專利名稱：D組禽輪狀病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
D組禽輪狀病毒
背景技術(shù)：
輪狀病毒屬于病毒的呼腸孤病毒科(Reoviridae)，并能影響鳥(niǎo)和其他生物體的胃腸系統(tǒng)和呼吸道。呼腸孤病毒科含有不同屬，包含正呼腸病毒(orthoreovirus)(禽和哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒)，環(huán)狀病毒(orbivirus)(藍(lán)舌病毒(Bluetongue virus))和輪狀病毒(rotavirus) (A-G 組)。輪狀病毒是非包被、雙殼RNA病毒。其基因組有11片段雙鏈RNA組成，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。6個(gè)病毒蛋白(VP)形成病毒粒子的三層二十四面蛋白衣殼。所述結(jié)構(gòu)蛋白稱為VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7[1]。VP6形成衣殼的體。這是高度抗原性并能用于鑒定輪狀病毒種類[2]。除了 VP，有6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP)，只有在被輪狀病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生。這些稱為NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6[1]。已知禽輪狀病毒(ARV) [3、4和5]，其在世界范圍內(nèi)經(jīng)常影響家禽群，并特別對(duì)雞群。受到感染的雞的癥狀是腹瀉，隨后體重增加緩慢，癥狀稱為吸收不良癥狀(MAS)或生長(zhǎng)與發(fā)育障礙癥狀(RSS)。在一個(gè)領(lǐng)域研究，檢查有RSS的8個(gè)群的6-18日齡的肉雞以檢測(cè)哪些ARV是RSS發(fā)病機(jī)理的主要原因[6]。在所述研究中，有RSS的群的34只小雞中的32只檢測(cè)到ARV。有RSS的群中鑒定了四組ARV :AVR A、D、F和G。所述研究的結(jié)果顯示D組的ARV顯示在RSS發(fā)病機(jī)理中的主要作用。RSS對(duì)小雞飼養(yǎng)者的經(jīng)濟(jì)學(xué)影響嚴(yán)重。會(huì)損失所有被感染的小雞。因此，非常需要早期檢測(cè)和預(yù)防ARV感染。目前，經(jīng)常使用RNA-PAGE對(duì)基于11個(gè)基因組RNA片段的遷移作為ARV檢測(cè)和鑒定的基礎(chǔ)。D組ARV的RNA-PAGE概況特征是5:2:2:2 [7]。所述RNA遷移的特征概況能用于鑒定D組ARV。也能用ELISA[8]、透射電鏡和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)ARV[6]。只有PAGE能區(qū)別不同ARV組，但其靈敏度低。目前，只有使用PCR方法檢測(cè)A組輪狀病毒。在優(yōu)先權(quán)日不存在D組ARV的核酸序列數(shù)據(jù)。因此迫切需要開(kāi)發(fā)檢測(cè)其他輪狀病毒的替代方法，特別是D組輪狀病毒。具體來(lái)說(shuō)，迫切需要開(kāi)發(fā)快速和靈敏檢測(cè)D組ARV的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新D組禽輪狀病毒(ARVD)的鑒定[9]并提供在獸醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域的數(shù)個(gè)機(jī)遇。本發(fā)明提供 編碼VP6多肽和片段及其變體的核酸，以及與編碼VP6多肽的核酸互補(bǔ)的核酸序列?！び缮鲜龊怂峋幋a的VP6多肽序列、和片段、變體和其抗原性片段。
·在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼VP6多肽的核酸雜交的核酸分子，包含引物和探針?！づcVP6多肽、片段、變體和/或其抗原性決定簇結(jié)合的抗體?！ぴ\斷試劑和試劑盒，所述試劑和試劑盒包含在生物樣品中鑒定ARVD有無(wú)的試劑和能用于診斷生物樣品中ARVD感染或鑒定ARVD病毒有無(wú)的方法?！ぶ委熁蚍烙鵄RVD感染的疫苗。·證實(shí)蛋，特別是用于疫苗生產(chǎn)的胚胎蛋，沒(méi)有ARVD的方法。核酸發(fā)明提供包含SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2核酸序列的核酸。發(fā)明也提供包含與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2至少i %—致的核酸序列的核酸。i值選自75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%,99. 9%。序列鑒定應(yīng)該沿核酸序列全長(zhǎng)計(jì)算。SEQ ID NO: 2提供整個(gè)ARVD VP6編碼序列。SEQ ID NO: I提供包含如SEQ ID NO2所述的VP6編碼序列片段的核酸，并還包含3’非翻譯序列的核酸。優(yōu)選地，所述核酸編碼ARVD VP6多肽。本發(fā)明的核酸可以編碼如SEQ IDN0:3或SEQ ID NO:4 所述的 ARVD VP6 多肽。發(fā)明也包含如SEQ ID N0:1和/或2所述的核酸序列片段。因此，所述發(fā)明提供包含SEQ ID N0:1和/或2的至少η個(gè)連續(xù)核酸片段的核酸，其中，η是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。核酸可以有 η+χ 核酸的總長(zhǎng)度，其中 χ=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、1 O、11、12、13、14、15、16、17、I 8、19、20、21、22、23、
24、25、30、35、40、50或更多。在一個(gè)實(shí)施方式中，η值是24。在另一實(shí)施方式中，發(fā)明提供包含SEQ ID Ν0:1或SEQ ID Ν0:2的反義互補(bǔ)序列的核酸。本發(fā)明也提供包含至少與如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:2所述核酸序列的反義互補(bǔ)序列的一致性在 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%,99. 9% 或更高的核酸序列的核酸。本發(fā)明也提供包含衍生自SEQ ID Ν0:1和/或2的反義互補(bǔ)的至少η個(gè)連續(xù)核酸片段的核酸，其中，η 是 8、9、10、11、12、1 3、14、15、16、17、I 8、19、20、21、22、23、24、
25、30、35、40、50或更多。所述核酸可以有η+χ核酸的總長(zhǎng)度，其中χ=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。在一個(gè)實(shí)施方式中，η值是10。在另一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)明提供在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含SEQ ID NO: I和/或SEQ IDNO: 2的核酸雜交的核酸。實(shí)例性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是65。C 10分鐘的O. I X SSC、0. 1% SDS’并用 2XSSC、0. 1% SDS 洗滌 10 分鐘，然后再用 O. I X SSC, O. 1% SDS 10 分鐘。本發(fā)明提供式5’-Χ-Υ-Ζ_3'表示的核酸，式中-Χ-是由X個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列；-Ζ-是由ζ個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列；-Υ-是由(a) SEQ ID NO :1或2的片段，或(b) (a)的互補(bǔ)物組成的核苷酸序列;和所述核酸5’-X-Y-Z-3'既不是(i)SEQ ID N0:1或2的片段，也不是(ii) (i)的互補(bǔ)物。