專利名稱：用于疫苗的重組蛋白質(zhì)、針對(duì)所述蛋白質(zhì)的抗體及包括所述蛋白質(zhì)和抗體的診斷和治療方法
用于疫苗的重組蛋白質(zhì)、針對(duì)所述蛋白質(zhì)的抗體及包括所述蛋白質(zhì)和抗體的診斷和治療方法本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)和/或其片段和衍生物及它們作為疫苗和在生物技術(shù)方法中的應(yīng)用。所述疫苗特別包括從牛蹄炎(digital dermatitis)分離出的密螺旋體(Treponemaspp.)的免疫原性蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及針對(duì)所述蛋白質(zhì)或其片段產(chǎn)生的抗體，和所述蛋白質(zhì)在診斷方法中的應(yīng)用，其中檢測(cè)抗體作為牛蹄炎的標(biāo)志。
背景技術(shù)：
蹄炎(DD)是一種引起牛跛行的傳染性蹄病，其在集約化奶牛場(chǎng)生產(chǎn)中最為常見。該疾病最初于1974年在意大利公開。最近在瑞典公開了患有蹄炎的第一個(gè)畜群Hinstr0m和Bergsten，2005)，而以前只有零星的、非典型病例報(bào)告(Manske等，2002)。濕/臟的蹄環(huán)境和DD的發(fā)生率之間有強(qiáng)的聯(lián)系(Rodriguez-Lainz等，1996)，例如在隔間系統(tǒng)中小巷內(nèi)的糞便和尿液的堆積是一個(gè)典型的衛(wèi)生問(wèn)題。除了動(dòng)物健康問(wèn)題外，由于牛奶產(chǎn)量的減少和體重減輕導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失也與DD相關(guān)(Losinger，2006)。對(duì)DD病變抗生素治療的快速反應(yīng)強(qiáng)烈的地支持細(xì)菌為病因。已經(jīng)從DD病變中分離出來(lái)許多不同屬的細(xì)菌，如密螺旋體屬(Treponema),梭桿菌屬(Fusobacterium),Dichelobacter,普氏菌屬(Prevotella)和Prophyromonas已經(jīng)從DD病變中分離出來(lái)，經(jīng)常討論多種微生物的病因。但是，有強(qiáng)有力的旁證證明密螺旋體是DD疾病的主要病因。早在1964年從牛的表現(xiàn)為“腳腐爛”表現(xiàn)的不同變種的涂片中觀察到螺旋體(Gupta等，1964)。另一個(gè)螺旋體的早期觀察是在1988年，當(dāng)時(shí)DD在英國(guó)第一次被公開時(shí)(Blowey和Sharp，1988)。最早的來(lái)源于DD的第一個(gè)螺旋體培養(yǎng)物在1995年被報(bào)道(Walker等，1995)。在DD病變組織的組織學(xué)制備物中，發(fā)現(xiàn)密螺旋體侵入較深層表皮(Moter等，1998)。已經(jīng)被證實(shí)在感染的牛中產(chǎn)生額外的針對(duì)密螺旋體的體液免疫反應(yīng)(Walker等，1997 ；TiOtt等，2003)。在1966年公開了通過(guò)DD病變的新鮮刮擦接種使疾病成功實(shí)驗(yàn)性傳播(Read和Walker，1996)。也通過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)在接種后1_2周螺旋體侵入組織(Read等，1998)。密螺旋體的幾個(gè)種系型可以存在于相同的病變中。已經(jīng)從相同的動(dòng)物中分離出了不同的種系型(Walker等，1995 ;Evans等，2008)和通過(guò)16S rRNA基因的克隆和測(cè)序，在來(lái)源于四頭母牛的混合樣品中，確定了五種不同的種系型(Choi等，1997)。通過(guò)DD病變活檢的熒光原位雜交也已經(jīng)證明了不同種系型之間在真皮層中分布的不同(Moter等，1998)。潰蝕齒樣密螺旋體(Treponema phagedenis-like)種系型主要分布在角質(zhì)層和棘層。一些種系型也還沒(méi)有培養(yǎng)的報(bào)道。近來(lái)在一些研究中，潰蝕齒樣密螺旋體種系型已經(jīng)被確定是DD 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素(Klitgaard 等· 2008，Nordhoff 等· 2008，Yano 等· 2009)。在DD廣泛傳播的國(guó)家中，經(jīng)常使用含有抗生素的足浴。這些足浴迅速被糞便和污物污染，因此起到抗生素耐藥性細(xì)菌的高選擇性培養(yǎng)的作用。在瑞典使用四環(huán)素，但是僅用于個(gè)體動(dòng)物的局部治療，因此推薦含硫酸銅的畜牧水平足浴。至今還沒(méi)有用于DD的商業(yè)疫苗或血清學(xué)檢測(cè)。針對(duì)密螺旋體的體液應(yīng)答已經(jīng)被證實(shí)存在于患有DD的牛中，并在研究中用于全細(xì)胞裂解物ELISA調(diào)查(Demirkan等.1999，Trott等· 2003，Vink等· 2009，Walker等· 1997)。在21世紀(jì)早期的若干年，諾華公司生產(chǎn)了用于美國(guó)市場(chǎng)的全細(xì)胞裂解物DD疫苗(Tr印Shield) (Berry等.2004，Keil等.2002)。疫苗開發(fā)的技術(shù)和策略描述于i. a. Vaccine Design Innovative Approachand Novel Strategies(Caister Academic Press,2011)和 Vaccines :From Concept toClinic A Guide to the development and Clinical Testing of Vaccines for HumanUse (Informa Healthcare, 1998)。在1997年Erdile等描述了重組蛋白作為疫苗的應(yīng)用。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的在于提供有效的用于動(dòng)物皮炎，特別是反芻動(dòng)物中的蹄炎的診斷和免疫保護(hù)方法，以及用于所述目的的產(chǎn)品。