專利名稱：具有止血活性的荷有組織因子的富含磷脂的囊泡及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般來說，本發(fā)明涉及使用基于組織因子的促凝血劑治療受試者中的出血和傷口愈合。更具體而言，本發(fā)明涉及包含以微囊泡形式的真核細(xì)胞衍生膜和組織因子蛋白質(zhì)和負(fù)電荷磷脂(NCP)的荷有組織因子的微囊泡(荷有TF的微囊泡)，以及其作為促凝血劑用于治療受試者中的出血以及促進(jìn)血管生成和細(xì)胞遷移的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生所述荷有TF的微囊泡的方法。
背景技術(shù)：
止血是生物借助于其響應(yīng)出血且涉及兩個過程的參與的機(jī)制，所述兩個過程在損傷后立即變得有功能且長時間段保持活性。其中第一個稱為初次止血并且特征在于血管性損害部位血管收縮的出現(xiàn)和血小板聚集體形成。第二個稱為二次止血，是其中由于不同凝血級聯(lián)蛋白水解酶作用形成纖維蛋白凝塊的時期。
都稱為凝血因子的幾種輔因子和蛋白水解酶參與血液凝固過程的第二個時期，并且它由幾個時期組成，所述時期以來自由于凝血酶作用的纖維蛋白原水解的纖維蛋白形成結(jié)束。凝血酶先前通過脫輔基酶凝血酶原的蛋白酶解水解形成。這種蛋白酶解通過活化凝血因子X (FXa)執(zhí)行，其與活化血小板的表面結(jié)合，并且僅在其輔因子活化凝血因子V(FVa)和鈣離子的存在下，并且能夠水解凝血酶原。凝血因子X (FX)活化可以以兩個分開途徑一一內(nèi)源性途徑和外源性途徑出現(xiàn)。內(nèi)源性途徑由在其中水解每種酶原的一系列反應(yīng)組成，獲得其活性蛋白酶形式。在每個步驟中，新近形成的蛋白水解酶將催化隨后酶原的作用，以相繼獲得活性形式。在血液凝固外源性途徑中，在損害部位處的外膜細(xì)胞上表達(dá)的組織因子(TF)與循環(huán)凝血因子VII/活化凝血因子VII (FVII/FVIIa)結(jié)合，以形成TF: :FVIIa復(fù)合物，并且在鈣的存在下，充當(dāng)?shù)孜?，從而使得FX活化發(fā)生。外源性途徑目前認(rèn)為是血液凝固中的最相關(guān)途徑，并且公認(rèn)在通過血管損害產(chǎn)生的出血事件中，由于涉及TF與其配體FVII/FVIIa的相互作用的外源性途徑活化而觸發(fā)凝血。已廣泛公認(rèn)TF是負(fù)責(zé)凝血由其起始的快速性的主要元件，并且它是FX活化所需的,這依次開始凝血酶原水解。已報道了來自多個組織的TF的純化，例如人腦，牛腦；人胎盤；綿羊腦；和肺。廣泛公認(rèn)雖然在物種之間的TF蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中存在差異，但如通過體外凝血測定法測量的，不存在功能差異。廣泛公認(rèn)為了顯示生物學(xué)活性，TF必須在體外與磷脂結(jié)合。已顯示例如通過使用磷脂酶去除TF的磷脂組分導(dǎo)致其在體外生物學(xué)活性的喪失。W02008080989描述包含酵母膜和組織因子蛋白質(zhì)的荷有組織因子的酵母衍生的微囊泡，及其作為促凝血劑在治療受試者中的出血中的用途。W02006004675描述組織因子在植物細(xì)胞中的表達(dá)，得自表達(dá)TF的植物的粗提取物和包含得自植物細(xì)胞的重組TF的人工囊泡。EP 19359021描述組織因子在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)以及含有在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的重組TF的再脂質(zhì)化的TF。然而，本領(lǐng)域存在關(guān)于基于TF的另外的促凝劑制備物的需要。發(fā)明概述在第一個方面，本發(fā)明涉及用于制備具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括(i)在真核細(xì)胞中表達(dá)具有促凝活性的TF或其變體，(ii)從步驟(i)的細(xì)胞中回收荷有TF的微囊泡，和(iii)在足以將所述磷脂摻入所述囊泡內(nèi)的條件下，使步驟(ii)中獲得的囊泡與負(fù)電荷磷脂接觸。在第二個方面，本發(fā)明涉及用于制備具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括( i )提供得自真核細(xì)胞的脂質(zhì)微囊泡，(ii)在足以將所述TF蛋白質(zhì)或其變體摻入所述微囊泡內(nèi)的條件下，使具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其變體與如(i)中定義的脂質(zhì)微囊泡接觸，和(iii)在足以將所述磷脂摻入所述囊泡內(nèi)的條件下，使步驟(i i )中獲得的囊泡與負(fù)電荷磷脂接觸，其中步驟(i i )和(i i i )可以以任何次序執(zhí)行。在另一個方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的方法獲得的荷有TF的微囊泡。在另外一個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的荷有TF的微囊泡和藥學(xué)可接受的媒介物的藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含下述的藥物組合物，(i)通過包括下述步驟的方法獲得的微囊泡a)在真核細(xì)胞中表達(dá)具有促凝活性的TF或其功能等價變體，和b)從步驟(a)的細(xì)胞中回收荷有TF的微囊泡，(ii)至少凝血促進(jìn)劑,和(iii)藥學(xué)有效的媒介物。