專利名稱：癌干細(xì)胞標(biāo)記物及其用途的制作方法
癌干細(xì)胞標(biāo)記物及其用途本發(fā)明尤其與這樣的處理方法相關(guān)，其基于特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)的糖抗原的試劑用于處理癌干細(xì)胞及相關(guān)疾病的用途。還提供了使用腫瘤相關(guān)的糖抗原作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物的診斷及預(yù)后方法。
背景技術(shù)：
腫瘤可視為由致瘤性癌細(xì)胞起始的異常器官，此過程需要通過積累的突變產(chǎn)生無限増殖的能力。在將腫瘤視為異常器官的理解中，可應(yīng)用正常干細(xì)胞生物學(xué)的原理以更好地理解腫瘤是如何發(fā)展及擴(kuò)散的。許多發(fā)現(xiàn)表示將正常干細(xì)胞和致瘤性細(xì)胞之間進(jìn)行類比是恰當(dāng)?shù)摹Ｕ８杉?xì)胞與致瘤性細(xì)胞二者都具有很強(qiáng)的増殖潛力井能夠產(chǎn)生新的(正?；虍惓?組織。致瘤性細(xì)胞可被視為癌干細(xì)胞(CSC)或癌起始細(xì)胞(CIC—在本文中術(shù)語CSC與CIC作為同義詞使用)，其與正常干細(xì)胞類似地經(jīng)歷了異常及調(diào)控不良的器官發(fā)生過程。腫瘤和正常組織都由雜合組合的細(xì)胞組成，具有不同表型特征及不同擴(kuò)增潛力的。
癌干細(xì)胞被認(rèn)為是具有干細(xì)胞樣特性的腫瘤的特定部分，其起始并維持了瘤克隆。這些細(xì)胞具有自我更新的能力，但是也形成了產(chǎn)生表型多祥的癌細(xì)胞但具有較低致瘤性潛能的祖細(xì)胞。與并非癌干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞相比，這種干細(xì)胞樣細(xì)胞的亞群在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移性腫瘤擴(kuò)散方面是高效的。已經(jīng)在廣泛多種癌癥，包括白血病、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤以及幾乎所有類型的上皮腫瘤(癌)中鑒定出癌干細(xì)胞(CSC)?，F(xiàn)在已經(jīng)廣泛接受了癌干細(xì)胞(CSC)通常為癌癥發(fā)生的前提條件這一理論。癌干細(xì)胞表現(xiàn)出低的増殖速率、高的自我更新能力、傾向于分化成活躍增殖的腫瘤細(xì)胞，并顯示出對(duì)化療或放療的抗性(參見例如，Van der Griend等人，2008)?？筛鶕?jù)對(duì)原發(fā)性腫瘤內(nèi)不同表面標(biāo)記物形式的研究來表征癌干細(xì)胞。在數(shù)目不斷増加的建議CSC標(biāo)記物中，最顯著并最為接受而且也在不同腫瘤類型的CSC中廣泛分布的有兩種CD44和CD133。有報(bào)道稱CD44為癌干細(xì)胞的強(qiáng)標(biāo)記物(Chu等人，2009 ；Takaishi等人2009)。來自結(jié)腸腫瘤的單個(gè)CD44+細(xì)胞可在體外形成球體并能夠產(chǎn)生類似于原發(fā)性腫瘤特性的異種移植瘤(Du等人，2008)。⑶133也是癌干細(xì)胞的標(biāo)記物。一開始⑶133被描述為特異性針對(duì)人造血干細(xì)胞的表面抗原以及小鼠神經(jīng)上皮及幾種其他胚胎上皮的標(biāo)記物(Singh等人2004)。在大量的近期研究中，將⑶133單獨(dú)或與其他標(biāo)記物聯(lián)合用于從結(jié)腸、肺和肝臟的惡性腫瘤中分離癌干細(xì)胞(Haraguchi等人，2008)。⑶133+腫瘤細(xì)胞比⑶133-腫瘤細(xì)胞更能有效地修復(fù)放射性誘導(dǎo)的DNA損傷(Bao等人，2006)。癌干細(xì)胞的存在對(duì)于癌癥治療有深遠(yuǎn)的意義。現(xiàn)有的療法大部分是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的大塊群體而研發(fā)的，因?yàn)檫@些療法是通過其縮小腫瘤實(shí)質(zhì)的能力鑒定的。然而，癌干細(xì)胞經(jīng)常對(duì)化療有抗性并能使化療失敗(Sell等人，2008)。為設(shè)計(jì)(也)靶向癌起始細(xì)胞(本文中也稱為癌干細(xì)胞)的治療試劑，需要尋找優(yōu)選地在良性腫瘤和/或正常非腫瘤細(xì)胞中不存在的癌干細(xì)胞的分子靶標(biāo)，同時(shí)此靶標(biāo)特異性針對(duì)癌干細(xì)胞。預(yù)期這些試劑對(duì)腫瘤(尤其是轉(zhuǎn)移腫瘤)產(chǎn)生更持久的應(yīng)答及療效。因此，需要新的癌干細(xì)胞標(biāo)記物以提供新型治療性靶標(biāo)以改進(jìn)療法。大多數(shù)已知的干細(xì)胞標(biāo)記物為蛋白質(zhì)。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中多數(shù)為正常干細(xì)胞標(biāo)記物，因此在非腫瘤干細(xì)胞上表達(dá)。這使得其不適合或不那么適合作為治療性靶標(biāo)。目前，正常和癌干細(xì)胞之間沒有非常明顯的區(qū)別。因此，非常需要能夠鑒定其它合適的癌干細(xì)胞標(biāo)記物，和使用這些標(biāo)記物用于診斷和預(yù)后方法和/或發(fā)展靶向癌干細(xì)胞的療法。發(fā)明概述本發(fā)明基于腫瘤相關(guān)糖抗原為合適的癌干細(xì)胞標(biāo)記物這一發(fā)現(xiàn)。因?yàn)閹缀跛衅衩枋龅陌└杉?xì)胞標(biāo)記物都為蛋白質(zhì)，因此發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)糖抗原如⑶176、⑶174和⑶173表達(dá)于癌干細(xì)胞這一點(diǎn)很出乎意料。因此，這 些腫瘤相關(guān)糖抗原為用于癌干細(xì)胞的合適的標(biāo)記物，進(jìn)ー步地，其提供攻擊癌干細(xì)胞的療法的合適的治療性靶標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑，用于處理表達(dá)所述腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞。還提供了藥物組合物，其包含用于處理表達(dá)所述腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞的相應(yīng)結(jié)合試劑。根據(jù)第二方面，提供了用于鑒定包含對(duì)用特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑的處理易感的癌干細(xì)胞的癌的方法，其中所述處理對(duì)癌干細(xì)胞有效，所述方法確定獲自患者的癌樣品是否含有表達(dá)由結(jié)合試劑特異性針對(duì)的腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞，其中癌干細(xì)胞上所述腫瘤相關(guān)糖抗原的存在表示此癌對(duì)用特異性結(jié)合所述腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑進(jìn)行的處理易感，其中所述處理對(duì)癌干細(xì)胞有效。根據(jù)第三方面，提供了對(duì)癌進(jìn)行診斷、分期和/或預(yù)后和/或其對(duì)處理的易感性進(jìn)行監(jiān)視的方法，包括分析分離自患者的樣品中細(xì)胞上腫瘤相關(guān)糖抗原表達(dá)的步驟，其中表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原的細(xì)胞的存在表示所述樣品中存在癌干細(xì)胞。