專利名稱：用于誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及用于誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells)的方法和組合物(composition)
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(E S)是多能細(xì)胞，它能夠在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖和向表現(xiàn)出多能性質(zhì)的多種細(xì)胞系限制性細(xì)胞(lineage-restricted cell)群體分化(Odorico et al. , StemCells 19:193-204(2001))。由于這些特征，包括人類胚胎干細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞能夠成為非常特定的細(xì)胞類型，該細(xì)胞類型表現(xiàn)出多種功能。通常人類胚胎干細(xì)胞是高度成分均一，具有自我復(fù)制能力和分化成人體中的任意功能細(xì)胞的能力。在合適的條件下，自我復(fù)制能夠?qū)е麻L期增殖能力，具有在細(xì)胞培養(yǎng)中無限擴(kuò)增的潛力。另外，如果人類胚胎干細(xì)胞以無向的方式(undirected fashion)分化,用于表達(dá)用于多數(shù)不同組織類型標(biāo)志的細(xì)胞的異質(zhì)性群體(heterogeneous population)被獲得(W0 01/51616;和 Shamblott et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:113(2001))。這些特征使得人類胚胎干細(xì)胞獨(dú)特、均一，用于制備具有治療功效的細(xì)胞的起源群體。人類胚胎干細(xì)胞能夠被用于制備多種用于科學(xué)和商業(yè)研究用途的分化細(xì)胞類型。目前，許多類型的分化人類細(xì)胞不易獲得且在體外培養(yǎng)中不能大量的擴(kuò)增。然而，人類胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)中能夠無限地擴(kuò)增，且能夠分化成許多(即使不是全部)人體的分化細(xì)胞類型。這樣以來，誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞分化成任何數(shù)量的人體的特定細(xì)胞類型的培養(yǎng)技術(shù)正在被開發(fā)。用于科學(xué)和商業(yè)研究的許多分化人類細(xì)胞可被大量地供應(yīng)的可能性已經(jīng)被人類胚胎干細(xì)胞的可用性開啟。從事人類胚胎干細(xì)胞的一個困難是不使用動物產(chǎn)品或產(chǎn)品，如血清，開發(fā)用于人類胚胎干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的條件，動物產(chǎn)品或產(chǎn)品，如血清趨向于批次到批次不同。這樣以來，本領(lǐng)域希望人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)條件盡可能界定。為了實(shí)現(xiàn)那個想法，一組培養(yǎng)條件最近被描述即允許在界定的條件下長期培養(yǎng)未分化的人類胚胎干細(xì)胞。Ludwig et al. , Nat. Methods 3:637-646 (2006),整體納入文本作為參考。Ludwig等描述了一種培養(yǎng)基，本文該培養(yǎng)基被稱為TeSR 培養(yǎng)基，其用于培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞，該培養(yǎng)基的每種成分被充分公開和表征。因此，TeSR 是一種用于人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的被充分界定且足夠的培養(yǎng)基。TeSR 已經(jīng)被證明在用于新鮮人類胚胎干細(xì)胞系的衍生中的使用也有效，新鮮人類胚胎干細(xì)胞系的衍生甚至比未分化的人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)更有挑戰(zhàn)性限制。當(dāng)生長在細(xì)胞與其它細(xì)胞或它們環(huán)境中的物理結(jié)構(gòu)(physical structures)直接接觸的環(huán)境中時，人類胚胎干細(xì)胞優(yōu)先地保持未分化。在其它細(xì)胞環(huán)境中，人類胚胎干細(xì)胞開始分化且不能無限增殖。在克隆一種胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，這是有意義的。本文使用的“克隆”意思是從起始培養(yǎng)啟動一種胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，理想地，從單個胚胎干細(xì)胞或至少從極少數(shù)個胚胎干細(xì)胞。允許未分化的胚胎干細(xì)胞的克隆培養(yǎng)的培養(yǎng)條件也許是在常規(guī)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和增殖中要求的所有條件中的最基本條件。盡管在有效地培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞中取得了進(jìn)展，這些方法的幾個重大缺點(diǎn)仍然存在。例如，通過M E F調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(MEF-conditioned medium)或基質(zhì)膠(matrigelmatrix)，暴露于動物病原體仍然是一種可能。在人類治療中使用人類胚胎干細(xì)胞的主要障礙是最初描述的繁殖人類胚胎干細(xì)胞的方法，該方法涉及在非人類起源的一層飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cells)上，且在非人類起源的營養(yǎng)血清的存在下培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞。最近，廣泛研究改進(jìn)用于人類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)體系已經(jīng)集中在在無血清/無飼料的條件下種植胚胎干細(xì)胞的能力上。例如，為了保證一種用于人類胚胎干細(xì)胞的生長的無飼料的環(huán)境，包括血清替代物(S R)，轉(zhuǎn)化生長因子.beta. l(TGF-.beta. I), LIF, bFGF和基質(zhì)纖連蛋 白(fibronectin matrix)的培養(yǎng)基的替代體系也已經(jīng)被嘗試(Amit et al (2004), Biol.Reprod. 70(3) :837-45)。評價在人類飼料或無飼料基質(zhì)上衍生和繁殖未分化的人類胚胎干細(xì)胞的方法在繼續(xù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于重新編程細(xì)胞進(jìn)入多能干細(xì)胞樣(a pluripotent stemcell like) (PSCL)細(xì)胞或無性系(clone)的方法和組合物，用于本發(fā)明的方法的一種培養(yǎng)基、PSCL細(xì)胞或無性系和使用所述PSCL細(xì)胞或無性系治療或減輕紊亂(disorder)的一種方法。