專利名稱：新型變應(yīng)原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變態(tài)反應(yīng)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及從哺乳動(dòng)物中鑒定新型變應(yīng)原，以及涉及哺乳動(dòng)物變態(tài)反應(yīng)的診斷和治療。
背景技術(shù)：
約有20%工業(yè)化社會(huì)的群體，對(duì)暴露于各種環(huán)境來(lái)源的抗原超敏感(變應(yīng)性的)。這些抗原誘導(dǎo)即時(shí)和/或延遲型超敏反應(yīng)，因此被稱為變應(yīng)原(Breiteneder et al.1997)。這些抗原包括草、樹(shù)、雜草的產(chǎn)物、動(dòng)物皮屑、昆蟲(chóng)、食品、藥物和化學(xué)品。與特異性變態(tài)反應(yīng)有關(guān)的抗體主要屬于免疫球蛋白E同種型(IgE)。IgE通過(guò)特異性高親和性受體Fe ε RI結(jié)合嗜堿性粒細(xì)胞肥大細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。在暴露于變應(yīng)原后，細(xì)胞表面上的變應(yīng)原特異性IgE抗體交叉連接，從而使得諸如組胺和白三烯等炎性介質(zhì)釋放，導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的生理表現(xiàn)(Akdis 2006)。變態(tài)反應(yīng)的診斷測(cè)試涉及檢測(cè)患者中對(duì)變應(yīng)原來(lái)源的蛋白具有特異性的患者IgE抗體。通常，這些測(cè)試中使用變應(yīng)原來(lái)源的水性提取物，其含有多種蛋白的混合物。對(duì)于大部分變應(yīng)原來(lái)源而言，僅部分鑒定和表征了存在于粗提取物中的變應(yīng)原性蛋白。檢測(cè)患者中特異性IgE抗體的診斷測(cè)試程序，可以通過(guò)使用來(lái)自患者血清的體外免疫測(cè)定，或是通過(guò)在患者的皮膚上局部應(yīng)用具體提取物而進(jìn)行的皮膚點(diǎn)刺測(cè)試(skin prick test, SPT)(ffainstein et al.2007)。近年來(lái)，已經(jīng)鑒定并表征了變應(yīng)原性提取物中的許多重要的變應(yīng)原性蛋白。這使得已經(jīng)能定量這些個(gè)體變應(yīng)原性組分中每一組分的特異性IgE抗體，這經(jīng)常稱為組分解析診斷學(xué)(CRD) (Valenta et al.1999) (Hiller et al.2002)，其在許多病例中能夠改善超敏反應(yīng)的診斷(Stumvoll et al.2003)。已經(jīng)提議利用CRD輔助選擇最佳免疫治療(Valentaet al.2007) 此外 ，通過(guò)用組分來(lái)加強(qiáng)(spike)提取物，從而在一些病例中可以用個(gè)體變應(yīng)原來(lái)增強(qiáng)提取物的診斷靈敏性?？傊b定和表征每個(gè)變應(yīng)原來(lái)源中所有重要的變應(yīng)原性蛋白非常重要。除了例如通過(guò)抗組胺降低變態(tài)反應(yīng)的癥狀之外，可以用具體免疫療法進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)的長(zhǎng)期且治愈性治療。應(yīng)用引起疾病的變應(yīng)原性提取物，最常見(jiàn)的是皮下或舌下，可以引起特異性激活針對(duì)變應(yīng)原性蛋白的保護(hù)性免疫應(yīng)答。盡管并不完全了解提取物機(jī)制，但是免疫系統(tǒng)的這種特異性激活，減輕了隨后相同變應(yīng)原環(huán)境暴露后的變態(tài)反應(yīng)癥狀(Akdiset al.2007) 0常規(guī)免疫療法的進(jìn)一步發(fā)展，是使用一種或數(shù)種純化的變應(yīng)原性蛋白，而不是粗天然提取物。這類免疫療法已經(jīng)成功地用于草花粉變應(yīng)性患者(Jutel et al.2005),并且已經(jīng)提議將其用于治療針對(duì)動(dòng)物皮屑的變態(tài)反應(yīng)(Gronlund et al.2009)。馬皮屑是日益漸增的常見(jiàn)呼吸變態(tài)反應(yīng)原因(Liccardi et al.2011)，其癥狀包括鼻炎、結(jié)膜炎、支氣管發(fā)炎以及哮喘。對(duì)馬變應(yīng)原的職業(yè)暴露是變應(yīng)性敏化作用的重要風(fēng)險(xiǎn)因素(Tutluoglu et al.2002)，但是也可以在其他地方，如學(xué)校，檢測(cè)到相當(dāng)濃度的變應(yīng)原(Kim et al.2005) 0在一項(xiàng)研究中證明，IgE對(duì)馬皮屑的敏化作用與發(fā)展哮喘的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(Ronmark et al.2003)。馬毛發(fā)和皮屑的提取物含有復(fù)雜的變應(yīng)原性蛋白，且目前已經(jīng)鑒定了 4種馬變應(yīng)原:Equ c UEqu c 2、Equ c 3以及Equ c 4/5。前兩種都是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白蛋白家族的成員，并且已經(jīng)從其天然來(lái)源純化到它們(Dandeu et al.1993;Goubran Botros et al.1998),盡管僅Equ c I被表達(dá)為重組蛋白(Gregoire et al.1996) Equ c I的氨基酸序列與貓變應(yīng)原Fel d 4的氨基酸序列的相似性為67%(Smith et al.2004)。Equ c 3即馬血清白蛋白，是相對(duì)保守的蛋白，其表現(xiàn)出與其他哺乳動(dòng)物白蛋白的廣泛交叉反應(yīng)性(Goubran Botroset al.1996)。Equ c 4/5首先作為馬皮屑中的IgE結(jié)合蛋白而得到純化和報(bào)道(GoubranBotros et al.1998; Goubran Botros et al.2001),并且僅在后來(lái)被確定為馬汗 Iatherin(McDonald et al.2009)。Equ c I被認(rèn)為是已知的馬變應(yīng)原中最重要的一個(gè)(Dandeu et al.1993)，并且重組蛋白的IgE抗體識(shí)別存在于76%的所研究的馬變應(yīng)性個(gè)體群體中(Saarelainen etal.2008) 0在利用純化的天然變應(yīng)原的另一項(xiàng)研究中，僅33%的馬變應(yīng)性患者對(duì)Equ c 2敏感，而23%的患者對(duì)Equ c 4/5敏感(Goubran Botros et al.1998)。