根據(jù)第四方面，提供了哺乳動(dòng)物癌干細(xì)胞的組合物，其中組合物中至少50%、優(yōu)選地至少75%的細(xì)胞為癌干細(xì)胞，其表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原。根據(jù)相關(guān)的方面，提供了用于分離干細(xì)胞的方法，包括對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞進(jìn)行選擇性的富集。根據(jù)第五方面，提供了用于根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒，包括特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑以及用于根據(jù)本發(fā)明的方法的說明書。根據(jù)第六方面，提供了就表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞的有效性，篩選候選治療試劑例如化療試劑或其他抗癌藥物的方法，所述方法包括a.將所述試劑與根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞組合物相接觸，以及b.確定所述試劑針對(duì)所述腫瘤相關(guān)糖抗原陽性的癌細(xì)胞的有效性。本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下說明和附隨的權(quán)利要求中了解本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征、優(yōu)點(diǎn)及方面。然而，要理解的是以下描述、附隨的權(quán)利要求及具體實(shí)施例代表本申請(qǐng)優(yōu)選的實(shí)施方式，是以說明的方式給出的。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀以下內(nèi)容后會(huì)清楚公開的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾。定義如本文所使用的，以下詞句除了在使用其的上下文中有另有說明外，一般優(yōu)選地意欲具有如下文提出的意義?！敖Y(jié)合試劑”可以為任何能夠結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)如腫瘤相關(guān)糖抗原的化合物或化合物復(fù)合體。優(yōu)選地，結(jié)合試劑能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)。通過篩選結(jié)合試劑庫以鑒定/獲得結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合試劑來獲得合適的結(jié)合試劑。各結(jié)合試劑庫的實(shí)例為例如展示有結(jié)合試劑的卩遼菌體或卩遼菌粒的庫。用于在體外獲得例如抗體的方法也在Hudson和Souriau(Hudson, P. J. and Souriau, C. (2003) "Engineered antibodies"Nat. Med. 9, 129-134)中有描述。只要其能識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)，在本文中是腫瘤相關(guān)糖抗原，結(jié)合試劑可以具有任何結(jié)構(gòu)。結(jié)合試劑可選自抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物或者具有提供了結(jié)合功能的蛋白質(zhì)骨架的結(jié)合試劑如anticalin或植物凝集素。結(jié)合試劑還可以為提供了結(jié)合功能的肽或融合蛋白質(zhì)。對(duì)具有與抗體類似的結(jié)合功能的結(jié)合試劑的概述見于Hey等人(Hey等人，(2005) Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical andindustrial application", Trends in Biotechnology23 (10)，514-522)?？贵w衍生物還包括具有相同結(jié)合功能但例如改變的氨基酸序列的抗體或抗體片段。術(shù)語“抗體”具體指的是包含由ニ硫鍵相連的至少兩條重鏈和兩條輕鏈的蛋白質(zhì)。術(shù)語“抗體”包括天然發(fā)生的抗體以及抗體的所有重組形式，例如，表達(dá)于原核細(xì)胞中的抗體、非糖基化抗體、人源化抗體及嵌合抗體。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(Vh)和重鏈恒定區(qū)(Ch)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(VJ和輕鏈恒定區(qū)(Q)組成。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)或 在IgM-或IgE-型抗體的情況下四個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1、Ch2、Ch3和CH4)，其中第一個(gè)重鏈結(jié)構(gòu)域CHl與可變區(qū)臨近并與通過鉸鏈區(qū)第二個(gè)恒定區(qū)Ch2相連。輕鏈恒定區(qū)僅由一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)成?？勺儏^(qū)可進(jìn)ー步劃分為超可變區(qū)(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))，其分散于稱為骨架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域之間，其中各個(gè)可變區(qū)包含三個(gè)⑶R以及四個(gè)FR。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈可變區(qū)包含ー個(gè)與抗體相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)所述免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞如效應(yīng)子細(xì)胞以及經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分Clq)的結(jié)合。IgA和IgM分子通常具有J鏈，但也明確地包括由其衍生的如不具有J鏈的分子。進(jìn)ー步地，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“抗體”還包括單鏈抗體以及重鏈抗體，即，只由一條或多條(尤其是兩條)重鏈組成的抗體，和納米抗體，g卩，只由單個(gè)單體可變結(jié)構(gòu)域組成?？贵w的“抗原結(jié)合片段或衍生物”具體而言為蛋白質(zhì)或糖蛋白，其能夠如參考抗體那樣結(jié)合至例如抗原的相同表位。因此，本文中抗體的抗原結(jié)合片段或衍生物通常指的是功能性的抗原結(jié)合片段。優(yōu)選地，所述抗原結(jié)合片段包含完全抗體的至少20個(gè)氨基酸、更優(yōu)選地至少100個(gè)氨基酸，優(yōu)選地包含抗體的結(jié)合區(qū)域。在具體的優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體的抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)域。顯示全長抗體的片段能起到抗體的抗原結(jié)合功能?？贵w片段的實(shí)例包括(i) Fab片段，由各個(gè)重鏈和輕鏈的可變區(qū)和第一恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(i i )F (ab) 2片段，包含例如由鉸鏈區(qū)的ニ硫橋連在一起的兩條Fab片段的ニ價(jià)片段；