在一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，所述組合物包括纖維調(diào)節(jié)素(FMOD)或它的衍生物或片段，其中所述組合物對重新編程細(xì)胞以便形成多能干細(xì)胞樣(PSCL)無性系是有效的，其中所述PSCL克隆，在免疫熒光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60 (S)或 TRA-1-181 的抗體識別。在一些實(shí)施例中，所述FMOD是FMOD蛋白質(zhì)或肽。所述細(xì)胞培養(yǎng)基組合物可以具有不同濃度的FMOD蛋白質(zhì)或肽。在一些實(shí)施例中，所述組合物具有濃度從約200nM到約800nM的FMOD。在上述組合物中，所述細(xì)胞可以為任意哺乳動物的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞(mouse cell)或大鼠細(xì)胞(rat cell)。人類細(xì)胞的例子包括,例如，BJ、MRC-5 和 NHDF。在另一方面，本發(fā)明提供了一種重新編程哺乳動物細(xì)胞進(jìn)入PSCL細(xì)胞或無性系的方法。在一些實(shí)施例中，所述方法包括用細(xì)胞培養(yǎng)基處理哺乳動物細(xì)胞從一天到一個月的一段時間，和有規(guī)律地更換所述細(xì)胞培養(yǎng)基直至多能干細(xì)胞樣(PSCL)無性系形成；其中所述培養(yǎng)基包括纖維調(diào)節(jié)素(fibiOmodulin) (FMOD)或它的衍生物或片段，其中所述組合物對重新編程所述細(xì)胞以便形成PSCL無性系是有效的，和
其中所述PSCL無性系，在免疫熒光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60 (S)或 TRA-1-181 的抗體識別。在一些實(shí)施例中，所述FMOD是FMOD蛋白質(zhì)或肽。在上述方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基組合物可以具有不同濃度的FMOD蛋白質(zhì)或肽。在一些實(shí)施例中，所述組合物具有濃度從約200nM到約800nM的FM0D。在上述方法中，所述細(xì)胞可以為任意哺乳動物的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞。人類細(xì)胞的例子包括，例如，BJ、MRC-5、NHDF、角化細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、外周血細(xì)胞(例如，CD34+)、臍帶血細(xì)胞或甚至某些干細(xì)胞(例如，脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells)、血管周圍干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞)。
在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，它提供了一種多能干細(xì)胞樣(PSCL)細(xì)胞或無性系，其由一種方法產(chǎn)生，所述方法包括用細(xì)胞培養(yǎng)基處理哺乳動物細(xì)胞從一天到一個月的一段時間，和有規(guī)律地更換細(xì)胞培養(yǎng)基直至多能干細(xì)胞樣(PSCL)無性系形成；其中所述培養(yǎng)基包括纖維調(diào)節(jié)素(FMOD)或它的衍生物或片段，其中所述組合物對重新編程細(xì)胞以便形成PSCL無性系是有效的，和其中，所述PSCL無性系，在免疫熒光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60 (S)或 TRA-1-181 的抗體識別。在一些實(shí)施例中，所述FMOD是FMOD蛋白質(zhì)或肽。在上述方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基組合物可以具有不同濃度的FMOD蛋白質(zhì)或肽。在一些實(shí)施例中，所述組合物具有FMOD濃度從約200nM到約800nM。在上述方法中，細(xì)胞可以為任意哺乳動物的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞是人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞。人類細(xì)胞的例子包括，例如，BJ、MRC-5、NHDF、角化細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、外周血細(xì)胞(例如CD34+)、臍帶血細(xì)胞或甚至某些干細(xì)胞(例如，脂肪源性干細(xì)胞、血管周圍干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞)。所述PSCL細(xì)胞或無性系能夠被用于治療或減輕任意紊亂，這些紊亂能夠被多能或全能干細(xì)胞治療或減輕。通常，所述方法包括給予哺乳動物受試者(例如，人類或動物)本文公開的PSCL細(xì)胞或無性系。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是神經(jīng)組織退化的紊亂(neurodegenerative disorder)。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病、心血管病、血液病、克羅恩病(Crohn’ s disease)、骨疾病、肌病或軟骨疾病。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是視網(wǎng)膜疾病。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是對組織的創(chuàng)傷和損害。這樣的組織的例子可以是皮膚、肌肉、軟骨、筋、末梢神經(jīng)、脊髓、血管或骨頭。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是骨骼疾病。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是器官疾病。在另一方面,本發(fā)明提供了一種包括本文公開的培養(yǎng)基的上清(supernatant),所述上清的實(shí)施例在上文和下文中都被描述。所述上清對治療或減輕紊亂是有效的，就像本文公開的PSCL細(xì)胞或無性系。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種包括本文公開的上清的組合物。所述組合物可以是藥物或化妝組合物，所述組合物可以被給予哺乳動物受試者以便治療或減輕本文公開的紊亂。


圖Ia和圖Ib顯示的是暴露于FMOD之后，大鼠-2成纖維細(xì)胞形成具有胚胎干細(xì)胞(ES)形貌的無性系。圖2a_2c顯示的是對人類新生兒包皮皮膚成纖維細(xì)胞(human newborn foreskindermal fibroblast) BJ 細(xì)胞測試結(jié)果。圖3a和圖3b顯示的是對人類胎兒肺成纖維細(xì)胞(human fetal lungfibroblast) MRC-5細(xì)胞測試結(jié)果。圖4顯示的是對人類新生兒包皮皮膚成纖維細(xì)胞BJ細(xì)胞測試結(jié)果。圖5顯示的是用針對人類iPS細(xì)胞的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(key transcriptionalregulators) (NANOG、0CT4S0X2)的抗體和在所有人類多能細(xì)胞(SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的細(xì)胞表面上被表達(dá)的抗原，BJ-FiPS細(xì)胞進(jìn)一步通過免疫熒光染色被識別。標(biāo) 尺200 μ m.圖6顯示的是BJ-FiPS細(xì)胞進(jìn)一步被RT-PCR識別。未處理的BJ細(xì)胞被用作對照。