IgE結(jié)合馬血清白蛋白的頻率表述于幾項(xiàng)研究中，其證明了在高達(dá)40%馬變應(yīng)性個(gè)體中的反應(yīng)性(Spitzaueret al.1993； Cabanas etal.2000) 0然而，因?yàn)閷?duì)血清白蛋白的敏化作用經(jīng)常伴隨著抗其他變應(yīng)原組分的高濃度IgE抗體，因此其具體臨床相關(guān)性是不確定的。對(duì)盡管馬皮屑變應(yīng)原Equ c UEqu c 2,Equ c 3以及Equ c 4/5的了解已有很長(zhǎng)時(shí)間，但是并未定量 評(píng)估每種組分對(duì)針對(duì)馬皮屑的總IgE應(yīng)答的貢獻(xiàn)。發(fā)明概述如上文所述，充分設(shè)計(jì)的用于具體IgE抗體的實(shí)驗(yàn)室免疫測(cè)定，能夠利用天然馬皮屑提取物，檢測(cè)大多數(shù)對(duì)馬的敏化病例。然而，在小型化或者非實(shí)驗(yàn)室免疫測(cè)定中，如變應(yīng)原微陣列或醫(yī)生辦公室測(cè)試，較不利的測(cè)定條件、較低的抗體結(jié)合變應(yīng)原試劑的能力以及效力有效的天然變應(yīng)原提取物的組合，使得診斷的靈敏性不足。對(duì)于其他動(dòng)物上皮的特異性IgE的免疫測(cè)定，存在相似的情形。因此，在一些情況下需要使用純變應(yīng)原性蛋白來(lái)在動(dòng)物上皮的特異性IgE抗體的診斷測(cè)試中實(shí)現(xiàn)足夠的靈敏性。這類變應(yīng)原不僅可以用作在常規(guī)診斷測(cè)試中增加靈敏性的試劑，也可以用于不同類型的組分解析診斷應(yīng)用中(Valenta et al.1999) (Hiller et al.2002)。具有改善的非過(guò)敏特性的純變應(yīng)原性蛋白或其變動(dòng)或變體，也可以在免疫療法中用作新試劑(Valenta etal.1999) (Cromwell et al.2006)(Saarne et al.2005);(Jutel et al.2005);(Cromwellet al.2006)。對(duì)所有已知的馬變應(yīng)原組分的純化和分析，鑒定了一些患者的血清，其具有比全部個(gè)體馬變應(yīng)原組分共同引起的IgE應(yīng)答明顯更高的針對(duì)馬皮屑提取物的IgE應(yīng)答。據(jù)發(fā)現(xiàn)，這些血清對(duì)以前未知的馬變應(yīng)原組分具有IgE結(jié)合反應(yīng)性。在上文所述的血清的幫助下，可以從馬皮屑純化新的主要變應(yīng)原，并將其鑒定為分泌球蛋白(secretoglobin)蛋白家族的成員。新的馬蛋白，本文稱之為Equ c 15k,由通過(guò)二硫鍵而連接在一起的一個(gè)5kDa氨基酸鏈和一個(gè)IOkDa的氨基酸鏈組成?？紤]到兩條多肽鏈由不同的基因編碼這一事實(shí)，本研究證明了異二聚體蛋白的存在，該異二聚體蛋白以前并未被馬基因組的生物信息學(xué)研究預(yù)料到。其在所有方面都不同于以前已知的馬變應(yīng)原。該變應(yīng)原代表了對(duì)已知的馬變應(yīng)原組的重要增加，并且必將可用于馬變態(tài)反應(yīng)的診斷中?！矫?本發(fā)明涉及分離的馬變應(yīng)原，Equ c 15k,其屬于分泌球蛋白家族,在非還原條件下，其表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)于約15kDa的電泳遷移率(表觀分子量)，并且包含分子量為約5kDa的第一肽鏈和分子量為約IOkDa的第二肽鏈，兩者通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵而連接在一起。本發(fā)明的這一方面還包括Equ c 15k的與其共享抗體表位的變體和片段，從而使得變體和片段與這類抗體的交叉反應(yīng)性為至少約50%。這類變體和片段包括例如來(lái)自同一物種的相關(guān)變應(yīng)原。在下文所述的本發(fā)明的其他方面，出于簡(jiǎn)化，還用術(shù)語(yǔ)“Equc 15k”包括其這類變體和片段。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的編碼本發(fā)明第一方面提到的變應(yīng)原的核酸，以及含有所述核酸分子的載體，并且涉及含有所述載體的宿主細(xì)胞。含有這種載體的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的重組蛋白或肽，可以是糖基化的或不是他糖基化的，這取決于所用的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及Equ c 15k在制備用于診斷I型變態(tài)反應(yīng)的組合物中的用途。在另一方面,本發(fā)明涉及經(jīng)Equ c 15k “加強(qiáng)(spike) ”的變應(yīng)原組合物。這類變應(yīng)原組合物可以是不具有或具有低Equ c 15k含量的變應(yīng)原提取物或純化的或重組變應(yīng)原組分混合物，其中添加Equ c 15k的目的是，結(jié)合患者的IgE，患者的IgE與組合物中的其他變應(yīng)原組分可能不結(jié)合或不充分地結(jié)合。本發(fā)明的這一方面還涉及產(chǎn)生這種組合物的方法，所述方法包括如下步驟:將Equ c 15k添加于變應(yīng)原組合物如變應(yīng)原提取物(任選地用其他組分加強(qiáng))或純化的天然或重組變應(yīng)原組分的混合物中。在另一方面，本發(fā)明涉及診斷患者的I型變態(tài)反應(yīng)的體外診斷方法，其中使來(lái)自患者的體液樣品，如血液或血清樣品，與Equ c 15k或前述方面中的組合物接觸，由此，可以確定患者樣品是否含有特異性結(jié)`合Equ c 15k的IgE抗體。這種診斷方法也可以以本領(lǐng)域已知的任何方式進(jìn)行?？梢詫quc 15k例如固定于固體支持體上，如在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室免疫測(cè)定中，在微陣列中或在側(cè)流測(cè)定(lateral flow assay)中，或用作流體相試劑。在另一方面，本發(fā)明涉及用于進(jìn)行前述方面的方法的診斷試劑盒。在上述各方面，野生型Equ c 15k分子，如上文所述，可以被下文所定義的與野生型蛋白共享抗體表位的Equ c 15k的片段或變體替換。本發(fā)明還涉及治療I型變態(tài)反應(yīng)的方法,包括向易感于這種治療的患者施用Equc 15k或如下文所述的經(jīng)修飾的Equ c 15k。本發(fā)明的這一方面還涉及Equ c 15k在這類免疫療法中的用途，包括例如組分解析免疫療法(Valentaet al.2007)。在這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，Equ c 15k可以以其天然形式或以表現(xiàn)出與天然分子相似的生物化學(xué)和免疫學(xué)特性的重組形式使用。在另一實(shí)施方案中，Equ c 15k可以以修飾的形式使用、以化學(xué)方式或基因方式產(chǎn)生，以便消除或減弱其IgE抗體結(jié)合能力，同時(shí)優(yōu)選地能在治療的個(gè)體中引發(fā)IgG應(yīng)答。修飾的實(shí)例包括但不限于分子的片段化、截短、串聯(lián)或聚積，內(nèi)部片段的缺失，氨基酸殘基的取代，結(jié)構(gòu)域重排或由于二硫鍵或其與另一大分子結(jié)構(gòu)或其他低分子化合物結(jié)合的破壞而至少部分地破壞三級(jí)結(jié)構(gòu)。在這一方面的另一實(shí)施方案中，Equ c 15k的個(gè)體IOkDa和/或5kDa亞基，與完整分子相比，表現(xiàn)出降低的IgE結(jié)合活性，用其作為修飾的Equc 15k0