(iii)由重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域ChI構(gòu)成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的Fv片段；(V) scFv片段，由単一多肽鏈構(gòu)成的Fv片段；(vi)由兩條Fv片段共價(jià)相連構(gòu)成的(Fv)2K段；(vii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；以及(viii)由以重鏈和輕鏈可變區(qū)之間的相連只能在分子間發(fā)生而不能分子內(nèi)發(fā)生的方式共價(jià)連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的多價(jià)抗體。術(shù)語“抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物”還包括単一結(jié)構(gòu)域的抗體。具有不同聚糖側(cè)鏈的抗體或抗體片段也在此定義理解之內(nèi)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段或衍生物?！疤禺愋越Y(jié)合”優(yōu)選地表示結(jié)合試劑如抗體或抗原結(jié)合片段或衍生物，相比于與另ー種靶標(biāo)的結(jié)合，其與其特異性針對(duì)的靶標(biāo)如表位結(jié)合地更強(qiáng)。如果試劑結(jié)合第一種靶標(biāo)的解離常數(shù)(Kd)比其結(jié)合第二種靶標(biāo)的解離常數(shù)低，則其對(duì)第一種靶標(biāo)的結(jié)合相比于第二種靶標(biāo)更強(qiáng)。優(yōu)選地所述試劑特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)比對(duì)所述試劑不特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)低，是超過1/2、更優(yōu)選地超過1/5，更優(yōu)選超過1/10，甚至更優(yōu)選超過1/20、1/50、1/100、1/200、1/500或1/1000。優(yōu)選地，特異性結(jié)合指的是解離常數(shù)為10 μ M或更低、更優(yōu)選地為3 μ M或更低、I μ M或更低、700ηΜ或更低、500ηΜ或更低、300ηΜ或更低、200ηΜ或更低、優(yōu)選地為IOOnM或更低、70ηΜ或更低、50ηΜ或更低、30ηΜ或更低、20ηΜ或更低、并且最優(yōu)選地IOnM或更低、5ηΜ或更低、2ηΜ或更低或InM或更低的結(jié)合。解離常數(shù)優(yōu)選地在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)量，尤其是在生理?xiàng)l件下。如果特異性結(jié)合靶標(biāo)化合物(如CD176)的結(jié)合試劑用于具體方法以結(jié)合至所述靶標(biāo)化合物，優(yōu)選地選擇能夠使所述結(jié)合試劑對(duì)其他尤其是類似的化合物(如其他糖抗原)的結(jié)合在此方法中檢測(cè)不到或不干擾檢測(cè)和/或確定其與靶標(biāo)的結(jié)合的條件。特異性結(jié)合靶標(biāo)結(jié)構(gòu)如根據(jù)本發(fā)明的腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑還包括以下實(shí)施方式，其中只要能夠特異性地識(shí)別靶標(biāo)結(jié)構(gòu)，結(jié)合試劑還結(jié)合除了靶標(biāo)結(jié)構(gòu)外的其他結(jié)構(gòu)。例如，術(shù)語“特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑”包括結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原并也結(jié)合其他結(jié)構(gòu)的結(jié)合試劑，尤其是所述腫瘤相關(guān)糖抗原所連接的載體分子。優(yōu) 選地，所述其他的結(jié)構(gòu)，尤其是腫瘤相關(guān)糖抗原的載體分子，在沒有腫瘤相關(guān)糖抗原時(shí)不受結(jié)合試劑的結(jié)合，或只是在結(jié)合非特異性靶標(biāo)時(shí)相比于特異性靶標(biāo)以高得多的(如上文限定的)解離常數(shù)結(jié)合。如本文所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”具體而言指的是氨基酸的分子鏈或超過ー種氨基酸鏈的復(fù)合體。蛋白質(zhì)可包含任何天然發(fā)生的氨基酸以及人工氨基酸，并可為生物或合成來源?？蓪?duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行天然(翻譯后修飾)或合成的修飾，通過例如糖基化、酰胺化、羧基化和/或磷酸化。蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)氨基酸，但不需要為任何特定的長度；此術(shù)語不包括任何的大小限制。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“蛋白質(zhì)”“多肽”和“肽”交換使用。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)包含至少10個(gè)氨基酸、優(yōu)選地至少50個(gè)氨基酸、至少100個(gè)氨基酸以及最優(yōu)選地至少100個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“患者”具體而言指的是人類、非人靈長類或其他動(dòng)物，具體而言為哺乳動(dòng)物如牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒類如小鼠或大鼠。在ー個(gè)具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，患者為人類。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“癌癥”具體而言指的是白血病、精原細(xì)胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、骨髄瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、腎上腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、子宮癌、腸道癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、小腸癌、頭頸癌、胃腸癌、淋巴結(jié)癌、食道癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、卵巣癌和肺癌，以及其轉(zhuǎn)移癌。如本文使用的，癌指的是增值過度的病況。該術(shù)語指的是惡性及非惡性細(xì)胞群體，但優(yōu)選地指惡性細(xì)胞及其細(xì)胞群體。這些障礙具有ー種或多種細(xì)胞亞群的過度細(xì)胞増殖，其經(jīng)?？瓷先ヅc周圍組織在形態(tài)上和基因型上有差異。過度的細(xì)胞増殖可通過與ー般群體對(duì)照和/或通過與具體患者在例如患者人生的較早時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行對(duì)照而確定。過度增殖的細(xì)胞障礙可在不同的動(dòng)物類型及人類中發(fā)生，并產(chǎn)生不同的物理表現(xiàn)，取決于受影響的細(xì)胞。通過“腫瘤”具體而言指的是通過錯(cuò)調(diào)控的細(xì)胞増殖形成的一組細(xì)胞或組織。