例如，-X-和/或-Z-部分可包含啟動(dòng)子序列(或其互補(bǔ)物)。發(fā)明也提供包含發(fā)明的核酸和片段和也包含進(jìn)一步核酸、修飾核酸或一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記的核酸。所述核酸可以用作包含LCR、PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR、qPCR、qRT-PCR、Northern印跡和Southern印跡的方法的引物和/或探針。示例性標(biāo)記包含放射性同位素、熒光分子、生物素、堿基對(duì)錯(cuò)配、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。很多合適熒光團(tuán)已知并能使用，包括但不限于熒光素，特別是5-FAM (也稱為5-羧基熒光素；也稱為螺環(huán)(異苯并呋喃-I (3H)，9’_ (9H)毒蕈堿)-5-羧酸，3’，6’-二羥基-3-氧代-6-羧基突光素)；麗絲胺(Iissamine);藻紅蛋白；羅丹明(帕金埃爾默公司鯨魚(yú)(Cetus)) ;Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7 ；FluorX (安瑪西亞公司(Amersham))和其他標(biāo)記，如在參考文獻(xiàn)[10]中所述。整合所述標(biāo)記到核酸分子在分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述核酸包含熒光標(biāo)記和淬滅劑。合適的淬滅劑包括但不限于6-TAMRA (6-羧基四甲基羅丹明；Xanthylium, 9- (2，5- 二羧基苯基)-3，6- 二(二甲基氨基)；和DABCYL(4-((4-( 二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)。優(yōu)選用FAM(如在5’)和DABCYL(如在3’)標(biāo)記核酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，發(fā)明提供包含發(fā)明核酸的載體。例如，發(fā)明包含含有發(fā)明核酸的克隆或表達(dá)載體。發(fā)明也提供某些載體，所述載體包含發(fā)明核酸和進(jìn)一步包含其它核酸，例如編碼其它多肽的核酸，包含啟動(dòng)子或終止子序列，包含限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)等。本發(fā)明的核酸可采取各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標(biāo)記等)。在上 述任何一個(gè)實(shí)施方式中，核酸和多核苷酸可以是DNA、RNA、雜交DNA/RNA分子、和/或修飾的DNA或RNA、或PNA (肽核酸)。核酸和多核苷酸也可以包含至少一個(gè)修飾的糖和/或堿基部分，或可以包含修飾的主鏈或非天然核苷間連接。應(yīng)理解，核酸是DNA時(shí)，RNA序列中的“U”被DNA中的“T”所替代。類似地，當(dāng)核酸是RNA時(shí)，例如在ARV基因組中，應(yīng)該理解DNA序列(SEQ IDN0:1或SEQ ID N0:2)中的“T”會(huì)在RNA中用“U”替代。發(fā)明的核酸和多核苷酸也能是化學(xué)修飾，連接寡核苷酸到一個(gè)或多個(gè)部分或偶聯(lián)以增強(qiáng)活性、穩(wěn)定性或寡核苷酸的檢測(cè)。所述部分或偶聯(lián)包含上述發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)，并且還包含脂質(zhì)，例如膽固醇、膽酸、硫醚、脂族鏈、磷脂、多胺、聚乙二醇(PEG)、棕櫚基部分和其他例如在參考文獻(xiàn)11-18中所公開(kāi)。本發(fā)明核酸優(yōu)選以純化或基本純化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然產(chǎn)生的核酸)，特別是不含其它ARVD或宿主細(xì)胞核酸，通常其純度至少為約50% (重量)，通常純度至少為約90%。本發(fā)明核酸優(yōu)選為ARVD核酸。可以多種方式制備本發(fā)明的核酸，例如，完全或部分化學(xué)合成(例如DNA的亞磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化較長(zhǎng)核酸、連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)、由基因組或cDNA文庫(kù)制備等。本發(fā)明核酸可連接于固體支持物(如珠、平板、濾器、膜、玻片、微陣列支持物、樹(shù)脂等)?？捎美绶派湫曰驘晒鈽?biāo)記、或生物素標(biāo)記標(biāo)記本發(fā)明核酸。這在將核酸用于檢測(cè)技術(shù)時(shí)(例如核酸是引物或探針時(shí))特別有用。術(shù)語(yǔ)“核酸”通常包括任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，其包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體。它也包括DNA或RNA類似物，如含有經(jīng)修飾主鏈(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或經(jīng)修飾堿基的類似物。因此，本發(fā)明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重組核酸、分枝核酸、質(zhì)粒、載體、探針、引物等。本發(fā)明核酸采取RNA形式時(shí)，它可能具有或不具有5’帽。多肽
發(fā)明提供包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4氨基酸序列的多肽。發(fā)明還提供包含與SEQ ID N0:3和/或4所述多肽序列至少—致的氨基酸序列的多肽。j值能選自75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或 99. 9%。序列鑒定應(yīng)該沿氨基酸序列全長(zhǎng)計(jì)算。優(yōu)選，多肽是ARVD VP6多肽。SEQ ID NO :3對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: I編碼的多肽和SEQID NO :4對(duì)應(yīng)SEQ ID N0:2編碼的多肽。SEQ ID NO :3和4列于圖3。發(fā)明也提供包含至少一個(gè)SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4片段的多肽，其中片段包含SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4的至少w個(gè)連續(xù)氨基酸，其中w是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。多肽可以有 w+x 核酸的總長(zhǎng)度，其中 x=0、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更多。發(fā)明也提供包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入或缺失的發(fā)明多肽和片段的變體。 例如，SEQ ID NO: 3是包含I個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO:4的C末端片段的變體(圖3)。與SEQ ID N0:3或4相比，發(fā)明多肽可包含一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸取代，即用另一具有相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸取代氨基酸。