菌發(fā)酵液冷凍過夜，在室溫融解，得到凍解液，凍解液置離心機(jī)離心，收集上清液，上清液逐漸加入硫酸銨粉，直至飽和，過夜收集沉淀，沉淀物用透析袋透析，得到蛋白質(zhì)系列。所述的ー種類短短芽孢桿菌制備蛋白質(zhì)系列的方法，蛋白質(zhì)系列的分子量大于7000D。所述的蛋白質(zhì)系列在溶血栓藥物的應(yīng)用。 本發(fā)明的類短短芽抱桿菌(Brevibacillus parabrevis)GYZCOl株用27f和1492r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出菌的16S rRNA堿基大小為1392 bp，序列見說明書最后的核苷酸或氨基酸序列表。本發(fā)明達(dá)到的有益效果
本發(fā)明得到的分子量大于7000D的類短短芽孢桿菌(Brevibacillus parabrevis)系列蛋白質(zhì)的溶血栓作用采用體外溶血栓試驗(yàn)方法，并且可以通過發(fā)酵方式進(jìn)行生產(chǎn)，該蛋白質(zhì)系列能緩慢溶解血栓，作用持久，EC50為200 g/ml。體內(nèi)試驗(yàn)表明，該蛋白質(zhì)系列能有效溶解新鮮血栓(EC5tl為400 g/ kg)，但是針對陳舊性血栓，GYZCOl菌株粗蛋白的活性明顯強(qiáng)于尿激酶，EC5tl為800 g/ml，尿激酶EC5tl為1600 g/ml。研究表明，分子量大于7000D的類短短芽孢桿菌(Brevibacillus parabrevis)系列蛋白質(zhì)的溶血栓活性成分為金屬蛋白酶，能直接溶解血栓，不能激活纖溶酶原，因此體內(nèi)使用后不會導(dǎo)致出血等副作用，具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值。說明書附圖

圖I為MEGA5. O建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖2為本發(fā)明類短短芽孢桿菌GYZCOl基因組電泳分析圖譜。圖3為本發(fā)明類短短芽孢桿菌GYZCOl PCR產(chǎn)物電泳圖譜。圖4為GYZCOl粗蛋白溶血栓時-效曲線圖，其中GYZCOl粗蛋白(□)的濃度為800 g/ml，尿激酶( )濃度為 200 g/ml。圖5為體內(nèi)溶血栓(新鮮血栓)雞胚試驗(yàn),其中▲為尿激酶， 為GYZC01，■為生理鹽水。圖6為體內(nèi)溶血栓(陳舊血栓)雞胚試驗(yàn)。▲為GYZC01， 為尿激酶，■為生理鹽水。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :類短短芽孢桿菌GYZCOl 16S rRNA序列測定 一、基因組提取及電泳檢測
I.基因組提取過程按照生エSK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。2.基因組電泳分析圖譜見說明書附圖2 ニ、PCR反應(yīng)
I. PCR體系建立(50ul):
Template (基因組) IOpmol Primer up (IOuM)Iul
Primer down (10 uM)Iul
dNTP mix (IOMm each)Iul
10*Taq reaction Buffer5ul
Taq (5u/ul)0. 25 ul
加水至50ul
PCR程序設(shè)定 預(yù)變性98 °C 5mim ;
循環(huán) 95°C 35S，55°C 35S，72°C Imin 30s，35 個循環(huán)，延伸 8min。3. PCR產(chǎn)物電泳圖譜
4.引物序列
27f 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ 20bp 1492r 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’ 19bp 三、DNA瓊脂糖切膠純化 由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶。四、DNA測序 TTTTAGGACCCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTTTCAGACCGGGATAACATAGGG
AAACTTATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATTGCATGATCCGAAAAGAAAAGATGGCTTCGGCTATCACTGGGAG
ATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGT
GACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGA
AAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGACGAACACGTG
CCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
ACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGC
CCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGA
AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGTTTC
AATACCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAA
TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACA
TCCCGCTGACCGCTCTGGAGACAGAGCTTCCCTTCGGGGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTA
GAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAC
ACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACCTCGCGAGGGGACGCCAATCTCTGAAAACCAATCTCAGTTCGG ATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTC
CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAA
實(shí)施例2 :類短短芽孢桿菌GYZCOl株分子量大于7000D蛋白質(zhì)系列的制備
1.實(shí)驗(yàn)材料
類短短芽孢桿菌(Brevibacillus parabrevis)GYZC01株、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、透析袋、硫酸銨。2.實(shí)驗(yàn)方法
2.I細(xì)菌培養(yǎng)