腫瘤顯示了正常組織的結(jié)構(gòu)組織和功能性協(xié)作上的部分或全部缺失，并通常來自不同的組織實(shí)質(zhì)，其可為良性或惡性的。具體而言，術(shù)語腫瘤指的是惡性腫瘤。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，術(shù)語“腫瘤細(xì)胞”還包括非實(shí)體癌的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞。根據(jù)另ー個(gè)實(shí)施方式，非實(shí)體癌的細(xì)胞不在術(shù)語“腫瘤細(xì)胞”范圍內(nèi)。通過“轉(zhuǎn)移”具體而言指的是癌細(xì)胞從其原始位點(diǎn)擴(kuò)散到身體的其他部分。轉(zhuǎn)移的形成是非常復(fù)雜的過程，一般涉及癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤的脫離，進(jìn)入身體循環(huán)并穩(wěn)定下來在身體內(nèi)其他位置的正常組織中生長。當(dāng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，新腫瘤叫做ニ級(jí)或轉(zhuǎn)移腫瘤，其細(xì)胞一般與原始腫瘤中的細(xì)胞類似。這意味著，例如，如果乳腺癌轉(zhuǎn)移到肺，ニ級(jí)腫瘤是以異常乳腺細(xì)胞構(gòu)成，而不是異常肺細(xì)胞。肺中的腫瘤叫做轉(zhuǎn)移乳腺癌，不是肺癌。根據(jù)本發(fā)明，癌的“分期”優(yōu)選地指的是對(duì)癌的進(jìn)程及程度的分類。優(yōu)選的癌分期系統(tǒng)是惡性腫瘤的TNM分類，其中T描述的是腫瘤的大小及其是否侵入附近的組織，N描述的是所涉及的區(qū)域性淋巴結(jié)，而M描述了遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移情況。根據(jù)患者中的情況，對(duì)這些參數(shù) 中每個(gè)給出具體值，其中一般較高的數(shù)字表示更嚴(yán)重的情況(T (0-4),N (0-3),M (0/1))。另外，對(duì)于更詳細(xì)的分類，可確定進(jìn)一歩的參數(shù)并/或可使用前綴。進(jìn)ー步地，可根據(jù)ncc在癌分期系統(tǒng)中總結(jié) m分類，其參考O期-IV期的癌。根據(jù)本發(fā)明，“樣品”具體而言指的是但不限于組織樣品、體液和/或細(xì)胞樣品，并可通過常規(guī)方式如通過組織活檢(包括穿刺活檢)或通過取含有或疑似含有癌細(xì)胞的血、支氣管排出物、痰、尿、排泄物或其他體液或組織切片、樣片等獲得。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“樣品”還包括各樣品的級(jí)分或組分。如本文所描述的，術(shù)語“細(xì)胞増殖”及“増殖”具體而言指的是通過細(xì)胞分裂進(jìn)行的細(xì)胞擴(kuò)增。術(shù)語“癌干細(xì)胞”具體而言涉及但不限于在合適的條件下能在體外產(chǎn)生非分化細(xì)胞的聚合體(稱為腫瘤球)的細(xì)胞。形成球體的細(xì)胞能夠自我更新；當(dāng)將其分離并在相同條件下生長時(shí)，其將再次形成球體。在體內(nèi)，癌干細(xì)胞特征在于其形成轉(zhuǎn)移的潛力及干細(xì)胞標(biāo)記物如CD44的表達(dá)。其還可提供藥物抗性。術(shù)語“癌干細(xì)胞”及“癌起始細(xì)胞”在本文用作同義詞。術(shù)語“腫瘤相關(guān)糖抗原”具體而言指的是表達(dá)于癌和/或腫瘤細(xì)胞尤其是惡性癌和/或惡性腫瘤細(xì)胞上的糖抗原。術(shù)語“腫瘤特異性糖抗原”具體而言指的是主要或甚至專門表達(dá)在癌和/或腫瘤細(xì)胞上的糖抗原，而因此其在非癌或非腫瘤細(xì)胞上只以很低的量生長。優(yōu)選地，術(shù)語“腫瘤特異性糖抗原”指的是主要或優(yōu)選地專門表達(dá)在惡性癌和/或惡性腫瘤細(xì)胞上的糖抗原，而因此其在非癌或非腫瘤細(xì)胞、良性癌和/或良性腫瘤細(xì)胞和/或在同一患者的健康組織中只以很低的量生長。優(yōu)先地，腫瘤特異性糖抗原不在大多數(shù)正常細(xì)胞上表達(dá)，甚至更優(yōu)選地，其只在少數(shù)正常細(xì)胞或細(xì)胞類型上表達(dá)，甚至更優(yōu)選地，在這些正常細(xì)胞上的表達(dá)具有特定的定位，例如，嚴(yán)格處于頂部或在緊密的連接之間，因此，系統(tǒng)性尤其是i. V.施用的結(jié)合分子不會(huì)或僅僅到達(dá)正常細(xì)胞上的抗原，甚至更優(yōu)選地，其在正常上皮細(xì)胞上不表達(dá)，最優(yōu)選的是其在正常細(xì)胞上不表達(dá)。在特定實(shí)施方式中，腫瘤特異性糖抗原在表達(dá)時(shí)可連接于載體分子。這種載體分子具體而言為蛋白質(zhì)、肽或糖類。“CD176”指的是腫瘤相關(guān)的 Thomsen-Friedenreich 抗原(TF)。TFWTFa 和 TF β兩種形式存在，其可與蛋白質(zhì)或糖脂相連。Core-I為ニ糖Gali3 l-3GalNAc，其具體而言以α -異構(gòu)構(gòu)象的O-糖苷鍵連接于腫瘤細(xì)胞中羥基氨基酸絲氨酸或蘇氨酸或蛋白質(zhì)。Core-I對(duì)應(yīng)TFa結(jié)構(gòu)。而此ニ糖為發(fā)現(xiàn)于正常細(xì)胞的許多膜糖蛋白上的隱藏的廣泛的核心結(jié)構(gòu)，其在腫瘤細(xì)胞上的暴露及由此產(chǎn)生的抗原新生限制在少數(shù)特異性載體蛋白質(zhì)上。已經(jīng)表示CD176表達(dá)于多種癌細(xì)胞表面上，如乳腺癌(Imai等人，2001 ；Goletz等人，2003)、結(jié)腸癌(Cao等人，1995)、肝細(xì)胞癌(Cao等人，1999)、數(shù)種白血病(Cao等人，2008)以及其他類型的癌上。作為功能性分子實(shí)體，癌細(xì)胞表面上的CD176參與細(xì)胞的侵入和轉(zhuǎn)移特性(Cao等人，1995)。此后，術(shù)語CD176優(yōu)選地指腫瘤特異性core-1結(jié)構(gòu)Gal β l_3GalNA α 1_0_?！阿?75”指的是Tn抗原，其為具有GalNAc α 1-0-結(jié)構(gòu)的腫瘤相關(guān)糖抗原。其在高比例的情況下表達(dá)于大多數(shù)上皮癌及數(shù)種白血病中。其還在一定程度上表達(dá)于良性腫瘤。CD 175為腫瘤特異性抗原?！阿?75s”指的是s-Tn抗原(也稱為唾液酸化-Tn或TAG-72)，其為具有NeuAca 2_6GalNAca 1-0-結(jié)構(gòu)的腫瘤相關(guān)糖抗原。其在高比例的情況下表達(dá)于大多數(shù)上皮 癌及數(shù)種白血病中。“CD173”指的是血液O型抗原(也稱為2型H)，其為具有Fuca l-2Gali3 l-4GlcNAci3 I-結(jié)構(gòu)的腫瘤相關(guān)糖抗原。其表達(dá)于紅血細(xì)胞及血液O型個(gè)體的內(nèi)皮細(xì)胞上。其在除了 O型之外的血型的患者中為癌相關(guān)抗原?！癈D174”指的是路易斯Y抗原(也稱為Le Y)，其為具有Fuca l-2Gal^ l-4[Fuca l_3]GlcNAc β I-結(jié)構(gòu)的腫瘤相關(guān)糖抗原。CD174在許多上皮癌、數(shù)種白血病及造血祖細(xì)胞上為腫瘤特異性的?！癈A19-9”指的是唾液酸化-Le a 抗原，其為具有 NeuAc a 2_3Gal β 1-3 [Fuc α 1-4]GlcNAc β l-3Gal β I-結(jié)構(gòu)的腫瘤相關(guān)糖抗原。其在腸胃及胰腺癌上高度表達(dá)而不在乳腺、腎或前列腺腫瘤上表達(dá)?！阿?4”，一種膜糖蛋白(105_120kDa)，為熟知的造血祖細(xì)胞的標(biāo)記物。其還表達(dá)于大多數(shù)白血病細(xì)胞上。