在所有上述本發(fā)明的方面中，Equ c 15k蛋白可以從其天然來(lái)源純化，如從馬的尿、唾液或其他體液中，或從馬的組織如毛發(fā)或皮屑中。如上文所述，其也可以通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成。本發(fā)明還涉及Equ c 15k在I型變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防性治療或治療性治療以及診斷中的用途。定義本文所述的變應(yīng)原性馬蛋白即Equ c 15k屬于分泌球蛋白蛋白家族,具體而言是包含由兩個(gè)異二聚體亞基形成的四聚體蛋白的一個(gè)亞家族。異二聚體由通過(guò)二硫鍵連接在一起的來(lái)源于不同基因的兩條鏈構(gòu)成(Klug et al.2000)。本文所述的馬分泌球蛋白是15kDa的異二聚體，本文稱之為Equ cl5k，其分別由5±2kDa和10±2kDa的亞基組成，出于本發(fā)明的目的，這兩個(gè)亞基分別稱為5和IOkDa亞基。分子量賦值是根據(jù)在下文實(shí)施例4所述的SDS-PAGE中所觀 察到的其表觀分子量。應(yīng)當(dāng)理解到，表觀分子量可以變化，這取決于分離條件，包括所用電泳分離介質(zhì)和其濃度，所用的線性或梯度緩沖液等。此外，IOkDa亞基含有N-糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)被聚糖結(jié)構(gòu)占據(jù)，可以影響表觀分子量。5kDa鏈的氨基酸序列具有預(yù)測(cè)的氨基酸序列ATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEISAGDRYIITETLGKIVLQCGA(SEQ ID NO: 4)，且其理論分子量為 7.5kDa。IOkDa鏈的氨基酸序列具有預(yù)測(cè)的氨基酸序列GSGCQLLEDVVEKT ITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF (SEQ ID NO:5)且其理論分子量為8.4kDa。應(yīng)當(dāng)指出，結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白在多種哺乳動(dòng)物種類中已有描述，但是只有一種蛋白被鑒定為變應(yīng)原，即主要貓變應(yīng)原Fel d KAcc no P30438和P30440)。Equ c 15k的變體和片段應(yīng)當(dāng)理解為表示長(zhǎng)度為為異二聚體中每條鏈的至少10氨基酸、更優(yōu)選至少40個(gè)、甚至更優(yōu)選至少50或60個(gè)氨基酸殘基且與所述Equ c 15k的序列同一性為至少50%、優(yōu)選超過(guò)60%、70%、80%、90%或95%的蛋白或肽。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，修飾的Equ c 15k應(yīng)當(dāng)理解為表示已經(jīng)經(jīng)過(guò)化學(xué)或基因修飾從而改變其免疫特性的Equ c 15k變體，如有關(guān)本發(fā)明的免疫療法方面，上文所實(shí)例的變體。與Equ c 15k共享抗體表位的Equ c 15k的變體和片段，應(yīng)當(dāng)理解為這樣的片段和變體，其與來(lái)自代表性Equ c 15k敏化患者血清樣品的抗體如IgE或IgG抗體的結(jié)合可以被Equ c 15k顯著抑制。這一抑制測(cè)定可以根據(jù)(Mattsson et al.2009)(其公開(kāi)的內(nèi)容在此通過(guò)援引并入)所述的方法來(lái)進(jìn)行。低變應(yīng)原性的修飾的Equ c 15k或Equ c 15k的變體或片段應(yīng)當(dāng)理解為這樣的修飾的Equ c 15k或Equ c 15k的變體或片段，其不能結(jié)合來(lái)自代表性Equ c 15k敏化患者血清樣品的Equ c 15k反應(yīng)性IgE抗體，如根據(jù)下文實(shí)施例7的方案所確定的，或其沒(méi)有表現(xiàn)出生物學(xué)變應(yīng)原活性或表現(xiàn)出顯著降低的生物學(xué)變應(yīng)原活性，如通過(guò)細(xì)胞激活測(cè)定如嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放測(cè)定所確定的(Demoly et al.2003;Ebo et al.2004)。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A表示通過(guò)尺寸排阻層析(SEC)分級(jí)馬皮屑蛋白。用于隨后純化步驟的峰A和B用箭頭表不。
圖1B通過(guò)疏水相互作用層析純化nEqu c I。峰C和D用于隨后的純化步驟。圖1C表示通過(guò)疏水相互作用層析純化nEqu c 2和Equ c 4/5。峰E、F和G用于隨后的純化步驟。圖1D表示通過(guò)陰離子交換層析純化nEqu c 2。峰H和I用于隨后的分析。圖1E表示純化的蛋白Equ c I形式A和B、Equ c 2以及Equ c 4/5形式14kDa和19kDa的SDS-PAGE分析。泳道M含有分子量標(biāo)記蛋白，分子量表不在左側(cè)。圖2A利用馬皮屑反應(yīng)性血清比較了 nEqu c I兩種形式即A和B的IgE結(jié)合(分別來(lái)自峰C和峰D)。虛線表示0.35kUA/L的截止水平。圖2B利用馬皮屑反應(yīng)性血清比較了 19kDa和14kDa形式的nEqu c 4/5的IgE結(jié)合。虛線表示0.35kUA/L的截止水平。圖3表示純化用于尋找新IgE結(jié)合蛋白的級(jí)分。A:利用陰離子交換層析純化級(jí)分。S:利用疏水相互作用層析純化級(jí)分B和C。圖4表示純化15kDa馬皮屑蛋白。A:利用尺寸排阻層析對(duì)馬皮屑提取物進(jìn)行分級(jí)。峰A用于隨后的純化步驟。S:利用疏水相互作用層析對(duì)峰A進(jìn)行分級(jí)。峰J，按圖所示匯集，用于隨后的純化步驟?！?利用陰離子交換層析對(duì)峰J進(jìn)行分級(jí)。峰K和L用于隨后的分析和/或進(jìn)一步純化步驟。2:表示純化的15kDa馬皮屑蛋白的還原(紅色(Red))和非還原(Ox)樣品的SDS-PAGE分析。泳道M含有分子量標(biāo)記蛋白，分子量表示于左側(cè)。E:利用反相層析精煉純化峰K。峰M用于隨后的免疫分析。圖5表示nEqu c 15k的5kDa和IOkDa氨基酸鏈的預(yù)測(cè)的序列。利用N末端測(cè)序所鑒定的氨基酸用下 劃線表示，而通過(guò)MS/MS分析所鑒定的氨基酸以粗體表示。