細(xì)菌培養(yǎng)基的組成蛋白胨lg、氯化鈉O. 5 g、葡萄糖I. 5 g、蒸餾水100ml，高壓滅菌 后備用。將細(xì)菌接種于IOOml的培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)48h，得到種子。按照I比100的比例，將種子菌液加入培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)5L，30°C靜置培養(yǎng)96-120h備用。細(xì)菌發(fā)酵液(5L)冷凍過夜，在室溫融解，再冷凍過夜，如此反復(fù)3次，得到凍解液，凍解液置離心機(jī)5000-100(K)r/min離心10_15min，收集上清液，逐漸加入硫酸銨粉，直至飽和，靜置過夜，收集沉淀(20g)。沉淀物用7000D的透析袋反復(fù)透析，得到分子量大于7000D的蛋白質(zhì)系列，用3500D的透析袋除鹽，收集粗蛋白溶液，冷凍干燥，干燥物(5g)儲藏于冰箱(4°C)。細(xì)菌GYZCOl株在30°C生長良好，培養(yǎng)至120h時，菌數(shù)達(dá)到頂峰，前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，具有溶血栓活性的蛋白質(zhì)既存在于胞外也存在于胞內(nèi)，因此采用凍融方式裂解細(xì)菌，經(jīng)過鹽析，透析除鹽和冷凍干燥后，得到分子量大于7000D的粗蛋白共5g。實(shí)施例3 :類短短芽孢桿菌GYZCOl株分子量大于7000D蛋白質(zhì)系列的體外溶血栓試驗(yàn)
I、實(shí)驗(yàn)材料
類短短芽孢桿菌GYZCOl菌株分子量大于7000D的粗蛋白質(zhì)、毛細(xì)管、尿激酶、平皿；2、實(shí)驗(yàn)方法
酒精消毒無名指，針刺采血，用毛細(xì)管吸入血液，水平放置，大約IOmin血液凝固。將類短短芽孢桿菌GYZCOl菌株粗蛋白用生理鹽水溶解制成系列濃度的樣本溶液，尿激酶做陽性對照、生理鹽水做陰性對照，上述樣本、陽性對照和陰性對照溶液分別置入60mm的平皿中，把帶血凝塊的毛細(xì)管切成5_長，放入平皿中，每平皿5只，使其浸入液體，平皿加蓋，置室溫中，開始計(jì)時。24h后觀察、記錄毛細(xì)管中血凝塊被溶解的情況；
3.結(jié)果
表I為體外溶血栓試驗(yàn)結(jié)果，可見尿激酶溶血栓活性最強(qiáng)，GYZCOl粗蛋白在濃度為800jttg.'Oil時能100%地溶解血栓，EC50為200 μぎml。
_ _表丄體燃血檢毛細(xì)管試驗(yàn)_
樣本___濃度(pg/ml) _ _
__ 800 __400 __ 200 __100__50 —
GYZCOl 100%溶解 7(3%溶解 50%溶解 30%溶解 0%溶解 尿激酶 100%溶解 100%溶解 100%溶解 80%溶解 50%溶解 生理鹽水 0%溶解 ____
GYZCOl粗蛋白對血栓的溶解比較溫和，24h內(nèi)將血栓全部溶解，而尿激酶12h內(nèi)即可將血栓全部溶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，GYZCOl蛋白質(zhì)系列存在良好的體外溶血栓活性，并且可以通過發(fā)酵方式進(jìn)行生產(chǎn)，溶血栓的特征為溫和溶解，作用持久。實(shí)施例4 :類短短芽孢桿菌GYZCOl株分子量大于7000D蛋白質(zhì)系列的雞胚溶血栓試驗(yàn)
I.實(shí)驗(yàn)材料
類短短芽孢桿菌GYZCOl菌株分子量大于7000D的粗蛋白質(zhì)、尿激酶、8日齡雞胚、生理 鹽水、三氯化鐵、定性濾紙。2.實(shí)驗(yàn)方法
從8日齡雞胚氣室端打開卵殼，暴露尿囊膜，用鉤針分離血管，再用含三氯化鐵溶液的濾紙條接觸雞胚血管15-20S，在接觸處即形成血栓，肉眼可見。血栓形成約2h后(新鮮血栓)或6 h后(陳舊血栓)，開始給藥(尿激酶做陽性對照、生理鹽水做陰性對照)，即將藥液滴加在血栓形成處，或?qū)⑺幰鹤⑷胙芑蚰蚰仪唬脺缇该髂z布封閉ロ子。給藥后2、8、16、20,24 h觀察血栓溶解情況。3、結(jié)果
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，GYZCOl菌株分子量大于7000D的粗蛋白體內(nèi)溶血栓(新鮮血栓)活性不如尿激酶，EC5tl為400,尿激酶EC5tl為100丨1.ぎ1111 ,但是針對陳舊性血栓，GYZCOl菌株粗蛋白的活性強(qiáng)于尿激酶，EC50為800，尿激酶EC5tl為1600 gg/ml。
權(quán)利要求
1.一種類短短芽孢桿菌，其特征在干其分類命名為類短短芽孢桿菌{Brevibacilhisparabrevis) GYZCOI，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M2011461，保藏日期為2011年12月11日。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種類短短芽孢桿菌，其特征在于所述的類短短芽孢桿菌GYZCOl 的 16S rRNA 具有 SEQ ID NO 1 的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種類短短芽孢桿菌制備蛋白質(zhì)系列的方法，其特征在于將含有類短短芽孢桿菌GYZCOl的細(xì)菌發(fā)酵液冷凍過夜，在室溫融解，得到凍解液，凍解液置離心機(jī)離心，收集上清液，上清液逐漸加入硫酸銨粉，直至飽和，過夜收集沉淀，沉淀物用透析袋透析，得到蛋白質(zhì)系列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種類短短芽孢桿菌制備蛋白質(zhì)系列的方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)系列的分子量大于7000D。
5.—種如權(quán)利要求4中所述的蛋白質(zhì)系列在溶血栓藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種類短短芽孢桿菌及其制備的蛋白系列的方法和用途，其分類命名為類短短芽孢桿菌(Brevibacillusparabrevis)GYZC01，CCTCC NOM2011461，它的16SrRNA具有SEQIDNO1的序列，用類短短芽孢桿菌GYZC01株制備的蛋白質(zhì)系列可用于制備溶血栓藥物，該蛋白質(zhì)系列能緩慢溶解血栓，作用持久，EC50為200，并能有效溶解新鮮血栓，EC50為400，針對陳舊性血栓，GYZC01菌株粗蛋白的活性明顯強(qiáng)于尿激酶，EC50為800。
文檔編號C07K14/195GK102643762SQ20111044189
公開日2012年8月22日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者宋丹丹, 杜潤孜, 楊再昌, 楊小生, 陸倫維 申請人:貴州大學(xué)