用于iPS表征(S0X2、0CT4、NAN0G和hTERT)、外胚層標(biāo)記(KRT-18和巢蛋白(NESTIN))、內(nèi)胚層標(biāo)記(AFP和GATA-4)，中胚層標(biāo)志(FLT-1、BMP-4和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(VE-Cadherin))的引物被用做針對β_肌動蛋白的對照引物。圖7 顯不的是使用 AggreWell 800 協(xié)議表達(dá)(AggreWe11 800protocolexpression), BJ-FiPS在懸浮培養(yǎng)中形成胚胎體(EBs)。圖8a_8c顯示的是經(jīng)過14天懸浮培養(yǎng)后，免疫染色顯示BJ-FiPS EBs用iPS標(biāo)記(a)和外胚層(b)及中胚層標(biāo)記(C)表達(dá)。圖9顯示的是BJ-FiPS細(xì)胞在體外分化成造骨細(xì)胞。圖10顯示的是NHDF-FiPS細(xì)胞在體外分化成造骨細(xì)胞。圖11顯示的是在SCID-小鼠睪丸中FiPS細(xì)胞分化成骨組織。圖12顯示的是FiPS細(xì)胞被轉(zhuǎn)移入脂肪生成培養(yǎng)基(adipogenesis medium)(Lonza)中 21 天。圖13a和圖13b顯示的是對BJ-FiPS細(xì)胞的測試結(jié)果。圖14a和圖14b顯示的是對BJ-FiPS EBS細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果。圖15a和圖15b顯示的是對在飼養(yǎng)細(xì)胞上BJ-FiPS細(xì)胞生長的試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式在一方面，本發(fā)明提供一種用于重新編程哺乳動物細(xì)胞進(jìn)入多能干細(xì)胞樣(PSCL)細(xì)胞的方法。該方法一般包括用培養(yǎng)基處理哺乳動物細(xì)胞足夠長的一段時間，導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞被重新編程進(jìn)入細(xì)胞或無性系，所述細(xì)胞或無性系表現(xiàn)出或具有多能干細(xì)胞的一個或多個特征或性質(zhì)。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基包括纖維調(diào)節(jié)素(FMOD)蛋白質(zhì)或肽，或它的衍生物或片段。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約InM到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約InM到約IOnM,從約InM到約20ηΜ,從約InM到約50ηΜ,從約InM到約IOOnM,從約InM到約200ηΜ，從約InM到約500ηΜ，從約InM到約ΙΟΟΟηΜ，從約InM到約2 μ M，從約InM到約5 μ M，從約InM到約10 μ Μ,從約InM到約20 μ Μ,從約InM到約50 μ Μ,從約InM到約100 μ Μ,從約InM到約200 μ M或從約InM到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約IOnM到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約IOnM到約20ηΜ，從約IOnM到約50ηΜ，從約IOnM到約ΙΟΟηΜ，從約IOnM到約200nM,從約IOnM到約500nM,從約IOnM到約IOOOnM,從約IOnM到約2 μ M,從約IOnM到約5 μ Μ，從約IOnM到約10 μ Μ,從約IOnM到約20 μ Μ,從約IOnM到約50 μ Μ,從約IOnM到約100 μ Μ,從約IOnM到約200 μ M或從約IOnM到約500 μ M0在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約20ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約20ηΜ到約50ηΜ，從約20ηΜ到約ΙΟΟηΜ，從約20nM到約200nM，從約20nM到約500nM，從約20nM到約ΙΟΟΟηΜ，從約20nM到約2 μ M，從約20ηΜ到約5 μ Μ，從約20ηΜ至Ij約10 μ Μ,從約20ηΜ到約20 μ Μ,從約20ηΜ到約50 μ Μ,從約20ηΜ到約100 μ Μ,從約20ηΜ 到約200 μ M或從約20ηΜ到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約50ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約50ηΜ到約ΙΟΟηΜ，從約50nM到約200nM，從約50nM到約500nM，從約50nM到約ΙΟΟΟηΜ，從約50nM到約2 μ M，從約50ηΜ到約5 μ Μ，從約50ηΜ到約10 μ Μ,從約50ηΜ到約20 μ Μ,從約50ηΜ到約50 μ Μ,從約50ηΜ到約100 μ Μ,從約50ηΜ到約200 μ M或從約50ηΜ 到約 500 μ Mo在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基可以包括濃度從約IOOnM到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約IOOnM到約200ηΜ，從約IOOnM到約500ηΜ，從約IOOnM到約ΙΟΟΟηΜ，從約IOOnM到約2 μ M，從約IOOnM到約5 μ Μ,從約IOOnM到約10 μ Μ,從約IOOnM到約20 μ Μ,從約IOOnM到約50 μ Μ,從約IOOnM到約100 μ Μ,從約IOOnM到約200 μ M或從約IOOnM到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約200ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約200ηΜ到約500ηΜ，從約200ηΜ到約ΙΟΟΟηΜ，從約200nM到約2 μ M，從約200ηΜ到約5 μ Μ，從約200ηΜ到約10 μ Μ,從約200ηΜ到約20 μ Μ,從約200ηΜ到約50 μ Μ,從約200ηΜ到約100 μ Μ,從約200ηΜ到約200 μ Μ,或從約200ηΜ到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約500ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約500ηΜ到約IOOOnM,從約500ηΜ到約2 μ Μ,從約500ηΜ到約5 μ Μ,從約500ηΜ到約10 μ Μ,從約500ηΜ到約20 μ Μ,從約500ηΜ到約50 μ Μ,從約500ηΜ到約100 μ Μ,從約500ηΜ到約200 μ M或從約500ηΜ到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約IOOOnM到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約IOOOnM到約2 μ Μ，從約IOOOnM到約5 μ Μ，從約IOOOnM到約10 μ Μ，從約IOOOnM到約20 μ Μ,從約IOOOnM到約50 μ Μ,從約IOOOnM到約100 μ Μ,從約IOOOnM到約200 μ M 或從約 IOOOnM 到約 500 μ M0在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約2 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約2 μ M到約5 μ Μ，從約2 μ M到約10 μ Μ，從約2 μ M到約20 μ Μ，從約2 μ M到約50 μ Μ,從約2 μ M到約100 μ Μ,從約2 μ M到約200 μ M或從約2 