“⑶44”為具有多種分子量的粘附分子(H-CAM，Pgp-I)。其為細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體，與基質(zhì)金屬蛋白酶相互作用且在細(xì)胞遷移中起重要作用。已將CD44描述為乳腺、卵巣、胰腺、前列腺、結(jié)腸、胃及其他癌癥類型中的癌干細(xì)胞標(biāo)記物(見Li等人，2007及Takaishi等人，2009)。其還為正常多能干細(xì)胞的標(biāo)記物。在一些癌癥類型上產(chǎn)生⑶44的剪接變體，如結(jié)腸癌上的⑶44v6?！癈D133” (prominin, 120kDa)為5次跨膜結(jié)構(gòu)域糖蛋白。該基因編碼865氨基酸的糖蛋白，并在整個(gè)動(dòng)物界中保守。已經(jīng)將其描述為許多癌癥類型中的癌干細(xì)胞標(biāo)記物(例如，結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌以及肝細(xì)胞癌，以及黑色素瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤)。“CD164”(MGC_24，24kDa)為造血祖細(xì)胞的標(biāo)記物，也是胃癌的癌干細(xì)胞標(biāo)記物(見Masuzawa 等人，1992)。術(shù)語“細(xì)胞”和“多種細(xì)胞”及“細(xì)胞群體”交換使用，具體而言指的是ー種或多種細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該術(shù)語包括細(xì)胞或細(xì)胞群體的后代。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)至IJ“細(xì)胞”包括単一細(xì)胞的后代，而且由于天然、隨機(jī)或有意的突變和/或變化，此后代不必(在形態(tài)學(xué)或總的DNA互補(bǔ)上)與原始親本細(xì)胞完全同一?！坝行Я俊本唧w而言是足以影響有益的或想要的臨床結(jié)果的量。有效量可以在一次或多次施用中進(jìn)行施用。作為活性成分的結(jié)合試劑的有效量具體而言為足以診斷、減弱、減輕、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減緩或延遲疾病狀態(tài)進(jìn)展的量。活性成分的毒性和治療效カ可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制藥步驟在細(xì)胞培養(yǎng)物和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定，包括例如確定LD5tl(對(duì)50%的群體產(chǎn)生致死性的劑量)以及ED5tl (對(duì)50%群體有治療效應(yīng)的劑量)。毒性和治療效應(yīng)之間的劑量比例為治療指數(shù)，并可表示為LD5tZED5tl比例。表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的結(jié)合試劑是優(yōu)選的。獲自細(xì)胞培養(yǎng)物和/或動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用于對(duì)用于人的劑量范圍進(jìn)行配制?；钚猿煞值膭┝恳话阍谘h(huán)濃度的范圍內(nèi)，其包括低毒性的ED5tlt5劑量可根據(jù)所使用的劑型以及所應(yīng)用的施用途徑在所述范圍內(nèi)變動(dòng)。發(fā)明詳述
本發(fā)明是基于腫瘤相關(guān)糖抗原表達(dá)于癌干細(xì)胞上并因此作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物這一發(fā)現(xiàn)。此發(fā)現(xiàn)很出乎意料，因?yàn)槠袼枋龅陌└杉?xì)胞標(biāo)記物幾乎都是蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及腫瘤相關(guān)的糖抗原，優(yōu)選的腫瘤特異性糖抗原作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物的用途，所述腫瘤特異性糖抗原優(yōu)選地選自CD176、CD175、CD175s、CD174、CD173和CA19-9，更優(yōu)選地選自 CD176、CD175 和 CD175s。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑用于處理表達(dá)所述腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞的用途。本發(fā)明人顯示了數(shù)種腫瘤相關(guān)糖抗原如⑶176、⑶174和⑶173表達(dá)于癌干細(xì)胞上并因此成為新型癌干細(xì)胞標(biāo)記物。鑒定腫瘤相關(guān)糖抗原作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物提供了用于特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的試劑的新型治療應(yīng)用。特異性結(jié)合相應(yīng)的腫瘤相關(guān)糖抗原的試劑現(xiàn)在可以治療性地應(yīng)用于靶向表達(dá)所述癌干細(xì)胞腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞。這提供了靶向并優(yōu)選地殺死癌干細(xì)胞的治療性處理的機(jī)會(huì)。相應(yīng)的治療試劑可例如用于靶向并因此破壞對(duì)常規(guī)化療有抗性的癌干細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了改善的癌癥療法。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，腫瘤相關(guān)糖抗原主要地或甚至專門地表達(dá)于癌干細(xì)胞上。根據(jù)另ー個(gè)實(shí)施方式，腫瘤相關(guān)糖抗原表達(dá)于癌干細(xì)胞以及并非是癌干細(xì)胞的癌細(xì)胞上。如果腫瘤相關(guān)糖抗原表達(dá)于兩種細(xì)胞群體上，則此具有優(yōu)點(diǎn)是用所述特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑靶向兩種細(xì)胞群體進(jìn)行處理。這在例如少量但有記載的情況下很重要，這些情況中腫瘤生長期間具有癌干細(xì)胞特性的新細(xì)胞例如通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)而發(fā)展。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑有治療活性。相應(yīng)實(shí)施方式的ー個(gè)實(shí)例是使用治療活性的抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物作為結(jié)合試劑。治療活性的抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物優(yōu)選地能夠誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)和/或抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)，其優(yōu)選地導(dǎo)致靶標(biāo)細(xì)胞的裂解，特別是表達(dá)所述腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞的裂解。根據(jù)ー個(gè)進(jìn)ー步的實(shí)施方式，特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑起靶向分子的作用并與至少ー種治療試劑偶聯(lián)。