遺傳編碼的氨基酸通常分為四類(I)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)極性不帶電，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起稱為芳族氨基酸。通常，這些家族中的單個(gè)氨基酸的取代不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生重要影響。相對(duì)于SEQ ID N0:3或4，所述多肽可含有一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10個(gè)等)單個(gè)氨基酸的缺失。另外，相對(duì)于SEQ ID NO: 3或4，所述多肽可包含一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)等)插入(如各1、2、3、4或5個(gè)氨基酸)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，片段能在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。所述對(duì)象是禽或哺乳動(dòng)物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述對(duì)象是家禽，例如小雞或火雞。該片段可包含至少一個(gè)T細(xì)胞表位，或優(yōu)選B細(xì)胞表位?？蓱{經(jīng)驗(yàn)確定T和B細(xì)胞表位(如利用PEPSCAN[19，20]或相似方法)，或可預(yù)測(cè)這些表位(如利用Jameson-Wolf抗原性指數(shù)[21]、基于矩陣的方法[22]、T表位(TEPI TOPE) [23]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[24]、OptiMer和 EpiMer [25，26]、ADEPT [27]、T 位點(diǎn)(Tsites) [28]、親水性[29]、抗原性指數(shù)[30]或參考文獻(xiàn)31和32中所述的方法等)。在SEQ ID NO:4中發(fā)現(xiàn)并通過(guò)參考文獻(xiàn)32所述方法鑒定的示例性表位示于表I。當(dāng)多肽能特異結(jié)合本文所述抗ARVD VP6抗體時(shí)，多肽也可以稱為抗原。本發(fā)明包含ARVD病毒抗原的多肽和編碼所述ARVD病毒抗原的多核苷酸?？梢远喾N方式制備本發(fā)明多肽，例如化學(xué)合成(全部或部分)，用蛋白酶消化較長(zhǎng)多肽，由RNA翻譯，由細(xì)胞培養(yǎng)物純化(如通過(guò)重組表達(dá))，由生物體本身制備(如細(xì)菌培養(yǎng)后，或直接從患者制備)等。產(chǎn)生長(zhǎng)度〈40個(gè)氨基酸的肽的優(yōu)選方法包括體外化學(xué)合成[33, 34] 0尤其優(yōu)選固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc [35]化學(xué)的方法。也可部分或完全利用酶合成[36]。作為化學(xué)合成的替代方式，可利用生物合成，例如，可通過(guò)翻譯產(chǎn)生多肽。這一過(guò)程可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。生物學(xué)方法通常僅限于產(chǎn)生基于L氨基酸的多肽，但可通過(guò)操作翻譯機(jī)器(如氨基?；鵷RNA分子的翻譯機(jī)器)引入D氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、疊氮基高丙氨酸等)[37]。然而，包含D氨基酸時(shí)，優(yōu)選使用化學(xué)合成。本發(fā)明多肽的C末端和/或N末端上可能有共價(jià)修飾。本發(fā)明多肽優(yōu)選以純化或基本純化，即基本不含其它多肽(如不含天然產(chǎn)生的多肽)、特別是不含其它ARVD或宿主細(xì)胞多肽的形式提供，本發(fā)明多肽的純度通常為至少約50%(重量)，通常純度至少約90%，即組成中少于約50%和更優(yōu)選少于約10%(如5%或更少)是其它表達(dá)的多肽。本發(fā)明多肽優(yōu)選為ARVD多肽。本發(fā)明多肽可連接于固體支持物。本發(fā)明多肽可包含可檢測(cè)標(biāo)記(如放射性或熒光標(biāo)記，或生物素標(biāo)記)。術(shù)語(yǔ)“多肽”指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是線形或支鏈聚合物，可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，可以被非氨基酸打斷。該術(shù)語(yǔ)也包括天然修飾或通過(guò)人工介入修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其它操作或 修飾，如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。該定義也包括，例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本領(lǐng)域已知的其它修飾。多肽可以以單鏈或結(jié)合鏈的形式產(chǎn)生。本發(fā)明多肽可以是天然或非天然糖基化的(即該多肽的糖基化模式不同于相應(yīng)天然產(chǎn)生多肽的糖基化模式)。本發(fā)明的多肽可以分離或純化。本發(fā)明提供含有序列-X-Y-或-Y-X-的多肽，其中-X-是上述氨基酸序列，-Y-不是上述序列，即本發(fā)明提供的融合蛋白。本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括在誘導(dǎo)多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞的步驟。本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化學(xué)方式合成。
檢測(cè)ARDV核酸的方法和試劑盒發(fā)明也提供檢測(cè)生物樣品中ARVD有無(wú)的試劑盒和方法。特別地，發(fā)明提供檢測(cè)發(fā)明核酸的試劑盒和方法。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，發(fā)明提供某個(gè)試劑盒，所述試劑盒包含在發(fā)明核酸中擴(kuò)增模板序列的引物，所述試劑盒包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含與所述模板序列部分基本互補(bǔ)的序列和所述第二引物包含與所述模板序列部分基本互補(bǔ)的序列，其中在所述弓I物中序列限定被擴(kuò)增的模板序列的末端。關(guān)于引物序列的“基本互補(bǔ)”是指引物對(duì)模板序列或其互補(bǔ)鏈有足夠互補(bǔ)，以退火模板序列或其互補(bǔ)鏈，在溫度45-65° C，例如45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 或 65° C，在 50mM—價(jià)陽(yáng)離子的鹽濃度中。模板序列(包含引物的互補(bǔ)部分)可以是50-1500核苷酸長(zhǎng)度。例如，模板序列可以是 50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250 或 1500 核苷酸長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方式中，模板核酸包含在如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2所示的核酸序列中。在一個(gè)實(shí)施方式中，模板核酸是如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2所示的核酸序列。發(fā)明引物也適合使用在檢測(cè)與SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2不同的模板序列。發(fā)明也提供進(jìn)一步包含與所述模板序列基本互補(bǔ)或與所述模板序列反義互補(bǔ)部分基本互補(bǔ)的探針序列。探針序列也可包含可檢測(cè)標(biāo)記。關(guān)于探針序列的“基本互補(bǔ)”是指探針對(duì)模板序列或其互補(bǔ)鏈有足夠互補(bǔ)，以退火模板序列或其互補(bǔ)鏈，在溫度45-65° C，例如 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 或 65 。 C，在50mM 一價(jià)陽(yáng)離子的鹽濃度中。引物和探針長(zhǎng)度可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50 或更