μ M到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約5 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約5 μ M到約10 μ Μ，從約5 μ M到約20 μ Μ，從約5 μ M到約50 μ Μ，從約5 μ M到約100 μ Μ,從約5 μ M到約200 μ M或從約5 μ M到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約10 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約10 μ M到約20 μ Μ，從約10 μ M到約50 μ Μ，從約10 μ M到約100 μ Μ，從約10 μ M到約200 μ M或從約10 μ M到約500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約20 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約20 μ M到約50 μ Μ，從約20 μ M到約100 μ Μ，從約20 μ M到約200 μ M或從約20 μ M到約500 μ Mo在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約50 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約50 μ M到約100 μ Μ，從約50 μ M到約200 μ M或從約50 μ M到約500 μ Mo在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括濃度從約100 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽，例如，從約100 μ M到約200 μ M或從約100 μ M到約500 μ Mo 在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基可以包括濃度從約500 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質(zhì)或肽。除了所述FMOD蛋白質(zhì)或肽或它的衍生物或片段，所述培養(yǎng)基可以是在本領(lǐng)域普遍使用的任意細(xì)胞培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)基通常包括鹽水。細(xì)胞培養(yǎng)基的一個例子包括，例如，鹽水、pH為7. 4的PBS、DMEM培養(yǎng)基或成纖維細(xì)胞堿性培養(yǎng)基(FBM，Lonza)。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基可以包括額外的成分或試劑，例如，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-i3。在培養(yǎng)基中FMOD蛋白質(zhì)或肽的濃度的例子可以是，例如，約ΙΟηΜ，約20nM，約50nM,約 ΙΟΟηΜ，約 200nM (例如 220nM)，約 500nM，約 ΙΟΟΟηΜ，約 2 μ M，約 5 μ M，約 10 μ Μ,約20 μ Μ,約 50 μ Μ,約 100 μ Μ,約 200 μ M 或約 500 μ Mo本文所使用的術(shù)語“足夠時間”意思是足夠長的一段時間由本文公開的培養(yǎng)基重新編程哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從數(shù)小時到約180天，例如，從8小時到約12小時，從約8小時到約24小時，從約8小時到約2天，從約8小時到約7天，從約8小時到約14天，從約8小時到約21天，從約8小時到約30天，從約8小時到約45天，從約8小時到約60天，從約8小時到約90天，從約8小時到約120天，從約8小時到約150天或從約8小時到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從I天到約180天，例如，從約I天到約2天，從約I天到約7天，從約I天到約14天，從約I天到約21天，從約I天到約30天，從約I天到約45天，從約I天到約60天，從約I天到約90天，從約I天到約120天，從約I天到約150天，或從約I天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從2天到約180天，例如，從約2天到約7天，從約2天到約14天，從約2天到約21天，從約2天到約30天，從約2天到約45天，從約2天到約60天，從約2天到約90天，從約2天到約120天，從約2天到約150天，或從約2天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從7天到約180天，例如，從約7天到約14天，從約7天到約21天，從約7天到約30天，從約7天到約45天，從約7天到約60天，從約7天到約90天，從約7天到約120天，從約7天到約150天，或從約7天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從14天到約180天，例如，從約14天到約21天，從約14天到約30天，從約14天到約45天，從約14天到約60天，從約14天到約90天，從約14天到約120天，從約14天到約150天，或從約14天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從21天到約180天，例如，從約21天到約30天，從約21天到約45天，從約21天到約60天，從約21天到約90天，從約21天到約120天，從約21天到約150天，或從約21天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從30天到約180天，例如，從約30天到約45天，從約30天到約60天，從約30天到約90天，從約30天到約120天，從約30天到約150天，或從約30天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從45天到約180天，例如，從約45天到約60天，從約45天到約90天，從約45天到約120天,從約45天到約150天,或從約45天到約180天。
在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從60天到約180天，例如，從約60天到約90天，從約60天到約120天，從約60天到約150天，或從約60天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從90天到約180天，例如，從約90天到約120天，從約90天到約150天，或從約90天到約180天。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“足夠時間”范圍從120天到約180天，例如，從約12天到約150天，或從約60天到約180天。在一些實(shí)施例中，本文提供的方法進(jìn)一步包括有規(guī)律地用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。術(shù)語“有規(guī)律地”意思是每小時一次、每兩小時一次、一天四次、一天兩次、每天一次、每兩天一次、每兩周一次，每周一次、每兩個月一次、或每月一次更換培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一方面，它提供了一種本文公開的PSCL細(xì)胞或無性系的上清。所述上清包括本發(fā)明的培養(yǎng)基和生長因子(growth factors)和/或由本文提供的PSCL細(xì)胞或無性系分泌的轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factors)。本文公開的上清對治療或減輕紊亂是有效的，就像本文公開的PSCL細(xì)胞或無性系。