圖6表示2個(gè)馬變應(yīng)性患者(編號(hào)3和12)的血清中IgE對(duì)nEqu c 15k的反應(yīng)性，如通過(guò)免疫印跡所檢測(cè)的。前兩個(gè)條帶表示總蛋白染色，而5和IOkDa亞基與15kDa蛋白的位置，分別以箭頭表示。右側(cè)的4個(gè)條帶表示結(jié)合Equ c 15k的還原(Red)或非還原(Ox)樣品的IgE0圖7表示天然和重組Equ c 15k的IgE反應(yīng)性之間的相關(guān)性。0.35kUA/L和0.lkUA/L水平用虛線表不。圖8表示一組25名馬皮屑變應(yīng)性個(gè)體中馬皮屑提取物(HDE)即Equ cl、nEqu c2>nEqu c 3.nEqu c 4/5和rEqu c 15k的IgE抗體的水平。對(duì)于每一組分,0.lkUA/L以下的觀察結(jié)果的數(shù)量表示在括號(hào)中，虛線表示0.35kUA/L水平，且實(shí)線表示0.lkUA/L水平。水平柱表示IgE的中值水平。圖9 比較 IgE 抗體與 nEqu c 15k 和 rFel d I 的結(jié)合。0.35kUA/L 和 0.lkUA/L 水平以虛線表示。圖10表示可溶性Equ c 15k和Fel d I自抑制和交叉抑制IgE結(jié)合于固定的Equc I和Fel d I的能力。使用來(lái)自馬皮屑敏化個(gè)體(標(biāo)記A-E)或馬皮屑變應(yīng)性患者(根據(jù)表3標(biāo)記)的血清。本發(fā)明的詳細(xì)描述下文的實(shí)施例通過(guò)從馬中分離并使用分泌球蛋白說(shuō)明了本發(fā)明。實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，且不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制本發(fā)明，附加的權(quán)利要求限定了本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:從馬皮屑和血■清中純化和表征已知變應(yīng)原
用馬皮屑作為純化Equ c l、Equ c 2和Equ c 4/5的起始材料,而從馬血清中純化 Equ c 3。在20mM MOPS, pH 7.6，0.5M NaCl (MBS=MOPS 緩沖鹽水)中提取馬皮屑(Allergon, Valinge, Sweden)，通過(guò)離心澄清并用0.45 μ m的混合纖維素酯濾器(MiIlipore, Billerica, MA, USA)過(guò)濾。作為所有3種馬皮屑變應(yīng)原的第一純化步驟，將澄清的提取物施加于 Superdex 75 柱(XK26/100, Vt=505mL, GE Healthcare LifeSciences, Uppsala, Sweden),進(jìn)行尺寸排阻層析(SEC),并以2mL/min(mL/分鐘)的流速用MBS進(jìn)行洗脫。Eau c I為了純化Equ c I，將圖1A中的峰A用2M NH4SO4調(diào)整，并施加于用溶解于20mM tris pH 8.0 中的 2Μ NH4SO4 平衡的苯基 S印harose HP 柱(HR10/10, Vt=9.0mL, GEHealthcare Life Sciences)。在 2M-0M NH4SO4 的線性 NH4SO4 梯度中進(jìn)行洗脫。含有Equ c I的兩個(gè)峰洗脫于中間的梯度中，即圖1B中的峰C和D。在用20mM MOPS pH7.60.5M NaCl 平衡的 S印hadex G25 細(xì)柱(XK16/20, Vt=34mL, GE Healthcare LifeSciences)上使每個(gè)峰脫鹽后，利用還原樣品的NuPAGE MES緩沖液系統(tǒng)(10%NuPAGE凝膠，Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),所述系統(tǒng)是通過(guò)使樣品與含有IOOmM β巰基乙醇的NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen) 1:3混合而制備的,使nEqu c I的每一制劑經(jīng)歷十二燒基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。用Mark 12 標(biāo)準(zhǔn)品(Invitrogen)作為表觀分子量的標(biāo)志。如通過(guò)SDS-PAGE(圖1E)所判斷的，兩種nEqu c I制劑都是純的。如(Mattssonet al.2009)所述，利用在 Bruker Daltonics Autoflex 2 儀器(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)中進(jìn)行的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF),毫無(wú)疑義地將肽制劑鑒定為Equ c I。如(Marknell Def`fitt et al.2002)所述,將兩種形式的蛋白固定于ImmunoCAP 固相。Eau c 2為了純化Equ c 2，將SEC的第二峰即圖1A中的峰B用IM NH4SO4調(diào)整，并使之在用溶解于20mM Tris pH 8.0中的IM NH4SO4平衡的苯基S印harose HP柱(HR10/10, Vt=9.0mL, GE Healthcare Life Sciences)上進(jìn)行疏水相互作用層析(HIC)。在相同的緩沖液中用IM至OM NH4SO4的線性NH4SO4梯度進(jìn)行洗脫。Equ c 2包含于流通級(jí)分(1C中的峰E)中，將所述級(jí)分匯集并在用20mM Bis-Tris丙烷pH 8.5平衡的S印hadex G25 細(xì)柱(XK26/20, Vt=90mL, GE Healthcare Life Sciences)上脫鹽。最后將脫鹽的Equ c 2集合體施加于用20mM Bis-Tris丙燒，pH 8.5平衡的陰離子交換柱Source 15Q(HR16/10, Vt=9mL, GE Healthcare Life Sciences)。在相同的緩沖液中用線性 0_0.40MNaCl梯度洗脫后，將蛋白解析為3個(gè)峰，通過(guò)SDS-PAGE分析，它們都表現(xiàn)出純17kDa帶。利用 N末端測(cè)序(Procise LC452, Applied Biosystems, Foster city CA, USA)分析兩個(gè)最大的峰，且兩者都具有序列DQDPQSEDTY，從而將它們鑒定為Equ c 2.0201 (圖1D峰H和I)。為了評(píng)估IgE結(jié)合反應(yīng)性，如(Marknell Deffitt et al.2002)所述，匯集峰并將其固定于ImmunoCAP 固相。Equ c 4/5