長(zhǎng)核苷酸。探針和引物可以還包含核苷酸或在5’末端、3’末端或兩端的其他修飾。進(jìn)一步核苷酸可以包含啟動(dòng)子序列、限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)或其他核酸序列。通常，探針和引物不多于100核苷酸長(zhǎng)度,如< 75核苷酸。引物和探針也可以包含一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配核苷酸，例如引入位點(diǎn)特異突變到模板序列。一個(gè)能用在發(fā)明試劑盒和方法的特定引物對(duì)包含ARVD正向序列(GCRACAACTGARACAACffG - SEQ ID NO: 24)和 ARVD 反向序列(GGAAGCAGTTGTCATCAAC - SEQ IDN0:25)。所述引物對(duì)可以與任何探針序列使用，但特別與qRT-PCR中包含6FAMTTG CATATTAGATTGTCTCGCTGGTGTATA-Dabcyl (SEQ ID NO: 26)的探針序列使用。進(jìn)一步引物序列在下面表2中給出。在一個(gè)實(shí)施方式中，引物用于下列對(duì)SEQ IDN0:27和28;SEQ ID N0:29和30;SEQ ID N0:31 和 32;SEQ ID N0:33和34;SEQ ID NO:35和36。發(fā)明也提供診斷ARVD感染或鑒定生物樣品中ARVD病毒有無(wú)的方法，包含檢測(cè)發(fā)明核酸分子有無(wú)的步驟。在特定實(shí)施方式中，所述方法涉及檢測(cè)包含如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2所示核酸的核酸有無(wú)。檢測(cè)步驟可以先于擴(kuò)增步驟，例如，使用本領(lǐng)域已知的任何核酸擴(kuò)增技術(shù)，和特別是LCR、PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR、qPCR和qRT-PCR任何合適方法可用于檢測(cè)本發(fā)明核酸的有無(wú)，包括但不限于Southern印跡,northern印跡和瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用溴化乙錠觀察核酸。本發(fā)明核酸也可以用實(shí)時(shí)分析檢測(cè)核酸(例如，“qPCR”；Taqman , Lightcycler ；Scorpion 等)。因?yàn)锳RVD有RNA基因組，在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方式中，RT-PCR用于擴(kuò)增步驟。但是，也可用如為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相當(dāng)?shù)腞NA擴(kuò)增方法(NASBA ；3SR ；TMA 等)在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，采用一步RT-實(shí)時(shí)PCR測(cè)試(“一步RT-qPCR”)。使用市售可得RT-PCR試劑盒,例如凱杰公司(Qiagen) QuantiTect 病毒試劑盒或英杰公司(Invitrogen)Super Script IllPlatinum 試劑盒?？捎帽绢I(lǐng)域已知的相應(yīng)實(shí)時(shí)循環(huán)儀軟件分析所得熒光信號(hào)。因此發(fā)明的試劑盒可以包含逆轉(zhuǎn)錄酶。上述弓I物和探針可用于發(fā)明的任何方法。上述檢測(cè)生物樣品中ARVD有無(wú)的發(fā)明方法對(duì)篩選家禽群和特別是雞群的ARVD感染特別有用。家禽的ARVD有無(wú)的篩選能用于控制或防止RSS和MAS的爆發(fā)的方法。上述發(fā)明方法可用于篩選家禽蛋的ARVD的有無(wú)。篩選蛋ARVD的有無(wú)能用于確定用于疫苗生成的蛋沒(méi)有ARVD。發(fā)明也提供確定蛋沒(méi)有ARVD的方法，包含檢測(cè)蛋中ARVD的有無(wú)。上述任何檢測(cè)發(fā)明核酸有無(wú)的方法能用于確定蛋沒(méi)有ARVD。上述方法中，蛋可以是雞蛋。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，蛋是胚胎期雞蛋并且特別是用于疫苗生產(chǎn)的胚胎期雞蛋。生產(chǎn)的疫苗可以是流感疫苗?？贵w和免疫分析在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異結(jié)合發(fā)明多肽的抗體。特別地，發(fā)明抗體特異結(jié)合包含SEQ ID N0:3和/或SEQ ID N0:4的氨基酸序列的多肽。“特異結(jié)合”指抗體結(jié)合發(fā)明多肽的基本親和性大于BSA。優(yōu)選，親和性是對(duì)發(fā)明多肽至少100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍等大于BSA。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合發(fā)明多肽的親和性以最少10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍等大于與任何其他呼腸孤病毒衍生的VP6多肽的結(jié)合親和性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體結(jié)合發(fā)明多肽的親和性以最少10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍等大于與另一個(gè)輪狀病毒衍生的VP6多肽的結(jié)合親和性。特異結(jié)合發(fā)明抗體的發(fā)明多肽稱為抗原。本領(lǐng)域已知的“抗體”包含一個(gè)或多個(gè)生物部分，通過(guò)化學(xué)或物理方式，結(jié)合感興趣多肽的表位。發(fā)明抗體包含特異結(jié)合發(fā)明VP6多肽的ARVD病毒抗原的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”包含從多克隆和單克隆制備和下列所得的抗體雜交(嵌合)抗體分子[38和39]；Fiah1 )2和F(ab)片段；Fv分子[40和41];單鏈Fv分子(sFv) [42] ;二聚和三聚抗體片 段構(gòu)建物；和任何獲自此類分子的功能片段，其中上述片段保留親本抗體分子的免疫源性結(jié)合屬性。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包含通過(guò)非常規(guī)工藝(例如噬菌體展示)獲得的抗體。如本文使用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指有均一抗體群的抗體組合物。術(shù)語(yǔ)不限于關(guān)于抗體的種類或來(lái)源，也不試圖限于生產(chǎn)方式?？贵w使用本領(lǐng)域熟知并且如在參考文獻(xiàn)43和44中公開(kāi)的技術(shù)生產(chǎn)。例如，多克隆抗體通過(guò)用感興趣抗原免疫合適動(dòng)物產(chǎn)生，例如小鼠、大鼠、兔子、山羊、小雞或綿羊。