在一些實(shí)施例中，上清能形成一種組合物(可選擇地和載體)。所述組合物可以被應(yīng)用到哺乳動物受試者用于治療或減輕紊亂。在一些實(shí)施例中，所述組合物可以是化妝組合物或藥用組合物。多能干細(xì)胞樣細(xì)胞或無性系本文所使用的術(shù)語PSCL細(xì)胞或無性系意思是細(xì)胞，該細(xì)胞不是多能細(xì)胞但至少具有PSC特征之一。本文公開的PSCL細(xì)胞或無性系有能力在組織的生理環(huán)境中分化成想要得到的組織細(xì)胞。PSC的特征或?qū)傩栽诒绢I(lǐng)域是眾所周知的，PSC的一些特征被描述如下。PSC的公認(rèn)的特征包括它的在適當(dāng)?shù)臈l件下分化成不同組織細(xì)胞的能力。PSC的其它屬性包括，例如，表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，例如Oct-4、Sox2或Nanog或抗原，例如SSEA-4、TRA-1-60或TRA-1-81和高效表達(dá)堿性磷酸酶(ALP)。在一些實(shí)施例中，本文公開的PSCL細(xì)胞或無性系具有多能干細(xì)胞的所有屬性。在這些實(shí)施例中，所述PSCL細(xì)胞或克隆據(jù)推測是所述PSC。在一些實(shí)施例中，本文公開的PSCL細(xì)胞或克隆具有多能干細(xì)胞的屬性中的一個或多個即使不是全部。在這些實(shí)施例中，本文公開的所述PSCL細(xì)胞或無性系并不等同于PSC。這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或抗原，在例如免疫熒光染色中，可以容易地由針對這些調(diào)控因子或抗原的抗體識別。本文所使用的術(shù)語PSC也包括多能干細(xì)胞。使用的方法所述PSCL細(xì)胞或無性系可以被用于醫(yī)藥，就像用于治療或減輕哺乳動物(例如，人類或動物)中的紊亂的PSC。通常，該方法包括給予具有紊亂的受試者PSCL細(xì)胞或無性系以便治療或減輕紊亂。使用多能干細(xì)胞治療紊亂的方法在本領(lǐng)域中已被廣泛建立和熟知，因?yàn)樗鼘⒑茴愃朴谟糜谂咛ジ杉?xì)胞的協(xié)議(protocols)(參見,例如Sun, et al.，CellCycle 9:5, 880-885 (2010))。盡管還沒有被認(rèn)可的產(chǎn)品，但是有許多潛在的應(yīng)用如移植、基因修復(fù)和用于多種基因性疾病的細(xì)胞取代治療(參見，例如Gunaseelie’et al. , Curr MedChem. ;17 (8):759-766(2010))。紊亂可以為任意紊亂，這些紊亂能夠通過多能干細(xì)胞被治療或減輕。在一些實(shí)施例中，紊亂可以為退化性疾病，例如神經(jīng)組織退化的紊亂或心臟退化性疾病。 在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，心血管病、血液病、克羅恩病、骨疾病、肌病、脫發(fā)、癌癥、不孕癥或軟骨疾病，例如腺苷脫氨酶嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺乏癥(adenosine deaminase deficiency-related severe combinedimmunodeficiency) (ADA-SCID)> 舒-戴二氏綜合癥(Shwachman-Bodian-Diamondsyndrome) (SBDS), III 型戈謝(Gaucher)病(⑶)、假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne)(DMD)和貝克(Becher)型肌肉萎縮癥(BMD)、帕金森(Parkinson)病(PD)、亨廷頓(Huntington)病(HD)、青少年糖尿病(juvenile-onset)、l型糖尿病(JDM)、唐氏(Down)綜合癥(DS)/三體性21、萊施-奈恩(Lesch-Nyhan)綜合癥的攜帶狀態(tài)、阿茲海默癥或缺血性心臟病(參見例如，Gunaseelie, et al. , Curr Med Chem. ; 17 (8) : 759 - 766 (2010))。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以為視網(wǎng)膜疾病。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是對組織的創(chuàng)傷和損害。這樣的組織的例子可以是皮膚、肌肉、軟骨、筋、末梢神經(jīng)、脊髓、血管或骨頭。創(chuàng)傷的例子可以是由身體沖擊遭受的創(chuàng)傷或由醫(yī)學(xué)中的手術(shù)造成的創(chuàng)傷，例如在治療癌癥中組織的除去等。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是骨骼紊亂。在一些實(shí)施例中，所述紊亂可以是器官疾病。實(shí)施例下面的例子闡述，而不是限制本發(fā)明。對暴露于蛋白質(zhì)試劑之后iPS細(xì)胞的誘發(fā)和它的肽衍生物(例子1-15)的研究SE體細(xì)胞的直接重新編程提供了一種產(chǎn)生患者-或疾病-特定多能干細(xì)胞(patient-or disease-specific pluripotent stem cells)的可倉泛。最近，由 Yamanaka和同事的開創(chuàng)性工作確認(rèn)了核心轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)過表達(dá)時，核心轉(zhuǎn)錄因子能夠重新編程體細(xì)胞到多能性狀態(tài)(Takahashi，K. & Yamanaka, S. Cell 126,663-676(2006))。通過所述因子0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC或針對因子的不同的一組(a different set of forfactors) (0CT4、S0X2、NANOG和LIN-28)的異位表達(dá)重新編程小鼠和人類的體細(xì)胞到被誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞現(xiàn)在是可能的(Okita, K. , et al. , Nature 448, 313-317 (2007) ; Takahashi, K. , et al. , Nat Protoc 2, 3081-3089 (2007) ;Maherali, N. , et al. CellStem Cell I, 55-70 (2007) ;ffernig, M. , et al. , Nature 448，318-324 (2007) ; Yu, J.，etal.，Science 318，1917-1920(2007);Park, I. H.，et al.，Nature451, 141-146(2008);和 Lowry，W. E.，et al. , Proc Natl Acad Sci U S A 105,2883-2888(2008)。人類iPS細(xì)胞在基因表達(dá)中很類似于胚胎干細(xì)胞(ES)，具有多能性和后生狀態(tài)(印igeneticstates)，并對再生醫(yī)藥和在體外疾病建模具有較大的潛力。然而，將小瓶轉(zhuǎn)基因(vialtransgenes)整合到體細(xì)胞基因組，尤其是致癌基因，例如c-MYC和KLF，限制了 iPS細(xì)胞的實(shí)用。確實(shí)，在嵌合子小鼠中，C-Myc逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的再活化促進(jìn)來源于iPS細(xì)胞的腫瘤的形成(Okita, K. , et al. , Nature 448, 313-317 (2007);和 Nakagawa, Μ·，et al. , NatBiotechnol 26, 101-106 (2008)) 0通過優(yōu)化重新編程方法，用一些取代一些轉(zhuǎn)錄因子的小分子化學(xué)物質(zhì)重新編程小鼠和人類的體細(xì)胞現(xiàn)在是可能的。