利用SEC的第二峰即圖1A中的峰B，純化Equ c 4/5。將該集合體用IM NH4SO4調(diào)整，并使之在用溶解于20mM Tris pH 8.0的IM NH4SO4平衡的苯基S印harose HP柱(HR10/10, Vt=9.0mL, GE Healthcare Life Sciences)上進(jìn)行疏水相互作用層析(HIC)。在相同的緩沖液中，用IM至OMNH4SO4的線性NH4SO4梯度進(jìn)行洗脫。Equ c 4/5蛋白在中間梯度中，洗脫成兩個(gè)不同的峰(圖1C中的峰F和G)。對(duì)第一峰進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，蛋白作為14kDa帶遷移，而第二峰含有19kDa帶。在用20mM Bis-Tris丙烷pH 8.5平衡的S印hadex G25 細(xì)柱(XK26/20, Vt=90mL, GEHealthcare Life Sciences)上脫鹽后，如利用 SDS-PAGE (圖1E)所判斷的，兩種蛋白都是純的。這兩種制劑都表現(xiàn)出N末端序列VGPLLGPSDA，從而將它們鑒定為馬Iatherin或Equ c 4/5。如(Marknell Deffitt et al.2002)所述，將兩種形式的nEqu c 4/5分別固定于ImmunoCAP 固相。

Eau c 3基本上如(vanEijk et al.1999)所述，利用使用 Blue Sepharose FF (GEHealthcare Life Sciences)的親和層析、陰離子交換層析(AIEC)和SEC,從馬血清中純化天然Equ c 3。實(shí)施例2:評(píng)估IgE結(jié)合來(lái)自馬敏化個(gè)體的一組血■清中個(gè)體馬皮屑變應(yīng)原組分的水平利用一組馬皮屑敏化血清(獲得自源于內(nèi)部的血清收集物)評(píng)估稱為A型和B型的兩種形式的Equ c I的IgE結(jié)合活性。如圖2A所示,兩種形式的Equ c I都表現(xiàn)出等同的IgE結(jié)合活性。因此，僅將用nEqu c IA獲得的值用于下文的分析中。利用一組相似的馬皮屑反應(yīng)性血清，比較結(jié)合兩種形式的Equ c 4/5的IgE抗體，并發(fā)現(xiàn)它們非常相似，如圖2B所示。利用常規(guī)和實(shí)驗(yàn)性ImmunoCAP 測(cè)試(Phadia, Uppsala, Sweden),檢查結(jié)合馬皮屑提取物和純化的馬變應(yīng)原的IgE抗體。實(shí)驗(yàn)性ImmunoCAP 的制備如上文所述。使用來(lái)自馬皮屑敏化個(gè)體的一組29個(gè)血清。測(cè)定IgE對(duì)馬皮屑提取物nEqu c UnEqu c 2以及nEquc 4/5的應(yīng)答。結(jié)果顯示在表I中，其中患者Al至A29的血清中針對(duì)HDE和組分的IgE抗體的濃度以及三種組分的總和，表示為kUA/L。組分蓋度為組分總和與馬皮屑提取物的比值，表示為百分比。血多血清被鑒定為比個(gè)體組分如血清Al、A21和A22所引起的顯著更高的IgE結(jié)合馬皮屑提取物水平。除了在本階段未評(píng)估的可能的Equ c 3反應(yīng)性外，鑒定的血清能夠輔助從馬皮屑中尋找新的IgE結(jié)合蛋白。實(shí)施例3:鑒定具有新的IgE結(jié)合反應(yīng)性的馬皮屑的級(jí)分在純化以前表征的馬皮屑變應(yīng)原的過(guò)程中，鑒定了幾種級(jí)分，其含有除了以前已知的馬變應(yīng)原以外的蛋白。利用在上文實(shí)施例2所鑒定的血清，選擇特定目的的三種級(jí)分，用于分析IgE結(jié)合活性。級(jí)分A含有通過(guò)箭頭所示的Equ c 2的陰離子交換純化步驟(圖3A)獲得的IOkDa帶(還原SDS-PAGE)。級(jí)分B和C分別含有13kDa和IOkDa帶(還原SDS-PAGE)，是通過(guò)Equ c I的HIC純化步驟獲得的，并在圖3B中用箭頭表示。實(shí)驗(yàn)性ImmunoCAP (Phadia)測(cè)試的制備如(Marknell Deffitt et al.2002)所述，并用于血清分析。
結(jié)果概括于表2中，表2還包括以前對(duì)馬皮屑提取物和nEqu c UnEquc 2和nEquc 4/5的總和的確定，所有這些都顯示為kUA/L。在級(jí)分C中發(fā)現(xiàn)了最高IgE結(jié)合水平。尤其是，在血清Al中，結(jié)合級(jí)分C的IgE的水平，比結(jié)合nEqu c UnEqu c 2以及nEqu c 4/5的IgE總和高得多。這種血清具有僅1.5kUA/L的白蛋白IgE反應(yīng)性(未顯示)，這一事實(shí)表明級(jí)分C含有新的馬皮屑變應(yīng)原。實(shí)施例4:級(jí)分C的主要蛋白成分的純化和鑒定從級(jí)分C中純化馬皮屑蛋白為了以多個(gè)靶向方式純化存在于級(jí)分C中的IOkDa蛋白，如實(shí)施例1所述，使馬皮屑提取物進(jìn)行SEC。如圖(4A中峰A的)所示，根據(jù)SDS-PAGE分析，匯集含有Equ c I的峰。僅右手部分的峰A含有IOkDa帶，并且包括于集合體中。用2M NH4SO4調(diào)整集合體，并且如實(shí)施例1針對(duì)Equ c I所述，使之進(jìn)行HIC (圖4B)。在2 OmM Tris, pH 8.0中以1:3稀釋圖4B中的峰J，并施加于在相同的緩沖液中平衡的Source 15Q柱(PE 4.6/100, Vt=L 7mL;GEHealthcare Life Sciences)。用0-0.4M NaCl的線性梯度進(jìn)行洗脫,從而在中間梯度中產(chǎn)生主峰，接著是較小的峰(峰K和L，圖4C)。利用實(shí)施例1所述NuPAGE MES緩沖液系統(tǒng)，進(jìn)行SDS-PAGE分析，其中在具有或不具有分別用于還原或非還原條件的4%β -巰基乙醇的情況下，通過(guò)在NuPAGE LDS緩沖液中以1:3稀釋樣品，制備樣品。兩個(gè)峰(圖4D)的SDS-PAGE分析在非還原條件下顯示了約15kDa的帶。在還原樣品后，15kDa帶消失,而出現(xiàn)了約5和IOkDa的兩個(gè)帶,這表明未還原的15kDa帶由形成5kDa和IOkDa帶的多肽構(gòu)成，其通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此連接。盡管兩個(gè)峰看起來(lái)都含有相同的擔(dān)保，但是僅對(duì)大峰(K)進(jìn)行進(jìn)一步的生物化學(xué)分析。出于研究IgE結(jié)合的目的，通過(guò)將樣品施加于用溶解于水中的 0.065%TFA 平衡的 Source 5RPC 柱(ST 2.1/150，Vt=0.52mL;GEHealthcare LifeSciences)，而將精煉RPC純化步驟包括在內(nèi)。用緩沖液B的線性0-70%梯度進(jìn)行洗脫，緩沖液B由溶解于90%乙腈中的0.05%TFA構(gòu)成。在梯度的末端附加，蛋白被洗脫成單個(gè)峰(峰M,圖4E)中。