為了增強(qiáng)免疫原性，在免疫前將抗原連接到載體。這種載體為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。免疫通常通過(guò)混合或乳化鹽水中的抗原完成，優(yōu)選在例如弗氏(Freund)完全佐劑的佐劑中，并且經(jīng)胃腸道(通常皮下或肌肉內(nèi))注射混合物或乳液。動(dòng)物通常過(guò)后用一種或多種鹽水中抗原注射刺激2-6周，優(yōu)選使用弗氏完全佐劑?？贵w也可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知方法體外免疫生成。然后從免疫的動(dòng)物中獲得多克隆抗血清。單克隆抗體通常使用Kohler和Milstein的方法[45]或其修改的方法制備。通常，如上述免疫小鼠或大鼠。也可使用兔子。然而，不通過(guò)動(dòng)物取血來(lái)提取血清，除去脾(可選幾個(gè)大淋巴結(jié))并溶解成單個(gè)細(xì)胞。如果需要，脾細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞懸液篩選(去除非特異性結(jié)合細(xì)胞后)到有抗原包被的平板或孔中。表達(dá)膜結(jié)合免疫球蛋白特異抗原的B細(xì)胞，會(huì)結(jié)合到板上，并且不會(huì)被其余懸浮液洗掉。所得B細(xì)胞或所有溶解脾細(xì)胞然后引入與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤，并且在選擇性培養(yǎng)基(例如次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷(“HAT”)培養(yǎng)基)中培育。所得雜交瘤通過(guò)有限稀釋置板，并且分析生成特異結(jié)合免疫性抗原(和不結(jié)合不相關(guān)抗原)的抗體。選擇的單克隆抗體分泌雜交瘤然后在體外(如在組織培養(yǎng)瓶或空心纖維反應(yīng)器中)，或體內(nèi)(如小鼠腹水)培育。本發(fā)明也提供檢測(cè)發(fā)明多肽的試劑盒和方法。能使用任何本領(lǐng)域已知的檢測(cè)多肽的方法。所述方法包括但不限于質(zhì)譜、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、免疫化學(xué)方法、結(jié)合一配體分析、免疫組織化學(xué)技術(shù)、凝集和補(bǔ)體分析[46]。發(fā)明也提供通過(guò)檢測(cè)生物樣品中ARVD VP6抗原或抗ARVD VP6抗體的有無(wú)測(cè)定生物樣品中ARVD有無(wú)的方法，所述方法包含檢測(cè)抗ARVD VP6抗體(天然抗體或所述發(fā)明抗體)與ARVD VP6抗原的相互作用?！疤烊豢贵w”是對(duì)象獲得的生物樣品中出現(xiàn)的抗體，其中對(duì)象接觸或定位在ARVDVP6免疫反應(yīng)，造成抗ARVD VP6抗體的生成。所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物或禽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述對(duì)象是小雞。在另一實(shí)施方式中，所述對(duì)象是胚胎蛋。免疫測(cè)試的設(shè)計(jì)變化極大，其中很多形式為本領(lǐng)域已知。例如，方案可使用固體支持物或免疫沉降。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)涉及帶標(biāo)記抗體或多肽的使用；例如，所述標(biāo)記可以是酶、熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性或染料分子。放大免疫復(fù)合物信號(hào)的實(shí)驗(yàn)也是已知的；這些實(shí)驗(yàn)的例子是利用生物素和親和素的實(shí)驗(yàn)以及酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫實(shí)驗(yàn)，例如ELISA實(shí)驗(yàn)。免疫分析可以是沒(méi)有限定的不均一或均一形式以及典型或競(jìng)爭(zhēng)類型。在不均一形式中，多肽通常結(jié)合在固體基質(zhì)或支持物以幫助培育后從多肽中分離樣品。能使用的固體支持物實(shí)例是硝酸纖維素(如膜或微量滴定孔形式)，聚氯乙烯(如層或微量滴定孔)，聚苯乙烯膠乳(如珠或微量滴定板、聚偏氟乙烯、重氮化紙、尼龍膜、微芯片、高或低密度生物芯片、重組免疫分析(RIBA)、微流(microf Iuidity)設(shè)備、微磁(micromagnetic)珠、活性珠和蛋白A珠。例如，Dynatech Immunlon或Immunlon 2微量滴定板或O. 25英尺聚苯乙烯珠(精確塑料球(Precision Plastic Ball))能用在非均一形式中。包含抗原多肽的所述固 體支持物通常在分離后和檢測(cè)結(jié)合抗體前從檢測(cè)樣品洗脫。標(biāo)準(zhǔn)和競(jìng)爭(zhēng)形式都為本領(lǐng)域已 知。在均一形式中，檢測(cè)樣品與溶液中抗原結(jié)合培育。例如，這可以是在沉降任何形成的抗原-抗體復(fù)合物的情況下。分析的標(biāo)準(zhǔn)和競(jìng)爭(zhēng)形式都為本領(lǐng)域已知。在標(biāo)準(zhǔn)形式中，檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物中抗ARVD VP6抗體的量。這可以通過(guò)測(cè)定標(biāo)記抗異種(如抗雞)識(shí)別抗ARVD VP6抗體上表位的抗體是否因?yàn)閺?fù)合物形成結(jié)合來(lái)完成。在競(jìng)爭(zhēng)形式中，樣品中抗ARVD VP6抗體的量通過(guò)監(jiān)控復(fù)合物中對(duì)已知量標(biāo)記抗體(或其他競(jìng)爭(zhēng)配體)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)影響來(lái)推算。包含抗ARVD VP6抗體(或競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)形式中，競(jìng)爭(zhēng)抗體的量)形成的復(fù)合物通過(guò)任何一些取決于形式的已知技術(shù)檢測(cè)。例如，復(fù)合物中的未標(biāo)記抗ARVD VP6抗體可以使用與標(biāo)記(如酶標(biāo)記)復(fù)合的抗異種Ig結(jié)合檢測(cè)。在免疫沉降或聚集實(shí)驗(yàn)形式中,ARVD抗原和抗體之間的反應(yīng)形成從溶液或懸液沉降的網(wǎng)絡(luò)，并且形成沉降的可見(jiàn)層或膜。如果在檢測(cè)樣品中沒(méi)有抗ARVD VP6抗體，則不形成可見(jiàn)沉降。至少有三種特異類型的顆粒凝集(PA)實(shí)驗(yàn)。所述實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)支持物包被的多個(gè)抗原的抗體。所述實(shí)驗(yàn)的一種類型是使用血紅細(xì)胞(RBC)血凝素實(shí)驗(yàn)，所述細(xì)胞被RBC上被動(dòng)吸附抗原(或抗體)敏化。加入身體成分中出現(xiàn)的特定抗原抗體(如果有)造成包被純化抗原的RBC凝集。消除潛在血凝素實(shí)驗(yàn)中的非特異反應(yīng)，可用兩個(gè)人工載體在PA中替代RBC。最常見(jiàn)的是膠乳顆粒。然而，也可用明膠顆粒。使用所述載體的實(shí)驗(yàn)基于包被有純化抗原的顆粒的被動(dòng)凝集?？笰RVD VP6抗原通常以所述免疫反應(yīng)中使用的試劑盒的形式包裝。試劑盒通常在分別的容器中包含ARVD VP6抗原、對(duì)照抗體制劑(陽(yáng)性和/或陰性)、當(dāng)實(shí)驗(yàn)形式需要相同時(shí)的標(biāo)記抗體和如果標(biāo)記不直接產(chǎn)生信號(hào)時(shí)的信號(hào)生成試劑(如酶底物)。ARVD VP6抗原可以已經(jīng)結(jié)合到固體基質(zhì)或與結(jié)合到基質(zhì)的試劑分開(kāi)。操作所述實(shí)驗(yàn)的指令(如書(shū)寫(xiě)，CD-ROM等)通常包括在試劑盒中。