(Nakagawa, M.，et al.，NatBiotechnol 26, 101-106 (2008);Lowry, ff. E. &Plath, K. , Nat Biotechnol 26,1246-1248 (2008);Huangfu, D. , et al. , Nat Biotechnol 26,1269-1275 (2008);Huangfu, D. , et al. , Nat Biotechnol 26,795-797 (2008);和 Maherali，N.，et al., Cell Stem Cell3，340-345 (2008))。然而，至少一些轉(zhuǎn)錄因子，例如0CT4，不得不被整合(Nakagawa, Μ.，etal. , Nat Biotechnol26, 101-106(2008);Lowry, ff. E. & Plath, Κ. , Nat Biotechnol 26,1246-1248 (2008);Huangfu,D.,et al. , Nat Biotechnol 26，1269-1275(2008);Huan gfu,D.,et al. , Nat Biotechnol 26,795-797(2008);和 Maherali, N.，et al. , CellStem Cell 3，340-345 (2008))。因此，針對iPS的應(yīng)用，安全問題仍然存在。另外，轉(zhuǎn)基因過程借助大量的確認(rèn)和表征iPS每個方法的選擇(Takahashi, K. &Yamanaka, S. , Cell126，663-676 (2006);Lowry, ff. E. &Plath, Κ.，Nat Biotechnol 26，1246-1248(2008);Huangfu, D. , et al.，Nat Biotechnol 26, 1269-1275(2008);Huangfu, D. , et al. , NatBiotechnol26,795-797(2008);Maherali,N. ,et al., Cell Stem Cell 3, 340-345 (2008);和Takahashi, K. , et al. ,Cell 131,861-872(2007)),轉(zhuǎn)基因過程是非常耗時間的。對臨床實(shí)踐，產(chǎn)生iPS的新方法是更安全和更有效，該方法在下面的例子中被建立。纖維調(diào)節(jié)素(FMOD)是小分子富含亮氨酸的間質(zhì)蛋白多糖(member of smallleucine rich proteoglycan) (SLRP)中的成員之一。FMOD是具有表達(dá)特征的細(xì)胞溶質(zhì)分泌蛋白(cytosolic secreted protein),其主要被限制在結(jié)締組織和富含膠原蛋白的組織，如軟骨、骨頭、筋和皮膚(Heinrich, W.，et al. , FEBS Lett 16，63-67 (1971);和Heinegard, D. , et al. , Pathol Immunopathol Res 1988;7(1-2):27-317，27-31(1988))。纖維調(diào)節(jié)素被涉及到原纖維形成、細(xì)胞粘著和細(xì)胞因子活性調(diào)節(jié)(cytokine activitymodulation)中(Hildebrand, A.，et al. , Biochem J 302，527-534 (1994);Zheng, Ζ·，etal. , Wound Repair and Regeneration 16，A28-A28(2008);Zheng, Z.，et al. , J Am CollSurgeons 211，S127-S127 (2010);和 Zheng, Z.，et al. , Journal of InvestigativeDermatology 131，769-778 (2011))。先前的研究已經(jīng)表明FMOD可以既與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-P亞型又和膠原蛋白結(jié)合以便調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞外基質(zhì)的分布(Hildebrand,A.,et al. , Biochem J 302，527-534(1994);Zheng,Z.，et al. , WoundRepair and Regeneration 16,A28-A28 (2008);Zheng, Z. , et al. , J Am Coll Surgeons211,S127-S127(2010);Hedbom, E. & Heinegard, D. , J Biol Chem 1989Apr25;264(12):6898-905264, 6898-6905(1989);和 Kalamajski, S. & Oldberg, A. , Journal of BiologicalChemistry 282，26740-26745(2007))。最近，F(xiàn)MOD被發(fā)現(xiàn)是對多能干細(xì)胞的合適環(huán)境(niche environment)的關(guān)鍵成分(Bi, Y. , et al. , Nat Med 13,1219-1227(2007))。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)暴露于 FMOD 之后，大鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞系大鼠-2形成了具有胚胎干細(xì)胞形貌的無性系(實(shí)施例1，圖1)，這表明FMOD有誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的潛力。實(shí)施例I在這個實(shí)施例中，暴露于FMOD之后，大鼠-2成纖維細(xì)胞形成了具有胚胎干細(xì)胞(ES)形貌的無性系。圖Ia顯示的是未經(jīng)過FMOD處理的大鼠-2，圖Ib大鼠-2被暴露于200nM FMOD 一周的結(jié)果。實(shí)施例2-3在例子2-3中，三種人類細(xì)胞包括人類新生兒包皮皮膚成纖維細(xì)胞BJ細(xì)胞(ATCC, CRL-2522)、人類胎兒肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞(ATCC，CCL-171)和正常人類成人皮·膚成纖維細(xì)胞NHDF細(xì)胞(Lonza Group Ltd.)被用于核實(shí)這種現(xiàn)象。暴露于FMOD三到四周之后，這三種細(xì)胞都能形成了 ES樣的無性系(圖2-3)。圖2a_2c顯示的是人類新生兒包皮皮膚成纖維細(xì)胞BJ細(xì)胞(a)被播種在24孔板中，且在轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞上之前用200nM FMOD w/o血清處理三周(用6000拉德(rads)的Y輻照處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，GlobalStem)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每天更換培養(yǎng)基，ES樣無性系用針對iPS表征的堿性磷酸酶(AP)染色(c)被觀察(b)。每20，000起始被播種的BJ細(xì)胞，形成6-8個無性系。標(biāo)尺200 μ m。