可通過共價(jià)或非共價(jià)方式進(jìn)行偶聯(lián)。當(dāng)特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑起靶向分子作用時(shí)，其可以自身為治療活性的或其可能不是治療活性的。在其不是治療活性的情況下，其起到分子載體的基礎(chǔ)作用，將實(shí)際的治療試劑(如放射性藥物、化療試劑或毒素)帶向所需的靶標(biāo)作用ー側(cè)，即表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞。偶聯(lián)至特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑的治療試劑可為例如化療試劑或其他抗癌藥物。所述偶聯(lián)的治療試劑優(yōu)選地破壞或殺死所靶向的癌干細(xì)胞或抑制其増殖。這可直接由偶聯(lián)的治療試劑完成或間接通過誘導(dǎo)所靶向的癌干細(xì)胞和/或待治療的患者中合適的生物學(xué)機(jī)制而完成。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，腫瘤相關(guān)糖抗原選自⑶176、⑶175、⑶175s、⑶174、⑶173和CA19-9。優(yōu)選地，腫瘤相關(guān)糖抗原選自⑶176、⑶173、⑶174和⑶175或⑶175s。在上文中描述了與這些腫瘤相關(guān)糖抗原相關(guān)的細(xì)節(jié)。本發(fā)明人顯示了這些腫瘤相關(guān)糖抗原是新穎的并且是合適的癌干細(xì)胞標(biāo)記物。優(yōu)選地，腫瘤相關(guān)糖抗原為腫瘤特異性的。這具有的優(yōu)點(diǎn)是降低了非腫瘤即非癌細(xì)胞受處理所影響的風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于優(yōu)選的腫瘤特異性的細(xì)節(jié)也在上文描述；參考相應(yīng)的公開。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，癌干細(xì)胞是用至少共表達(dá)ー種干細(xì)胞標(biāo)記物的所述結(jié)合試劑進(jìn)行處理的，其優(yōu)選地為糖蛋白。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)糖抗原如特別是CD176、CD173和⑶174與其他干細(xì)胞標(biāo)記物如⑶44和⑶133共表達(dá)，已知這些標(biāo)記物為癌干細(xì)胞標(biāo)記 物。根據(jù)ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，處理表達(dá)是(糖)蛋白的至少ー種干細(xì)胞標(biāo)記物的癌干細(xì)胞，此標(biāo)記物攜帯被結(jié)合試劑特異性結(jié)合的腫瘤相關(guān)糖抗原。在特定實(shí)施方式中，結(jié)合試劑還結(jié)合攜帶腫瘤相關(guān)糖抗原的(糖)蛋白。然而，只有存在腫瘤相關(guān)糖抗原時(shí)才能發(fā)生特異性結(jié)合。本發(fā)明人已經(jīng)證明作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物的腫瘤相關(guān)糖抗原例如CD176經(jīng)常幾乎專門地?cái)y帶于已知為正常及癌干細(xì)胞的標(biāo)記物如⑶34、⑶44、⑶133、⑶164的蛋白質(zhì)上和/或攜帯于腫瘤相關(guān)(糖)蛋白。這表示正常(糖)蛋白干細(xì)胞標(biāo)記物和/或腫瘤相關(guān)(糖)蛋白在惡性轉(zhuǎn)化為癌干細(xì)胞的其糖基化過程中經(jīng)歷了特征性變化，而致使出現(xiàn)(表達(dá))本文鑒定為癌干細(xì)胞標(biāo)記物的腫瘤相關(guān)糖抗原。因此，鑒定腫瘤相關(guān)糖抗原為新型癌干細(xì)胞標(biāo)記物提供了用于處理癌干細(xì)胞的有用的治療性靶標(biāo)。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，癌干細(xì)胞表達(dá)ー種或多種選自⑶34、⑶44、⑶44v6、⑶133和⑶164的干細(xì)胞標(biāo)記物。優(yōu)選地，所述腫瘤相關(guān)糖抗原攜帶于選自⑶34、⑶44、⑶44v6、CD 133和CD 164的糖蛋白上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)⑶176、CD 175和⑶175s尤其表達(dá)于CD44和CD 133 上。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，癌干細(xì)胞源自為具有ー種或多種以下特征的癌a)其為實(shí)體瘤；b)其為白血病；c)其為多發(fā)性骨髄瘤或淋巴瘤；d)其為上皮來源的腫瘤；和/或e)其為選自肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巣癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、腦癌以及頭頸癌的腫瘤。對(duì)于此實(shí)施方式，其中癌干細(xì)胞表達(dá)作為腫瘤相關(guān)糖抗原的⑶176、⑶175或CD175s,癌干細(xì)胞優(yōu)選地為白血病或形成實(shí)體瘤的癌，即，其為除白血病和淋巴瘤之外的癌。優(yōu)選地，癌為上皮惡化，更優(yōu)選地選自肺癌、乳腺癌及肝癌。如本文實(shí)施例中提供的，⑶176表達(dá)于這些癌類型的癌干細(xì)胞上。進(jìn)ー步地，發(fā)現(xiàn)⑶176與例如⑶34在白血病上共表達(dá)。對(duì)于此實(shí)施方式，其中癌干細(xì)胞表達(dá)作為腫瘤相關(guān)糖抗原的CA19-9，所述癌干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式為形成實(shí)體瘤的癌。優(yōu)選地，所述癌為胃腸癌。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，結(jié)合試劑特異性結(jié)合所述腫瘤相關(guān)糖抗原，其為腫瘤特異性糖抗原。優(yōu)選地，在生理?xiàng)l件下及因此在治療性應(yīng)用所述結(jié)合試劑的條件下，結(jié)合試劑不結(jié)合表達(dá)于非癌細(xì)胞、非腫瘤細(xì)胞、良性癌細(xì)胞和/或良性腫瘤細(xì)胞上的抗原，尤其是糖抗原。使用相應(yīng)的腫瘤特異性結(jié)合試劑具有數(shù)種優(yōu)點(diǎn)。其確保當(dāng)用于治療吋，結(jié)合試劑只識(shí)別并因此只結(jié)合靶標(biāo)細(xì)胞以及因此的表達(dá)腫瘤特異性糖抗原的細(xì)胞而不結(jié)合非靶標(biāo)細(xì)胞，具體而言為表達(dá)幾乎相似抗原(具體而言為糖抗原)的良性或正常細(xì)胞。這確保了腫瘤、相應(yīng)的癌特異性療法，因此降低了不想要的副作用的風(fēng)險(xiǎn)。合適的腫瘤特異性結(jié)合試劑隨后描述，具體而言是在其中腫瘤特異性糖抗原為CD176或CD175的實(shí)施例中。根據(jù)ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑，起是抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物。合適的實(shí)例在上文及實(shí)施例中有描述。根據(jù)本發(fā)明的用作結(jié)合試劑的抗體或者抗體的抗原結(jié)合片段或衍生物具有ー種 或多種以下特征a)其介導(dǎo)癌和/或腫瘤細(xì)胞尤其是癌干細(xì)胞的ADCC和/或⑶C ；b)其誘導(dǎo)和/或促進(jìn)癌和/或腫瘤癌細(xì)胞尤其是癌干細(xì)胞的凋亡；c)其抑制靶標(biāo)癌和/或腫瘤細(xì)胞尤其是癌干細(xì)胞的増殖；d)其誘導(dǎo)和/或促進(jìn)癌和/或腫瘤細(xì)胞尤其是癌干細(xì)胞的細(xì)胞吞噬；和/或e)其誘導(dǎo)和/或促進(jìn)細(xì)胞毒性試劑的釋放。