15kDa的馬皮屑蛋白被鑒定為分泌球蛋白利用N末端測(cè)序，分析從SDS-PAGE凝膠中切割和提取的還原的5kDa和IOkD蛋白帶。對(duì)5kDa帶進(jìn)行的分析顯示了氨基酸序列ATxPAVATDIASFFLLPDSL (x:未解析的殘基)，其匹配預(yù)測(cè)的馬(Equus cabal lus)序列的殘基22_41,表示“與LppAB相似” (Genbank Acc no XP_001502544) (SEQ ID NO:1)。對(duì) IOkDa 帶進(jìn)行的分析顯示了序列GSGxQLLEDVVEKTITAELS (x:未解析的殘基)，匹配預(yù)測(cè)的序列的殘基19-38，表示“與來(lái)自馬的親脂蛋白 CL2 相似” (GenBank Acc no ΧΡ_001494564) (SEQ ID NO:2) 對(duì)利用膜蛋白酶溶液消化(in-solutiontrypsin digest)的 MALD1-TOF MS純化的15kDa蛋白進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析，并未導(dǎo)致與已知的數(shù)據(jù)庫(kù)條目的任何明顯匹配(p〈0.05)。然而，然而肽的MS-MS分析m/z=2281和m/z=1262.5從預(yù)測(cè)的序列“與 LppAB(Equus caballus) (GenBank Acc noXP_001502544 相似”鑒定了 序列qcineisagdryiitetlgk(SEQ ID N0:3)o利用凝膠中胰蛋白酶消化的5kDa片段的MALD1-T0F MS，進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析，并未導(dǎo)致與已知的數(shù)據(jù)庫(kù)條目的任何明顯匹配(p〈0.05)。然而，所檢測(cè)的5個(gè)主要的肽都對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:4的預(yù)期的胰蛋白酶片段，其中m/z=903.47 (對(duì)應(yīng)于殘基28-35)，m/z=1037.6 (殘基 43-53)，m/z=1262.6 (殘基 43-53)，m/z=2281.1 (殘基 43-62)，以及m/z=2384.2(殘基1_22)，在SEQ ID NO: 4的預(yù)測(cè)的氨基酸殘基中其總共覆蓋50 (72%)個(gè)。通過(guò)凝膠中胰蛋白酶消化的IOkDa帶的MALD1-TOF MS，進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析，并未導(dǎo)致對(duì)已知的數(shù)據(jù)庫(kù)條目的任何明顯匹配(p〈0.05)。然而，所檢測(cè)到的兩個(gè)主要的肽是m/z=1433.6和m/z=2880.4，這分別與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 5的殘基1_13和14-39 的肽 GSGCQLLEDVVEK 和 TITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEK 的質(zhì)量一致。兩個(gè)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)條目即XP_001502544(SEQ ID NO:6)和 ΧΡ_001494564(SEQ IDNO:7)的氨基酸序列，包括被認(rèn)為是分泌球蛋白蛋白家族特有的特征。因此，綜合起來(lái)看，所述結(jié)果將15kDa馬皮屑蛋白鑒定為了分泌球蛋白。該蛋白在后文中稱為Equ c 15k。Equc 15k的兩條鏈的預(yù)測(cè)的全長(zhǎng)序列前體序列顯示在圖5 (5kDa片段-SEQ ID N0:6;10kDa片段-SEQ ID NO 7)中，其中N末端測(cè)序所鑒定的氨基酸標(biāo)有下劃線，而MS-MS分析所鑒定的那些氨基酸以粗體顯示。5kDa片段的前體序列包括21個(gè)氨基酸的N末端信號(hào)肽，而IOkDa片段的前體序列包括18個(gè)氨基酸的N末端信號(hào)肽。必須指出，利用SiRnalP (www.cbs.dtu.dk/services/SiRnalP)預(yù)測(cè)前體序列的信號(hào)肽,導(dǎo)致與針對(duì)5kDa和IOkDa鏈以實(shí)驗(yàn)方式獲得的那些相同的成熟序列。圖4D中的SDS-PAGE分析提供了在非還原條件下5和IOkDa氨基酸鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵保持在一起從而形成異二聚體蛋白的證據(jù)。因此，所述分析將編碼序列SEQ IDNo 4的基因與編碼SEQ ID No 5的不同基因聯(lián)系在一起，兩者一起組成以前未知的異二聚體分泌球蛋白蛋白。實(shí)施例5:利用免疫印跡分析評(píng)估IgE與Equ c 15k的結(jié)合為了確定IgE針對(duì)Equ c 15k的反應(yīng)性定向所述蛋白的哪個(gè)亞基,利用還原和非還原條件，進(jìn)行免疫印跡分析。`對(duì)通過(guò)SDS-PAGE 利用 4_20%NuPAGE 凝膠分離的(Invitrogen)純化的 Equc 15k的還原和非還原樣品進(jìn)行免疫印跡分析，并將其在Hybond ECL硝化纖維素膜(GE Healthcare Life Sciences)上進(jìn)行電印跡。利用封閉緩沖液(50mM磷酸鹽pH7.4，0.1% (v/v) Tween 20，0.9% (w/v) NaCl, 0.3% (w/v)葡聚糖 T10)，在室溫下將蛋白印跡封閉I小時(shí)，接著將其與來(lái)自患者3和12的血清孵育過(guò)夜，在封閉緩沖液中分別以1:4.8和1:13.5稀釋。在用含有0.5%(v/v)Tween-20的0.15M NaCl洗滌后，將膜在封閉緩沖液中與HRP-標(biāo)記的抗人IgE抗體一起孵育3小時(shí)，利用ECL Advance WesternBlotting Detection Kit (GE Healthcare Life Sciences)和 LAS 4000 迷你 CCD 相機(jī)(Fujifilm, Tokyo, Japan),使用突光測(cè)定法檢測(cè)結(jié)合的IgE。分析中所用的2個(gè)血清(3號(hào)和12號(hào)患者)，根據(jù)ImmunoCAP 分析(參見(jiàn)下文的實(shí)施例7),都具有與Equ c 15k的主要反應(yīng)性。這兩種血清僅與Equ c 15k的在還原條件下解離的亞基微弱反應(yīng)，所述亞基作為對(duì)應(yīng)于還原的5kDa和IOkDa亞基的弱帶是可見(jiàn)的(圖6)。在非還原條件下，用與Equc 15k的非還原的15kDa帶一致的帶，觀察到強(qiáng)得多的反應(yīng)性。在本分析中，未觀察到與其他帶的明顯反應(yīng)性。該免疫印跡分析表明，IgE結(jié)合反應(yīng)性確實(shí)定向Equ c 15k制劑中的主要蛋白帶。實(shí)施例6:重組Eau c 15k的產(chǎn)牛和免疫學(xué)表征