圖3a和圖3b顯示的是人類胎兒肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞(a)和人類正常成人皮膚成纖維細(xì)胞NHDF細(xì)胞(b)被播種在24孔板中，并在轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞上之前用無血清的200nM FMOD處理四周的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每天更換培養(yǎng)基，ES樣無性系被觀察(b)，每50，000起始被播種的BJ細(xì)胞，形成4-10個無性系。實(shí)施例4為進(jìn)一步證實(shí)，在暴露于FMOD之前，用包括編碼與Nanog促進(jìn)劑[BJ(Nanog-EGFP)細(xì)胞]結(jié)合的增強(qiáng)型綠色突光蛋白(enhanced green fluorescent protein) (EGFP)的基因的慢病毒，預(yù)轉(zhuǎn)染BJ細(xì)胞。經(jīng)過三周的FMOD處理之后，BJ(Nanog-EGFP)細(xì)胞也形成了具有EGFP表達(dá)的ES樣無性系，它表明Nanog基因在這些FMOD誘導(dǎo)的iPS (FiPS)細(xì)胞中被強(qiáng)烈地表達(dá)，正像由Yamanaka或Thomson因子的異位表達(dá)誘導(dǎo)的其它iPS (Takahashi, K. &Yamanaka, S. , Cell 126,663-676(2006);Yu, J. , et al. , Science 318,1917-1920(2007);和 Takahashi, K.，et al. , Cell 131,861-872(2007))。圖4顯示的是在暴露于FMOD之前，用包括編碼與Nanog促進(jìn)劑[BJ (Nanog-EGFP)細(xì)胞]結(jié)合的EGFP的基因的慢病毒，預(yù)轉(zhuǎn)染人類新生兒包皮皮膚成纖維細(xì)胞BJ細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞上之前，每天更換培養(yǎng)基。ES樣無性系用EGFP表達(dá)被觀察。實(shí)施例5和6通過免疫熒光染色，用針對人類iPS細(xì)胞的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(NAN0G和0CT4S0X2)的抗體和在所有人類多能細(xì)胞(SSEA4、TRA-l-60和TRA-1-81)的細(xì)胞表面上被表達(dá)的抗原，從BJ細(xì)胞(BJ-FiPS)誘導(dǎo)出的FiPS細(xì)胞進(jìn)一步被識別(圖5)。RT-PCR靶向人類iPS細(xì)胞的關(guān)鍵iPS標(biāo)記也作為第二證據(jù)被執(zhí)行(圖6)。
圖5顯示的是通過免疫熒光染色，用針對人類iPS細(xì)胞的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(NAN0G和0CT4S0X2)的抗體和在所有人類多能細(xì)胞(SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的細(xì)胞表面上被表達(dá)的抗原，BJ-FiPS細(xì)胞進(jìn)一步被識別。標(biāo)尺200 μ m。圖6顯示的是BJ-FiPS細(xì)胞進(jìn)一步被RT-PCR識別。未處理的BJ細(xì)胞被用作對照。用于iPS表征(S0X2、0CT4、NANOG和hTERT)、外胚層標(biāo)記(KRT-18和巢蛋白)、內(nèi)胚層標(biāo)記(AFP和GATA-4)，中胚層標(biāo)記(FLT-1，BMP-4和VE-Cadherin)的引物被用做針對β -肌動蛋白的對照引物。實(shí)施例7和8在懸浮培養(yǎng)中，使用AggreWell 800協(xié)議(StemCell)，BJ-FiPS形成了胚胎體(EBs)(圖7)。再者，免疫染色顯示了 BJ-FiPS EBs 一貫地表達(dá)iPS標(biāo)記，例如NAN0G、0CT4和S0X2以及外胚層和中胚層標(biāo)記(圖8)，它表明了 BJ-FiPS細(xì)胞的多能性。圖7顯示的是在懸浮培養(yǎng)中，使用AggreWell 800協(xié)議表達(dá)，BJ-FiPS形成了胚胎·體(EBs) ο 標(biāo)尺200 μ m。圖8a_8c顯示的是經(jīng)過14天懸浮培養(yǎng)后，免疫染色顯示了 BJ-FiPS EBs用iPS標(biāo)記(a)以及和外胚層(b)和中胚層標(biāo)記(C)表達(dá)。實(shí)施例9為進(jìn)一步證明BJ-FiPS細(xì)胞的多能性，體外分化試驗(yàn)被采用。首先，BJ-FiPS細(xì)胞被轉(zhuǎn)移入含有10%胎牛血清(FBS)，50g/ml抗壞血酸，IOmM β -甘油磷酸酯和10_8Μ地塞米松的a-MEM培養(yǎng)基中21天。每隔三天培養(yǎng)基被更換。茜素紅(Alizarin Red S)染色顯示BJ-FiPS細(xì)胞能夠分化成造骨細(xì)胞(中胚層細(xì)胞)(圖9)。圖9顯示的是BJ-FiPS細(xì)胞在體外分化成造骨細(xì)胞。骨頭結(jié)節(jié)被茜素紅染色。實(shí)施例10-13體外分化中的類似物由從NHDF細(xì)胞(NDHF-FiPS)誘導(dǎo)出的FiPS細(xì)胞證實(shí)(圖10)。再者，當(dāng)FiPS細(xì)胞被注入到SCID-小鼠睪丸中，在體內(nèi)，該細(xì)胞分化成骨組織(圖11)。另外，F(xiàn)iPS細(xì)胞能夠分化成脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞，兩者都是中胚層細(xì)胞(圖12-13)。圖10顯示的是在體外，NHDF-FiPS細(xì)胞分化成造骨細(xì)胞。骨頭結(jié)節(jié)被茜素紅染色。圖11顯示的是在SCID-小鼠睪丸中，F(xiàn)iPS細(xì)胞分化成骨組織。圖12顯示的是FiPS細(xì)胞被轉(zhuǎn)移入脂肪生成培養(yǎng)基(Lonza)中21天。培養(yǎng)基每隔三天被更換。油紅染色(Oil Red)顯示了 BJ-iPS細(xì)胞可以在體外分化成脂肪細(xì)胞。圖13a和圖13b顯示的是BJ-FiPS細(xì)胞被轉(zhuǎn)移入DMEM/F12 (I: I)培養(yǎng)基中，四天懸浮培養(yǎng)以便形成EBs，DMEM/F12(l:l)培養(yǎng)基由20%FBS、ImM谷氨酸鹽、O. ImM非必需氨基酸和O. ImM 2-巰基乙醇(EB20培養(yǎng)基)供給。接著，EBs細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到明膠涂層板上培養(yǎng)十天以便體外心肌細(xì)胞分化。心肌細(xì)胞由平滑肌肌動蛋白(SM) (a)的免疫染色、心肌肌鈣蛋白(cTNT)和轉(zhuǎn)錄因子NKX2. 5(b)表征。細(xì)胞核是用DAPI被計數(shù)染色，標(biāo)尺100 μ m。實(shí)施例14-15實(shí)施例14和15顯示的是不僅iPS細(xì)胞能夠分化成多個中胚層組織，起源于成纖維細(xì)胞的FiPS細(xì)胞也能分化成外胚層(圖14)和內(nèi)胚層細(xì)胞(圖15)。圖14a和圖14b顯示的是BJ-FiPS EBS在基因敲除(Konckout) DMEM培養(yǎng)基中被懸浮培養(yǎng)8天，基因敲除DMEM培養(yǎng)基由10%基因敲除血清、2mM谷氨酸鹽、10 μ M全反式維甲酸(RA)和IOOnM人類音速克刺猬(human sonic hedgehog) (Shh)的N-末端活性片段供給。RA每天被重新供給，且每隔兩天整個懸浮培養(yǎng)基被更換。之后，被誘導(dǎo)的EBs被轉(zhuǎn)移到具有DMEM/F12 (I: I)培養(yǎng)基的多聚-鳥氨酸/纖維蛋白連接素涂層板上，用于神經(jīng)細(xì)胞分化，DMEM/F12 (I: I)培養(yǎng)基由 N2,⑶NF，BDNF, CNTF, B27 和 2%FBS 供給。