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方式，CD176特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物用于處理表達(dá)⑶176的癌干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述⑶176特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物包含至少ー個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其選自具有SEQ ID No. I的氨基酸序列的⑶RHl ;具有SEQ IDNo. 2或3的氨基酸序列的⑶RH2 ；以及具有SEQ ID No. 4或5或6的氨基酸序列的⑶RH3。更優(yōu)選地，其包含至少兩個(gè)⑶R，如⑶RHl和⑶RH2、⑶RHl和⑶RH3或⑶RH2和⑶RH3，每ー個(gè)具有如上文限定的氨基酸序列。最優(yōu)選地，其包含所有三個(gè)⑶R，即⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，每ー個(gè)具有如上文限定的氨基酸序列。備選地，⑶RHl具有SEQ ID NO :14-17中任何一項(xiàng)的氨基酸序列，和/或⑶RH2具有SEQ ID NO: 18-27中任何一項(xiàng)的氨基酸序列。具體而言，這些⑶R存在于⑶176特異性抗體或者其功能性活性片段或衍生物的重鏈可變區(qū)中。CD176特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物的重鏈可變區(qū)優(yōu)選地包含或由SEQ IDNo. 46-79中任何一項(xiàng)的氨基酸序列組成。進(jìn)ー步地，所述⑶176特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物的重鏈可變區(qū)優(yōu)選地包含至少ー個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，選自具有SEQID No. 7或8或9的氨基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID No. 10或11的氨基酸序列的CDRL2以及具有SEQ ID No. 12或13的氨基酸序列的⑶RL3。更優(yōu)選地，其包含至少兩個(gè)⑶R，如⑶RLl和⑶RL2、⑶RLl和⑶RL3、或⑶RL2和⑶RL3，每ー個(gè)具有如上文限定的氨基酸序列。最優(yōu)選地，其包含所有三個(gè)⑶R，即為⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，每ー個(gè)具有如上文限定的氨基酸序列。備選地，⑶RLl具有SEQID NO:28-45任何一項(xiàng)的氨基酸序列。具體而言，這些⑶R存在于⑶176特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物的輕鏈可變區(qū)中。CD176特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物的輕鏈可變區(qū)優(yōu)選地包含或由SEQ ID No. 80-94中任何一項(xiàng)的氨基酸序列構(gòu)成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，⑶176特異性抗體包含以下互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)組中的ー種
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑，用于處理表達(dá)所述腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合試劑，其中腫瘤相關(guān)糖抗原選自⑶176、⑶175、⑶175s、CD174、CD173 和 CAI9-9
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的結(jié)合試劑，其中癌干細(xì)胞具有一項(xiàng)或多項(xiàng)下列特征 a)該癌干細(xì)胞表達(dá)至少一種干細(xì)胞標(biāo)記物，其為攜帶所述腫瘤相關(guān)糖抗原的糖蛋白； b)該癌干細(xì)胞表達(dá)一種或多種干細(xì)胞標(biāo)記物，其選自⑶34、⑶44、⑶44v6、⑶133和CD164; c)所述腫瘤相關(guān)糖抗原是攜帶于該癌干細(xì)胞所表達(dá)的腫瘤相關(guān)糖蛋白上的； d)所述腫瘤相關(guān)糖抗原為腫瘤特異性的；和/或 e)所述腫瘤相關(guān)糖抗原主要或?qū)ｉT地表達(dá)于癌干細(xì)胞上而不表達(dá)于并非癌干細(xì)胞的癌細(xì)胞上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的結(jié)合試劑，其中癌干細(xì)胞來自具有一項(xiàng)或多項(xiàng)下列特征的癌 a)其為實(shí)體瘤； b)其為白血病； c)其為多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤； d)其為上皮來源的腫瘤；和/或 e)其為選自肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、子宮癌和頭頸癌的腫瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的結(jié)合試劑，其中所述結(jié)合試劑具有一項(xiàng)或多項(xiàng)以下特征 a)其為抗體或者抗體的抗原結(jié)合片段或衍生物； b)其為人、鼠、人源化或嵌合抗體或者相應(yīng)的抗原結(jié)合片段或衍生物； c)其為單鏈抗體片段、多價(jià)抗體、Fab片段和/或IgG、IgM、IgA、IgE、IgD同種型的免疫球蛋白和/或其亞型； d)其為具有一項(xiàng)或多項(xiàng)下列特征的抗體或者抗體的抗原結(jié)合片段或衍生物 i.其介導(dǎo)癌細(xì)胞的ADCC和/或⑶C； ii.其誘導(dǎo)和/或促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡； iii.其抑制癌細(xì)胞的靶標(biāo)細(xì)胞的增殖； iv.其誘導(dǎo)和/或促進(jìn)癌細(xì)胞的吞噬作用；和/或 V.