在發(fā)明一個(gè)替代實(shí)施方式中，生物樣品中ARVD的有無(wú)可以通過(guò)免疫組織化學(xué)的方式測(cè)定(使用在樣品中探針特異抗原的抗體)。所述分析在本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)化，其中在組織中檢測(cè)抗原稱為免疫組織化學(xué)，而在培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)通常名為免疫細(xì)胞化學(xué)。簡(jiǎn)單說(shuō)，一抗通過(guò)與其特定抗原結(jié)合檢測(cè)?？贵w-抗原復(fù)合物然后通過(guò)第二酶結(jié)合抗體結(jié)合。在所需底物和發(fā)色團(tuán)出現(xiàn)時(shí)，結(jié)合酶根據(jù)抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)的顏色沉積來(lái)檢測(cè)。存在廣泛合適樣品類型、抗原-抗體親和性、抗體類型和檢測(cè)增強(qiáng)方法。因此免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的最優(yōu)情況必須通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)每個(gè)單獨(dú)情況測(cè)定。生物樣品中ARVD有無(wú)的發(fā)明的免疫分析、免疫組織化學(xué)檢測(cè)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)篩選家禽群和特別是雞群的ARVD感染特別有用。家禽的ARVD出現(xiàn)的篩選能用于控制或防止RSS和MAS的爆發(fā)的方法。發(fā)明的免疫分析、免疫組織化學(xué)檢測(cè)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法也用于篩選家禽蛋ARVD的有無(wú)。篩選蛋ARVD的有無(wú)能用于確定用于疫苗生產(chǎn)的蛋沒(méi)有ARVD。
發(fā)明也提供確定蛋沒(méi)有ARVD的方法，包含檢測(cè)蛋中ARVD的有無(wú)。上述任何檢測(cè) 發(fā)明多肽或抗ARVD抗體的有無(wú)的方法能用于確定蛋沒(méi)有ARVD。上述方法中，蛋可以是雞蛋。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，蛋是胚胎期雞蛋并且特別是用于疫苗生產(chǎn)的胚胎期雞蛋。生產(chǎn)的疫苗可以是流感疫苗。優(yōu)選以純化或基本純化的形式提供本發(fā)明抗體。通常，抗體所在組合物中基本不含其它多肽，例如，小于90% (重量)，通常小于60%，更通常小于50%的組合物由其它多肽組成。疫苗發(fā)明也提供治療或保護(hù)ARVD感染的疫苗，并且在一個(gè)實(shí)施方式中，用于治療或防御RSS和/或MAS。發(fā)明的疫苗制劑包含含有一個(gè)或多個(gè)ARVD病毒抗原(包含ARVD VP6抗原)的發(fā)明多肽或重組或純化亞基制劑的減毒ARVD病毒。疫苗制劑還可以包含佐劑。所述發(fā)明包含含有有本文所述的VP6多肽序列的減毒ARVD病毒的組合物。所述組合物能用作預(yù)防或治療ARVD病毒的疫苗。本領(lǐng)域已知減毒病毒的方法。所述方法包含在培養(yǎng)細(xì)胞(家禽或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))中ARVD病毒的連續(xù)傳代，直到ARVD病毒顯示減毒功能。病毒生長(zhǎng)的溫度能是任何組織培養(yǎng)傳代減毒發(fā)生的溫度。細(xì)胞培養(yǎng)中一個(gè)或多個(gè)傳代后ARVD病毒的減毒功能能由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定。如本文使用，減毒指在家禽對(duì)象，特別是小雞中，ARVD病毒毒力的降低。病毒復(fù)制水平的降低或動(dòng)物模型中毒力下降可以指示減毒功能。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，ARVD通過(guò)在編碼VP6多肽的核酸序列引入突變來(lái)減毒。其他生產(chǎn)減毒ARVD病毒的方法包括在次優(yōu)選或“冷”溫度下細(xì)胞培養(yǎng)病毒的傳代和通過(guò)隨機(jī)突變(如化學(xué)突變)或點(diǎn)特異定位突變引入減毒突變到ARVD病毒基因組中。減毒RSV疫苗的制備和生成(通?？捎肁RVD病毒的方法)在例如參考文獻(xiàn)47-50中公開(kāi)。本發(fā)明包含含有分離或純化來(lái)自發(fā)明多肽的ARVD病毒抗原的組合物。特別地，本發(fā)明提供含有發(fā)明多肽或其抗原片段的疫苗組合物。所述組合物還包含一個(gè)或多個(gè)佐劑。ARVD病毒抗原能從細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)的ARVD病毒分離或純化?；蛘?，ARVD病毒抗原能通過(guò)本領(lǐng)域已知方法重組生產(chǎn)。能以多種本領(lǐng)域已知的不同表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)本發(fā)明使用的ARVD病毒抗原；例如用哺乳動(dòng)物、桿狀病毒、細(xì)菌和酵母。所述表達(dá)系統(tǒng)通常使用編碼本發(fā)明病毒抗原的多核苷酸。所述序列能使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)包含翻譯本文列出氨基酸序列得到。因此，本發(fā)明包含編碼發(fā)明病毒抗原的多核苷酸。另外，發(fā)明的病毒抗原通過(guò)合成化學(xué)方法生產(chǎn)(至少部分，優(yōu)選全部)。本發(fā)明疫苗可以通過(guò)本領(lǐng)域已知任何疫苗給藥途徑給予，包含皮下或肌肉內(nèi)注射、眼內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥或口服給藥。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明ARVD疫苗適用于口服給藥。特別地，疫苗可以通過(guò)飲用水給予家禽群。概述術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋“包括”以及“由……組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。詞匯“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。需要時(shí)，詞匯“基本上”可以忽略本發(fā)明的定義。與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”是任選的并表示例如x± 10%。兩個(gè)序列間的序列一致性百分?jǐn)?shù)表示進(jìn)行比對(duì)時(shí)所比較的兩條序列中相同單體的百分?jǐn)?shù)。利用本領(lǐng)域所知軟件程序，例如參考文獻(xiàn)51的7. 7. 18部分所描述的軟件程序，可進(jìn)行比對(duì)并確定同源性或序列一致性百分?jǐn)?shù)。氨基酸或核酸序列之間的一致性優(yōu)選通過(guò)Smith Waterman同源性搜索算法測(cè)定[52]，利用仿射缺口搜索，其中默認(rèn)參數(shù)為缺口開(kāi)放罰分=12、缺口延伸罰分=1。能使用BL0SUM62評(píng)分基質(zhì)。如上文所述，本發(fā)明核酸和多肽可包含序列(a)與 SEQ ID NO: 1-4 序列一致(即 100%—致)；(b)共有與 SEQ ID NO: 1-4 序列一致；(c)與(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)單核苷酸或氨基 酸改變(缺失、插入、取代)的序列，這些改變可以位于不同位置或連續(xù)出現(xiàn)；和(d)用逐對(duì)比對(duì)算法與SEQ ID NO: 1-4的特定序列比對(duì)時(shí)，移動(dòng)的x單體(氨基酸或核苷酸)窗口從起點(diǎn)(N末端或5’)向終點(diǎn)(C末端或3’)移動(dòng)，以便在p(p>x)個(gè)單體上比對(duì)p-x+1個(gè)這種窗口，各窗口具有至少X · y個(gè)相同比對(duì)單體，其中χ選自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 選自 O. 50,0. 60,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90、