本發(fā)明圍繞從牛蹄炎中分離的密螺旋體的免疫原性蛋白，更具體的是重組蛋白。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的潰蝕齒樣密螺旋體蛋白，TmpA、Ttm和PrrA,分別具有根據(jù)SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列，涉及能夠誘導(dǎo)對(duì)密螺旋體的免疫應(yīng)答的片段和衍生物，和涉及能夠結(jié)合由對(duì)象在針對(duì)所述蛋白的免疫應(yīng)答中所產(chǎn)生的抗體的片段和衍生物，其如下進(jìn)一步定義。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，密螺旋體蛋白和其片段和衍生物是重組產(chǎn)生的。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)、片段和衍生物的核酸分子。本發(fā)明還涉及所述蛋白質(zhì)、其片段和衍生物在獸藥中的應(yīng)用，特別是作為用于預(yù)防蹄炎的疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防蹄炎的獸用疫苗，其包含一或多種所述重組蛋白和/或其活性片段，和常規(guī)的和適宜的佐劑。為了得到更廣的免疫應(yīng)答，該疫苗可能進(jìn)一步包括或不包括其它的密螺旋體免疫原或不同的密螺旋體的全細(xì)胞裂解物。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種在動(dòng)物中預(yù)防蹄炎的方法，包括給有需要的動(dòng)物施用所述疫苗的步驟。根據(jù)仍然另一方面，提供一種用于檢測(cè)樣品中針對(duì)密螺旋體的抗體的存在的方法，其中所述重組蛋白和/或活性片段用于檢測(cè)樣品中針對(duì)密螺旋體的抗體的存在。根據(jù)仍然另一方面，提供一種用于診斷動(dòng)物中蹄炎的方法，其中所述重組蛋白和/或活性片段被用于檢測(cè)動(dòng)物中針對(duì)密螺旋體的抗體的存在。在所述檢測(cè)方法或診斷方法的實(shí)施方式中，所述重組蛋白和/或活性片段用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)方法中。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及針對(duì)所述免疫原性蛋白或其免疫原性衍生物或片段的抗體。這種抗體在通過(guò)被動(dòng)免疫方式治療由密螺旋體所引起的疾病中是有用的，和在例如密螺旋體的免疫磁性分離的多種實(shí)驗(yàn)室方法中也是有用的。附圖
簡(jiǎn)述圖I :重組潰蝕齒樣密螺旋體菌株Vl免疫原性蛋白TmpA、Ttm和PrrA作為抗原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。用來(lái)自患有急性蹄炎(黑條)的8只奶牛、蹄炎病史未知的2只奶牛和6-7個(gè)月大的5只小牛(灰色)的血清進(jìn)行該測(cè)定。綴合辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的兔抗牛 IgG 抗體(Sigma) (A)或單克隆 22 : 26 抗牛 IgG-HRP 抗體(Svanova Biotech AB) (B)用作二抗。在450nm下測(cè)得校正的光密度值。
定義“免疫原性劑”或“免疫原”能夠在給對(duì)象施用時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)自身的免疫應(yīng)答，任選地與佐劑組合。如在本說(shuō)明書中使用的“活性片段”或“活性衍生物”是天然免疫原性劑的片段或衍生物，其能在給對(duì)象施用時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)所述天然免疫原性劑的免疫應(yīng)答，任選地與佐劑組合?；钚云位蜓苌锇ɑ蚰M至少一種“表位”或“抗原決定簇”。在本說(shuō)明書中使用的“結(jié)合片段”或“結(jié)合衍生物”是天然免疫原性劑的片段或衍生物，其能免疫特異性結(jié)合由對(duì)象在針對(duì)所述天然免疫原性劑的免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體。結(jié)合片段或衍生物包括或模擬至少一種“表位”或“抗原決定簇”。蛋白質(zhì)的“衍生物”可以是顯示與原始蛋白具有大量序列同源性的蛋白質(zhì)。序列同源性可以是氨基酸序列中的50%或更多的相同性，如65%、80%、85%、90%、95%或99%的相同性。取代的氨基酸優(yōu)選是保守取代。取代的氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上的B和/或T細(xì)胞應(yīng)答的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可以是由連續(xù)的氨基酸或由蛋白質(zhì)三級(jí)折疊而并置的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性溶劑時(shí)被保留，然而由三級(jí)折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時(shí)丟失。在獨(dú)特的空間構(gòu)象中，一個(gè)表位通常包括至少3個(gè)氨基酸，通常更多個(gè)，至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。測(cè)定表位空間構(gòu)象的方法包括，例如，X-射線晶體學(xué)和二維核磁共振。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)。可以在顯示一種抗體阻斷另一種抗體與靶免疫原或其片段或衍生物的結(jié)合能力的簡(jiǎn)單的免疫分析中鑒定識(shí)別相同表位的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”是指完整的抗體，或其結(jié)合片段。抗體可能包括完整的抗體分子(包括多克隆、單克隆或嵌合)或包括其抗原結(jié)合片段。抗體片段包括F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv、Fe和Fd片段,和可以被并入單域抗體、單鏈抗體、大抗體、微抗體、內(nèi)抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、V-NAR 和雙-scFv (參見例如，Hollinger and Hudson, 2005, Naturebiotechnology,23，9，1126-1136)。序列表