重鉬Eau c 15k的克降和鈍化通過(guò)將編碼的5kDa和IOkDa亞基的氨基酸序列的核苷酸序列與編碼包含3x (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的連接肽的序列組合,設(shè)計(jì)合成的Equ c 15k單鏈基因。將全長(zhǎng)合成基因克隆到載體pET23a(+) (Novagen，Madison, WI，USA)的NdeI和XhoI位點(diǎn)，從而添加C末端六聚組氨酸標(biāo)簽，使得能利用固定金屬離子親和層析(IMAC)純化蛋白。整個(gè)重組蛋白的氨基酸序列顯示在SEQ ID N0:8中。針對(duì)在E.coli(DNA2.0，MenloPark, CA, USA)中的最佳密碼子使用，設(shè)計(jì)核苷酸序列。編碼整個(gè)重組蛋白的核酸序列顯示于 SEQ ID N0:9 中。將質(zhì)粒DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到E.coli菌株BL21-AI (Invitrogen)中，并利用3升的生物反應(yīng)器(Belach Bioteknik, Solna, Sweden)產(chǎn)生重組 Equ c 15k 單鏈蛋白。為了純化重組Equ c 15k，將收獲的細(xì)胞重懸浮于20mM Tris-HClpH8.0中，并通過(guò)以10000-15000kPa將懸浮液通過(guò)Emulsiflex C5勻漿器(Avestin, Ottawa, Ontario, Canada),使之裂解。在離心懸浮液后，將粒狀內(nèi)含體溶解于6M胍-HCl、20mM Tris pH 8.0、0.5M NaCl、5mM 咪唑(imidazol)中，并用 0.45 μ m 混合纖維素濾器(Millipore)過(guò)濾。將過(guò)濾的上清液施加于螯合瓊脂糖(Chelating Sepharose)FF柱(GE Healthcare Life Sciences),用 NiSO4 使所述 EF 柱帶電。用溶解于 2OmM Tris-HClpH 8.0,0.15M NaCl，20mM咪唑中的6M脲進(jìn)行柱洗滌，隨后在相同的緩沖液中利用脲的線性6M-2M梯度進(jìn)行原位復(fù) 性。復(fù)性后，在相同的緩沖液中用咪唑的線性20-500mM梯度洗脫重組蛋白。利用 Q Sepharose FF柱(GEHealthcare Life Sciences),通過(guò)20mM Tris-HClpH 8.0中的AIEC進(jìn)一步純化重組蛋白。利用線性0-0.5M NaCl梯度，洗脫蛋白，并根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果匯集級(jí)分。利用0.44per mg/mL的計(jì)算的消光系數(shù),根據(jù)280nm下的吸光度，確定最終制劑的蛋白濃度。評(píng)估IgE與Eau c 15k的結(jié)合將重組Equ c 15k 固定于實(shí)驗(yàn)性 ImmunoCAP ,并且如(Marknell Deffitt etal.2002)所述，測(cè)定IgE與來(lái)自36個(gè)馬皮屑敏化個(gè)體的血清的反應(yīng)性。在結(jié)合于純化的天然Equ c 15k和重組Equ c 15k的IgE之間,存在良好的一致性(r=0.98)(圖7)，這表明重組蛋白是免疫活性的，且在結(jié)構(gòu)式與天然蛋白形似。這些數(shù)據(jù)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，即Equ c 15k的5kDa (SEQID NO:4)和IOkDa(SEQ ID NO:5)片段的氨基酸序列，如根據(jù)確定的基因組序列信息所預(yù)測(cè)的，是正確的，且表示純化的馬皮屑變應(yīng)原Equ c 15k的氨基酸序列。實(shí)施例7:評(píng)估一組馬變應(yīng)件患者中nEau c 1、nEau c 2、nEau c 3、nEau c 4/5以及Equ c 15k的I迚結(jié)合活性本研究使用來(lái)自西班牙(n=20)和瑞典(n=5)的25名馬變應(yīng)性個(gè)體的血清。所有的患者被醫(yī)生診斷為馬變態(tài)反應(yīng)，具有諸如哮喘、鼻結(jié)膜炎和蕁麻疹癥狀，以及對(duì)馬皮屑提取物的陽(yáng)性皮膚點(diǎn)刺測(cè)試。在對(duì)儲(chǔ)存樣品和數(shù)據(jù)的生物數(shù)據(jù)庫(kù)(biobank)作出貢獻(xiàn)的每一中心，在獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)許可的情況下，收集所有樣品和臨床數(shù)據(jù)。利用ImmunoCAP (Fig.8，Table 3)，測(cè)定25名馬變應(yīng)性個(gè)體中馬皮屑提取物nEquc UnEqu c 2>nEqu c 3和nEqu c 4/5以及rEqu c 15k的特異性IgE抗體的水平。在表3中，將所有ImmunoCAP 水平顯示為kUA/L，且用ES (西班牙)或SE (瑞典)表示每一患者的來(lái)源。暴露于馬后記錄的變應(yīng)性癥狀為鼻炎(rhin)、哮喘(astm)、蕁麻疹(urt)或過(guò)敏反應(yīng)(anaph)。在所測(cè)試的25種血清中，12 (48%)種表現(xiàn)出針對(duì)rEqu c 15k的IgE應(yīng)答彡0.35kUA/L，16種(64%)表現(xiàn)出針對(duì)nEqu c 2的IgE應(yīng)答，以及19種(76%)表現(xiàn)出針對(duì)nEqu c I的IgE應(yīng)答。在所研究的個(gè)體中，nEqu c 3和nEqu c 4/5兩者都表現(xiàn)為次要的變應(yīng)原，分別結(jié)合僅來(lái)自5(20%)種和7種(28%)測(cè)試的血清的IgE ab。25種血清中有4種(16%)唯一地與Equ c 15k反應(yīng)，平均而言，在所有Equ c 15k反應(yīng)性血清中，Equ c 15k的IgE抗體的濃度相當(dāng)于馬皮屑IgE抗體濃度的37%。nEqu c I的IgE抗體的相應(yīng)相對(duì)濃度為52%，而對(duì)于nEqu c 2、nEqu c 3以及nEqu c 4/5而言，在對(duì)這些變應(yīng)原具有特異性反應(yīng)性的血清中，相對(duì)濃度分別為35%、69%以及9%。25種血清中有24種表現(xiàn)出IgE抗體結(jié)合馬皮屑提取物。所有這些血清都表現(xiàn)出與所測(cè)試的5種個(gè)體馬變應(yīng)原中的至少一種結(jié)合。IgE與個(gè)體組分的結(jié)合水平的總和，匹配或超過(guò)與馬皮屑提取物的結(jié)合水平的總和。實(shí)施例8 J^fEau c 15k和貓的分泌球蛋白即豐要的貓奪應(yīng)原Fel d I的獨(dú)立敏化作用因?yàn)镋qu c 15k屬于分泌球蛋白蛋白家族，因此研究與主要的貓變應(yīng)原Fel d I的免疫學(xué)關(guān)系，F(xiàn)el d I屬于同一蛋白家族。在36名馬皮屑敏化個(gè)體的血清中，評(píng)估IgE與Fel d I的結(jié)合水平，所述敏化個(gè)體包括實(shí)施例7所述的25名馬變應(yīng)性患者。并未檢測(cè)到IgE水平與重組Equ c 15和rFel d I之間的明顯關(guān)聯(lián)(r=0.36)(圖9),這表明，針對(duì)Equc 15k的IgE抗體應(yīng)答主要不是Equ c 15k與Fel d I之間的交叉反應(yīng)性的結(jié)果,反之亦然。為了進(jìn)一步研究Equ c 15k與Fel d I之間的潛在的交叉反應(yīng)性，利用固相上的rEqu c 15k和rFel d I以及nEqu c 15k和rFel d I作為抑制劑，以100 μ g/ml的終濃度(圖10)，測(cè)試8種血清的交叉抑制，所述血清表現(xiàn)出針對(duì)Fel d I和Equ c 15k的明顯的IgE抗體結(jié)合反應(yīng)性。利用IgE`稀釋液(Phadia)作為抑制對(duì)照。計(jì)算每次抑制的雙份測(cè)定的平均值，以及利用可以用每種抑制劑壓制(quench)的稀釋液抑制劑，來(lái)將抑制的分?jǐn)?shù)計(jì)算為結(jié)合的分?jǐn)?shù)。在這些所選的血清中，當(dāng)結(jié)合于固相上的Fel d I時(shí)，僅可以通過(guò)Feld I實(shí)現(xiàn)抑制。同樣，在固相上的Equ c 15k上,利用Equ c 15k的抑制僅是可能的,這表明，在這些個(gè)體中，對(duì)這些分子的敏化作用獨(dú)立于彼此發(fā)生，并且不是交叉反應(yīng)性的結(jié)果。然而，并不能完全排除兩種蛋白之間弱交叉反應(yīng)性的存在。表I