O.91,0. 92,0. 93,0. 94,0. 95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 ;并且如果 x · y 不是整數(shù)，則四舍五入至整數(shù)。優(yōu)選的逐對(duì)比對(duì)算法是Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法[53],使用默認(rèn)參數(shù)(如缺口開(kāi)放罰分=10. 0，缺口延伸罰分=0. 5，使用EBL0SUM62積分矩陣)。用EMBOSS軟件包中的needle工具能方便地實(shí)施這種算法[54]。本發(fā)明核酸和多肽還可在序列(a)-(d)的N末端/5’ 一側(cè)和/或C末端/3’ 一側(cè)包含其它序列。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將采用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法，這些方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。見(jiàn)例如文獻(xiàn)55-62等。附圖
簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I:在系列稀釋(2倍)和陰性對(duì)照(水)中ARVD陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增圖。圖 2 :SEQ ID NO: I 和 SEQ ID NO: 2 的 Clustalff 比對(duì)。
圖 3 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 的 Clustalff 比對(duì)。
具體實(shí)施例方式材料和方法腸含量的樣品腸含量從10日齡矮化雞中收集。通過(guò)小雞的腸含量中PAGE確定ARVD的多個(gè)顆粒。樣品制備、病毒dsRNA的分離和PAGE在參考文獻(xiàn)6中描述。凱杰QIAamp病毒RNA迷你試劑盒，VP6基因組片段的凝膠提取病毒dsRNA的擴(kuò)增和克隆(從參考文獻(xiàn)63所述方法中修改) 寡核苷酸連接10μ I dsRNA、2，5μ I 引物 PC3 100 μ MU μ I RNAse 抑制劑、2· 5 μ IBSA,2. 5 μ I ATP 10πιΜ、4μ1 RNA 連接酶、2. 75 μ I 緩沖液和 2. 5 μ IPEG 4000 在 17。C 培育24小時(shí)。連接的dsRNA在TE緩沖液中稀釋到100 μ I和如生產(chǎn)商所述通過(guò)Eppendorf凝膠提取柱純化。對(duì)14 1寡聚!17稀釋液，加入1()(^1和1.54 1 DMS0，并且在99° C熱循環(huán)儀中培育2分鐘并用冰冷卻。這個(gè)步驟后立即加入下列試劑2 μ I水、I μ I Ribolock、I. 5 μ ITRIS ρΗ8· 3 1Μ、6μ I MgCL2 50mM、2. I μ I KCl 1Μ、6μ I dNTPs 2. 5mM、0. 35 μ I AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)在42° C培育45分鐘，然后在50° C培育15分鐘。加入I μ I EDTA IM終止反應(yīng)。殘留RNA通過(guò)加入3. 4 μ I NaOH IM和65° C培育30分鐘除去。加入4·3μ1 Tris(pH7. 5，1Μ)和 4· 3μ I HCl(IM)后在 65。C I 小時(shí)完成 cDNA退火。5μ1 cDNA反應(yīng)加入到包含5 μ I Ex Taq緩沖液、4μ I dNTPs 2. 5mM、I μ 1PC2引物100 μ MU μ I Ex Taq的50 μ I PCR反應(yīng)中。在72° C預(yù)培育5分鐘，填充cDNA的部分懸垂。這隨后用94° C培育2分鐘，和94° C 30秒的30次循環(huán)，67° C 30秒和72° C 5分鐘。PCR擴(kuò)增子的質(zhì)量和數(shù)量通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物通過(guò)T/A克隆方法克隆并測(cè)序。qRT-PCR對(duì)1-4μ1 dsRNA (用凱杰QIAamp病毒RNA迷你試劑盒提取)，加入3μ I的每個(gè) 10 μ M 引物(ARVD 正向引物 GCRACAACTGARACAACffG (SEQID NO: 24)和 ARVD 反向引物GGAAGCAGTTGTCATCAAC (SEQ ID NO:25))并且 99。C 變性 10 分鐘。PCR 管在冰上冷卻，并且加入主混物(10 μ IEppendorf RealMasterMix RT 探針 2· 5χ, O. 5 μ I ARDV 10 μ M 探針(6FAM-TTGCATATTAGATTGTCTCGCTGGTGTATA-Dabcyl(SEQ ID NO:26)), 0. 25 μ I realMasterRT酶，0· 25 μ I RNase抑制劑溶液)和PCR級(jí)水到總共25 μ I。在司查塔基(Stratagene)Μχ3000Ρ實(shí)時(shí)PCR機(jī)器上，逆轉(zhuǎn)錄在50° C 30分鐘完成，接著95° C 2分鐘起始變性和45次95° C 10秒變性的兩步循環(huán)，和60° C 30秒退火/擴(kuò)增。結(jié)果qRT-PCR的結(jié)果見(jiàn)圖I所示。擴(kuò)增片段的序列示于SEQ ID NO: I完整ARVD VP6核酸序列示于SEQ ID N0:2。編碼多肽序列示于SEQ IDN0:4。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)可對(duì)之進(jìn)行修改。表I:預(yù)測(cè)表位"SEQj開(kāi)始位置j結(jié)束位置j隻基酸序列戕長(zhǎng)度
ID No._____
5— 4 〗2 Tssialtvr 9 —.....6..................................— .24...............................................................................—.....33..............................................................................—.....Y'SKVSDVIQQ.......................................................................................................................................................................................................................................................................................10.....................................................................