權(quán)利要求
1.具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)，或其能夠誘導(dǎo)針對(duì)所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的片段或衍生物，或其能夠結(jié)合由對(duì)象在針對(duì)所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體的片段或衍生物。
2.權(quán)利要求I的蛋白質(zhì)、片段或衍生物，其用于獸藥中。
3.權(quán)利要求I的蛋白質(zhì)、片段或衍生物，其用于預(yù)防由密螺旋體(Treponemaspp.)引起的疾病，例如蹄炎。
4.用于治療或預(yù)防由密螺旋體引起的疾病的方法，包括給對(duì)象施用具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白或其能夠誘導(dǎo)針對(duì)所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的片段或衍生物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述由密螺旋體引起的疾病是蹄炎。
6.藥物組合物，其包含具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)或其能夠誘導(dǎo)針對(duì)所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的片段或衍生物，和任選存在的藥學(xué)上可接受的佐劑、載體和/或稀釋劑。
7.檢測(cè)樣品中針對(duì)來(lái)自密螺旋體的蛋白質(zhì)的抗體存在的方法，包括以下步驟-使所述樣品接觸具有SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)或其能夠結(jié)合由對(duì)象在針對(duì)所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體的片段或衍生物；和-檢測(cè)結(jié)合所述蛋白質(zhì)、片段或衍生物的抗體。
8.體外診斷由密螺旋體引起的疾病的方法，包括以下步驟-從對(duì)象獲取體液或組織樣品；-使所述樣品接觸具有SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)或其能夠結(jié)合由對(duì)象在針對(duì)所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體的片段或衍生物；和-檢測(cè)結(jié)合所述蛋白質(zhì)、片段或衍生物的抗體；其中結(jié)合所述蛋白質(zhì)、片段或衍生物的抗體的存在表示是由密螺旋體引起的疾病。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述疾病是蹄炎。
10.抗體或其結(jié)合片段，其特異性結(jié)合具有SEQID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)。
11.治療或預(yù)防由密螺旋體引起的疾病的方法，其包括給對(duì)象施用權(quán)利要求10的抗體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述由密螺旋體引起的疾病是蹄炎。
13.從樣品中分離密螺旋體屬細(xì)菌的方法，包括以下步驟-使所述樣品與結(jié)合至固相的權(quán)利要求10的抗體接觸；-使所述抗體結(jié)合所述密螺旋體屬細(xì)菌中的密螺旋體蛋白質(zhì)；和-從所述樣品中分離所述固相，由此從所述樣品中分離所述密螺旋體屬細(xì)菌。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述分離是免疫磁性分離。
15.編碼權(quán)利要求I的蛋白質(zhì)、片段或衍生物的核酸分子。
16.權(quán)利要求15的核酸分子，其具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5的核苷酸序列。
17.載體,其包含權(quán)利要求15或16的核酸分子以及任選存在的用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控序列。
18.轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求17的載體。
19.用于產(chǎn)生權(quán)利要求I的蛋白質(zhì)、片段或衍生物的方法，包括以下步驟-在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞；和-從所述培養(yǎng)基中分離所述蛋白質(zhì)、片段或衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)和/或其片段和衍生物及它們?cè)谝呙绾蜕锛夹g(shù)方法中的應(yīng)用。該疫苗特別包括從牛蹄炎分離出的密螺旋體的免疫原性蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及針對(duì)所述蛋白質(zhì)或其片段的抗體，和所述蛋白質(zhì)在診斷方法中的應(yīng)用，其中檢測(cè)所述抗體作為牛蹄炎的標(biāo)志。
文檔編號(hào)C07K14/20GK102918053SQ201180007747
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者A·羅桑德, M·普林格爾 申請(qǐng)人:A·羅桑德, M·普林格爾