三天后，BJ-FiPS 分化成神經(jīng)細(xì)胞(外胚層細(xì)胞)，該神經(jīng)細(xì)胞通過β III-微管蛋白(a)的免疫染色和谷氨酸鹽受體I (GRIAl) (b)表征。細(xì)胞核是用DAPI被計數(shù)染色，標(biāo)尺100 μ m。圖15a和圖15b顯示的是在RPMI 1640培養(yǎng)基中，暴露于100ng/ml重組活化素A后，飼養(yǎng)細(xì)胞上的BJ-FiPS細(xì)胞生長向內(nèi)胚層細(xì)胞分化四天，由α-胎蛋白(AFP) (a)的免疫染色表征，該培養(yǎng)基由2%FBS和2mM谷氨酸鹽供給。之后，在RPMI 1640培養(yǎng)基中，BJ_FiPS培養(yǎng)另外八天,保存于胰腺世系細(xì)胞(pancrease lineage cell)的體外分化中，由胰腺/十二指腸同源框I (PDXl) (b)表征，RPMI 1640培養(yǎng)基由2%FBS和2mM谷氨酸鹽供給，沒有活化素A,。細(xì)胞核是用DAPI被計數(shù)染色,標(biāo)尺100 μ mo 因此，F(xiàn)iPS細(xì)胞表現(xiàn)出多能性是清晰的。另外，體內(nèi)試驗(yàn)表明FiPS細(xì)胞將不會誘導(dǎo)腫瘤形成(圖11)。因此，用暴露于FMOD誘導(dǎo)iPS細(xì)胞和它的肽衍生物，將是更安全和更好的直接重新編程體細(xì)胞的方法。盡管上述發(fā)明通過說明和用于理解清晰目的的例子被相當(dāng)詳細(xì)地描述了，應(yīng)該理解為，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，某些適應(yīng)性修改是路線優(yōu)化問題，在不脫離本發(fā)明精神，或權(quán)利要求的范圍的前提下，可被實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，其包括纖維調(diào)節(jié)素(FMOD)或它的衍生物或片段，其特征在于，所述組合物對重新編程細(xì)胞以便形成多能干細(xì)胞樣(PSCL)無性系是有效的， 其中，所述PSCL無性系，在免疫熒光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或 TRA-1-181 的抗體識別。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，其特征在于，所述FMOD是FMOD蛋白質(zhì)或肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，其特征在于，所述FMOD具有濃度從約.200nM 到約 800nM。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞，小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞。
5.一種方法，其包括 用細(xì)胞培養(yǎng)基處理哺乳動物細(xì)胞從一天到一個月的一段時間，和 有規(guī)律地更換細(xì)胞培養(yǎng)基直至多能干細(xì)胞樣(PSCL)無性系形成； 其中，所述培養(yǎng)基包括纖維調(diào)節(jié)素(FMOD)或它的衍生物或片段， 其中，所述組合物對重新編程細(xì)胞以便形成PSCL無性系是有效的，和其中，所述PSCL無性系，在免疫熒光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或 TRA-1-181 的抗體識別。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述FMOD是FMOD蛋白質(zhì)或肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述FMOD具有濃度從約200nM到約.800nMo
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞。
9.一種多能干細(xì)胞樣(PSCL)無性系，其由一種方法產(chǎn)生，所述方法包括 用細(xì)胞培養(yǎng)基處理哺乳動物細(xì)胞從一天到一個月的一段時間，和 有規(guī)律地更換細(xì)胞培養(yǎng)基直至多能干細(xì)胞樣(PSCL)無性系形成； 其中，所述培養(yǎng)基包括纖維調(diào)節(jié)素(FMOD)或它的衍生物或片段， 其中，所述組合物對重新編程細(xì)胞以便形成PSCL克隆是有效的，和其中，所述PSCL無性系，在免疫熒光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或 TRA-1-181 的抗體識別。
10.根據(jù)權(quán)利權(quán)利要求9所述的PSCL無性系，其特征在于，所述FMOD是FMOD蛋白質(zhì)或肽。
11.根據(jù)權(quán)利權(quán)利要求9所述的PSCL無性系，其特征在于，所述FMOD具有濃度從約.200nM 到約 800nM。
12.根據(jù)權(quán)利權(quán)利要求9所述的PSCL無性系，其特征在于，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞，小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞。
13.一種治療哺乳動物中的紊亂的方法，其包括給予哺乳動物權(quán)利要求9-12任一項所述的多能性干細(xì)胞樣(PSCL)無性系。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人類。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述紊亂是神經(jīng)組織退化的紊亂。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述紊亂是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病、心血管病、血液病、克羅恩病、骨疾病、肌病或軟骨疾病。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述紊亂是視網(wǎng)膜疾病。
18.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述紊亂是對組織的創(chuàng)傷和損害。
19.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述紊亂是骨骼疾病。
20.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述紊亂是器官疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述紊亂是對皮膚、肌肉、軟骨、筋、末梢神經(jīng)、脊髓、血管或骨頭的傷害。
22.—種上清,其包括權(quán)利要求1-5任一項所述的培養(yǎng)基。
23.一種組合物，其包括權(quán)利要求22所述的上清。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，所述組合物是藥物或化妝組合物。
25.一種治療或減輕紊亂的方法，其包括給予哺乳動物受試者權(quán)利要求22所述的上清或權(quán)利要求23所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了多能性干細(xì)胞樣(PSCL)細(xì)胞或無性系、培養(yǎng)基和它的上清和生產(chǎn)和使用多能干細(xì)胞的方法。
文檔編號C07K14/47GK102892879SQ201180023880
公開日2013年1月23日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者康·汀, B·嘉·蘇, 中·鄭 申請人:加州大學(xué)董事會