其誘導(dǎo)和/或促進(jìn)細(xì)胞毒性試劑的釋放； e)其特異性結(jié)合為腫瘤特異性糖抗原的所述腫瘤相關(guān)糖抗原； f)其不結(jié)合表達(dá)于非癌細(xì)胞、非腫瘤細(xì)胞、良性癌細(xì)胞和/或良性腫瘤細(xì)胞上的抗原，尤其是糖抗原；和/或 g)其特異性結(jié)合表達(dá)于癌干細(xì)胞和正常癌細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)糖抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的結(jié)合試劑，其中所述抗體或者所述抗體的所述功能活性片段或衍生物選自 a)⑶176特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物，其優(yōu)選地具有至少一種以下特征 i)其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，優(yōu)選地至少兩個(gè)⑶R，更優(yōu)選地所有三個(gè)⑶R，選自具有SEQ ID No. I的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID No. 2或3的氨基酸序列的CDRH2以及具有SEQID No. 4或5或6的氨基酸序列的⑶RH3 ； ii)其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，優(yōu)選地至少兩個(gè)⑶R，更優(yōu)選地所有三個(gè)⑶R，選自具有SEQ ID No. 7或8或9的氨基酸序列的⑶RLl、具有SEQ ID No. 10或11的氨基酸序列的⑶RL2以及具有SEQ ID No. 12或13的氨基酸序列的⑶RL3 ； iii)其包含含有SEQID No. 46-79中任何一項(xiàng)的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)； iv)其包含含有SEQID No. 80-94中任何一項(xiàng)的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)； V)其在生理?xiàng)l件下不與 Gal a l-3GaINAc a , Gal a l_3GalNAc ^、GalNAc a、Neu5Ac a 2_3Gal3 l_3GalNAca 、Gal ^ 1 — 3 ( Neu5Ac a 2-6 ) GaINAc a 、GlcNAc P l-2Gal P l_3GalNAc a、GlcNAc a l_3Gal P l_3GaINAc a、GalNAc a l_3Gal P 和 /或3’ -O-Su-Gal ^ l-3GalNAc a特異性地相互作用； b)抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物，其顯示了與(a)中限定的抗體有交叉特異性； c)CD173特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物； d)CD174特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物； e)CD175特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物； f ) CD175s特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物；和/或 g)CA19-9特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物。
7.藥用組合物，其包含特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑，用于處理表達(dá)所述腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞，其中結(jié)合試劑、癌干細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)糖抗原具有如權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所限定的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的結(jié)合試劑或根據(jù)權(quán)利要求7的藥用組合物，用于治療的用途，以減小腫瘤大小、消除惡性細(xì)胞、防止轉(zhuǎn)移、防止復(fù)發(fā)、降低或殺死擴(kuò)散的癌、延長存活時(shí)間和/或延長腫瘤相應(yīng)的癌進(jìn)展時(shí)間。
9.一種方法，用于鑒定包含對(duì)用特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑的處理易感的癌干細(xì)胞的癌，其中所述處理影響癌干細(xì)胞，所述方法包括確定獲自患者的癌樣品是否包含表達(dá)該結(jié)合試劑特異性針對(duì)的腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞，其中癌干細(xì)胞上存在所述腫瘤相關(guān)糖抗原表示該癌對(duì)用特異性結(jié)合所述腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑的處理易感，且其中所述處理影響這些癌干細(xì)胞。
10.一種用于對(duì)癌進(jìn)行診斷、分期和/或預(yù)后和/或?qū)χ委熞赘行赃M(jìn)行監(jiān)視的方法，包括分析分離自患者的樣品中的細(xì)胞上腫瘤相關(guān)糖抗原表達(dá)的步驟，其中表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原的細(xì)胞的存在表示所述樣品中存在癌干細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中用特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑對(duì)來自所述患者的樣品進(jìn)行染色.
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任何一項(xiàng)的方法，其中腫瘤相關(guān)糖抗原選自CD176、CD175、CD175s、CD174、CD173 和 CA19-9
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)的方法，其中共表達(dá)至少一種第二種癌干細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞的存在表示存在癌干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-13中任何一項(xiàng)的方法，其中測(cè)試了至少一種另外的糖蛋白癌干細(xì)胞標(biāo)記物的共表達(dá)，所述標(biāo)記物選自⑶34、⑶44、⑶44v6、⑶133和⑶164。
15.根據(jù)權(quán)利要求9-14中任何一項(xiàng)的方法，其中對(duì)染色形式的分析提供了癌干細(xì)胞的相對(duì)分布，此分布情況預(yù)測(cè)了癌的致瘤性。
16.哺乳動(dòng)物癌干細(xì)胞的組合物，其中組合物中至少50%、優(yōu)選地至少75%的細(xì)胞為表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞。
17.—種試劑盒，用于根據(jù)權(quán)利要求9-15中任何一項(xiàng)的方法，包含特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)糖抗原的結(jié)合試劑及用于根據(jù)權(quán)利要求9-15中任何一項(xiàng)的方法的說明書。
18.就針對(duì)表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原的癌干細(xì)胞的有效性篩選候選治療試劑的方法，該方法包括 a)將所述試劑與權(quán)利要求16的細(xì)胞組合物接觸，以及 b )確定所述試劑針對(duì)所述腫瘤相關(guān)糖抗原陽性的癌細(xì)胞的有效性。
全文摘要
本發(fā)明尤其與這樣的處理方法相關(guān)，其基于特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)的糖抗原的試劑用于處理癌干細(xì)胞及相關(guān)疾病的用途。還提供了使用腫瘤相關(guān)的糖抗原作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物的診斷及預(yù)后方法。
文檔編號(hào)C07K16/30GK102753199SQ201180006592
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者S·戈勒茨, U·卡斯滕 申請(qǐng)人:葛萊高托普有限公司