7— 3743MVRVLNG7
8— ...6278DLPQLGTTLLNIDANYV~ 17
9一 88 — 103LTEFVIAVCETELLVD16
"To Ti! Π9 PQsimill9
11— 121128IiiKYVFLNj ~
12— 137144E WH Y RL SA8
13— 150162SNHVPYTFPYDMA13
14— 164■■174AYDRVTAAYDNI I —
15—183195LNNAIH FAAF DQ D—13
16207235 FEYLYNLRTPVSNATIVIHPISILSV 29____PSM__
17— 241247ATHYWPY
18— 260275R'/EFQIAGQV-1YVAAN16Ii290 pqfdavn11 io
20 — 292306Tmrrlflladlqm I 115
.....21.......................—.....314.......................... 328....................................................THQ AVISTKIE VLN A...................................................................................................—15...................................
22 — 333 347 TVPSIDEHLYALIVG 15.....23....................................................................355.....................................................................................................362............................................................................................................QAG'pvt'PF............................................................................................................................................................................................................................................................................................................8....................................................................................

表2:引物序列

SEQ ID IElqJSEQ ID 反向
NO:___NO:__
27TTAGAAACCAAGCTGCCACA28TGCAAATCAGCTAGCAATGG
29rGCCmTGCTAG^GP^TTG30'ACGCM^CmGmGAAmh
3 Il\ACCAAGCTGCCAC^CACTA__32__TGCAAATCAGCTAGCAATGG_
33__AAACCAAGCTGCCACACACT__34__AAACCAAGCTGCCACACACT_
35AfTTGAGgACGCCAGfGfCT36ATTTGAGGACGCCAGTGTCT參考文獻(xiàn)I. Pesavento JBj Crawford SE，Estes MKj Prasad BV (2006). Curr. Top.Microbiol. Immunol. 309:189-2192. Bishop RF (1996). Arch. Virol.增刊 12:119-283. Songserm Tj Pol JMj van Roozelaar D，Kok GLj Wagenaar F，ter HuurneAA.(2000) Avian Dis. 44(3) :556-674. Page RKj Fletcher OJj Rowland GNj Gaudry Dj Villegas P. (1982)AvianDis. 26(3) :618-245. Bellinzoni R，Mattion Nj Vallejos Lj La Torre JLj Scodeller EA. (1987)ResVet Sci. 43(1):130-16. Otto P, Liebler-Tenorio EM, Elschner M, Reetz J, Lohren U, DillerR.(2006)Avian Dis. 50(3) :411-87. M. S. McNulty, G. M. Allan, D. Todd, J. B. McFerran 和 R. M. McCracken (1981). JGen Virol. 55:405-4138. Boards, G. M.等· Journal of Clinical Microbiology, 19:248-254(1984)。9. Trojnar E, Otto P, Roth B, Reetz J 和 Johne R. (2010) J. Virol84(19):10254-10265。10. Kricka, Nonisotopic DNA Probe Techniques(非同位素 DNA 探針技術(shù))，1992，加利福尼亞州圣地亞哥市學(xué)術(shù)出版社
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1.ー種核酸,所述核酸包含 (a)與如SEQID NO: I或SEQ ID NO: 2所示核酸序列至少90%—致性的核酸序列； (b)與如SEQID NO: I或SEQ ID NO: 2所示核酸序列的反義互補(bǔ)序列至少90%—致性的核酸序列； (c)包含SEQID NO: I和/或2中至少24個(gè)連續(xù)核苷酸的如SEQ ID NO: I和/或2所示核酸序列的片段； (d)包含SEQID NO: I和/或2反義互補(bǔ)序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的如SEQ ID NO: I和/或2所示核酸序列的反義互補(bǔ)序列的片段；或 (e)與如SEQID NO: I或SEQ ID NO: 2所示核酸序列在高度嚴(yán)謹(jǐn)情況下雜交的核酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的核酸，其特征在于，所述核酸還包含可檢測(cè)標(biāo)記。
3.ー種試劑盒，所述試劑盒包含用于擴(kuò)增權(quán)利要求I所述ARVD病毒核酸內(nèi)模板序列的引物，所述試劑盒包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含與所述模板序列某部分基本互補(bǔ)的序列且所述第二引物包含與所述模板序列某部分基本互補(bǔ)的序列，所述弓I物中具有上述基本互補(bǔ)性的序列定義被擴(kuò)增的模板序列末端。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含與所述模板序列某部分基本互補(bǔ)或與所述模板序列的反義互補(bǔ)序列某部分基本互補(bǔ)的探針序列。
5.如權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述模板序列包含在如SEQID NO: I或SEQ ID NO:2所示的核酸序列中。
6.一種診斷ARVD感染或鑒定生物樣品中ARVD病毒有無(wú)的方法，所述方法包含檢測(cè)如權(quán)利要求I所述核酸分子有無(wú)的步驟。
7.—種多肽,所述多肽包含 (a)與如SEQID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少90%—致性的氨基酸序列；或 (b)包含從SEQID NO: 3和/或4中衍生至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的如SEQ IDNO: 3和/或4所示的氨基酸序列片段。
8.ー種抗體，所述抗體特異結(jié)合如權(quán)利要求7所述的多肽和/或其抗原片段。
9.如權(quán)利要求8所述的抗體,其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
10.如權(quán)利要求8所述的抗體，其特征在于，所述抗體是禽抗體。
11.一種檢測(cè)生物樣品中ARVD抗原有無(wú)的免疫分析，所述免疫分析包含將所述樣品與權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)所述抗體接觸的步驟。
12.如權(quán)利要求6所述的方法或如權(quán)利要求11所述的免疫分析，其特征在于，所述生物樣品是蛋。
13.—種包含如權(quán)利要求7所述多肽的治療或防御ARVD的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及新鑒定的禽輪狀病毒D VP6核酸序列和其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/14GK102858369SQ201180012025
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者B·羅斯 申請(qǐng)人:諾華有限公司