權(quán)利要求
1.分離的馬變應(yīng)原以及與其共享抗體表位的其變體和片段，所述馬變應(yīng)原是分泌球蛋白，其在非還原條件下具有15kDa的分子量且包含連接在一起的分子量為5kD的第一肽鏈和分子量為IOkDa的第二肽鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的馬變應(yīng)原，其是從馬中純化的或是重組產(chǎn)生的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的馬變應(yīng)原以及與其共享抗體表位的其變體和片段，其中所述第一肽鏈包含N末端氨基酸序列ATCPAVATDIASFFLLPDSL(SEQ ID NO:1)
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的馬變應(yīng)原以及與其共享抗體表位的其變體和片段，其中所述第二肽鏈包含N末端氨基酸序列GSGCQLLEDVVEKTITAELS(SEQ ID NO: 2)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原以及與其共享抗體表位的其變體和片段，其中所述第一肽鏈包含具有氨基酸序列QCINEISAGDRYIITETLGK(SEQ ID NO:3)的片段。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原以及與其共享抗體表位的其變體和片段，其中所述第一肽片段包含氨基酸序列 ATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEISAGDRYIITETLGKIVLQCGA(SEQ ID NO:4)
7.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原以及與其共享抗體表位的其變體和片段，其中所述第二肽片段包含氨基酸序列 GSGCQLLEDVVEKTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLKQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF(SEQ ID NO:5)。
8.分離的核酸序列,其編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原。
9.載體，其包含權(quán)利要求8所述的核酸分子。
10.宿主細(xì)胞,其包含 權(quán)利要求9所述的載體。
11.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原，用于I型變態(tài)反應(yīng)的體外診斷。
12.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原在制備用于體外診斷I型變態(tài)反應(yīng)的診斷組合物中的用途。
13.產(chǎn)生變應(yīng)原組合物的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原添加于包含變應(yīng)原提取物和/或至少一種純化的變應(yīng)原組分的組合物中。
14.能通過(guò)權(quán)利要求13所述的方法獲得的變應(yīng)原組合物。
15.體外診斷I型變態(tài)反應(yīng)的方法，包括如下步驟: 將來(lái)自疑似患有I型變態(tài)反應(yīng)的患者的含有免疫球蛋白的體液樣品與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原或與權(quán)利要求14所述的變應(yīng)原組合物接觸，以及 檢測(cè)所述樣品中特異性結(jié)合所述馬變應(yīng)原的IgE抗體的存在， 其中特異性結(jié)合所述馬變應(yīng)原的此種IgE抗體的存在表示I型變態(tài)反應(yīng)。
16.用于進(jìn)行權(quán)利要求15所述方法的診斷試劑盒，包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原或權(quán)利要求14所述的組合物。
17.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原，用于I型變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防性治療或治療性治療。
18.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原在制備用于預(yù)防性治療或治療性治療I型變態(tài)反應(yīng)的治療組合物中的用途。
19.用于治療I型變態(tài)反應(yīng)的方法，包括向易感于這類治療的個(gè)體施用權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原或所述馬變應(yīng)原經(jīng)修飾以消除或減弱其IgE結(jié)合應(yīng)答的形式。
20.藥物組合物，包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的馬變應(yīng)原或所述馬變應(yīng)原經(jīng)修飾以消除或減弱其IgE結(jié)合應(yīng)答的形式，和任選存在的至少一種藥物可接受的載體、賦形劑、緩沖劑以及稀釋劑 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了分離的馬變應(yīng)原及與其共享抗體表位的其變體和片段，所述馬變應(yīng)原是在非還原條件下分子量為15kDa且包含連接在一起的分子量為約5kDa的第一肽鏈和分子量為約10kDa的第二肽鏈的分泌球蛋白。還公開(kāi)了所述變應(yīng)原在診斷和治療中的用途，以及含有所述變應(yīng)原的診斷試劑盒和藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K14/47GK103108883SQ201180020467
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者L·馬特松, J·利德霍爾姆, T·隆格倫 申請(qǐng)人:法蒂亞公司