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于用作藥物的本發(fā)明的荷有TF的微囊泡或本發(fā)明的藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于在治療出血中使用、用于促進(jìn)傷口愈合或用于治療血管生成相關(guān)疾病的本發(fā)明的荷有TF的微囊泡或本發(fā)明的藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的荷有TF的微囊泡用于測定樣品中的凝血酶原時間的用途。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于測定抗凝治療因子的試劑盒，其包含本發(fā)明的微囊泡。附圖簡述圖I通過TT-173提取物的rTF表達(dá)。來自四次獨立切向流過濾的純化TT-173(MFR O. I)的提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。使印跡與人純化的小鼠抗體(BD BiosciencesPharmingen)反應(yīng)。以kDa表示的分子量標(biāo)記顯示于該圖的左側(cè)。圖2.在與PS —起溫育后TT-173的促凝活性。A.-為了測試PS對TT-173生物活性的作用，將PS (O. ImM)加入TT-173 (ImL)中，并且在實驗過程中將混合溶液維持在R/To在該圖表不的不同時間點，將混合物的一個等分試樣(10μ I)加入含有130μ1正常貧血小板血漿的加溫比色杯中。立即加入20 μ I氯化鈣(100禮)，并且借助于凝血計(Stago)測定凝血時間(以秒表示)。實驗在300秒后停止(來自5個供體的合并血漿)。B.-如A中所述獲得的結(jié)果也表示為單位/mL。I個單位定義為在標(biāo)準(zhǔn)凝血測量測定法(130 μ I血漿、20 μ I氯化鈣(IOOmM)和10 μ I產(chǎn)物)中在30秒內(nèi)使正常合并血漿凝固所需的ΤΤ-173量。圖3.在與不同濃度的PS—起溫育后，ΤΤ-173或脂質(zhì)化rTF的促凝活性。為了測試PS對TT-173或再脂質(zhì)化的rTF生物活性的作用，將PS (以該圖中指示的濃度)加入TT-173 (ImL)或再脂質(zhì)化的rTF中。兩種混合溶液都在R/T維持2小時。在這個時間后，將每種混合物的一個等分試樣(10 μ L)加入含有130 μ I正常貧血小板血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20 μ I氯化鈣(lOOmM)，并且借助于凝血計(Stago)測定凝血時間(以秒表示)。實驗在300秒后停止(來自5個供體的合并血漿)。獲得的結(jié)果表示為單位/mL。
圖4.當(dāng)嵌入合適的磷脂囊泡內(nèi)時，rTF的促凝活性。根據(jù)由Mimms等人(Biochemistry 20,833. 1981)描述的標(biāo)準(zhǔn)化方法,將商業(yè)純化的rTF再脂質(zhì)化到含有磷脂酰膽堿/磷脂酰絲氨酸(PC/PS)的囊泡內(nèi)。簡言之,使IOOng rTF (American DiagnosticaInc. Stanford, CT, USA)與下述一起溫育:以所示 PC:PS 比例(100:0、95: 5、90:10、80:20、70:30) (2. 6mM 終濃度)的 PC/PS (Sigma Aldrich Inc, SaintLouis, MO, USA)，和去污劑(N-辛基-β -D-卩比喃半乳糖苷(galactopiranoside),40mM終濃度)。將混合物勻衆(zhòng)化，并且廣泛透析(在48小時過程中，伴隨幾次緩沖液更換)。通過這個程序，緩慢去除去污劑，并且自發(fā)產(chǎn)生含有rTF的脂質(zhì)微團(tuán)。在這個再脂質(zhì)化程序后，就其促凝活性(藍(lán)色條)測試含rTF微團(tuán)。平行地，將不同的含rTF微團(tuán)與以0. ImM終濃度的PS —起溫育2小時。在這個時間后，還就促凝活性測試含有額外PS的微團(tuán)。凝血測量分析如下執(zhí)行將具有PC/PS囊泡量的再脂質(zhì)化的rTF的等分試樣(10 μ I)加入含有130 μ I正常貧血小板血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20 μ I氯化I丐(IOOmM),并且借助于凝血計(Diagnostica Stago, Inc.NJ, USA)測定凝血時間(以秒表示)。圖5. PS添加對不同含rTF囊泡的作用。在4°C制備來自下述任一的兩個等分試樣(各2mL) :i)以80:20的PC:PS濃度比的再脂質(zhì)化的rTF，ii)以70:30的PC:PS濃度比的再脂質(zhì)化的rTF，或iii)從表達(dá)TF的重組酵母中分離的TT-173囊泡。將以0. ImM濃度的PS加入每種含rTF囊泡的等分試樣之一中，并且在R/T溫育2小時。在這個時間過程中，另一個等分試樣維持在4°C。在那之后，如圖例I中所述就促凝活性測試來自每種含rTF囊泡的兩個等分試樣。圖6.在與PS和不同濃度的TT-100 —起溫育后，再脂質(zhì)化的rTF的促凝活性。將與PS (0. ImM)和不同濃度的TT-100 (0,0. 03,0. 1,0. 3和0. 36mg/ml) 一起溫育2小時的再脂質(zhì)化的rTF (0. 3yg/ml)的等分試樣(10 μ I)加入含有130 μ I正常貧血小板血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20μ I氯化鈣(lOOmM)，并且借助于凝血計測定凝血時間(以
秒表不)。圖7. FVIIa的酰胺分解(Amidolytic)活性。為了定量TF = FVIIa催化復(fù)合物的酶促活性，使用底物S-2238執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)生色測定法。通過在底物S-2238和所得到的加工產(chǎn)物對硝基苯胺(pNA)之間在吸光度(光密度)中的差異測量TF = FVIIa活性。pNA形成的速率與酶促活性成比例，并且它方便地用光度計進(jìn)行測定。在這個實驗中，通過其與FVIIa相互作用和在S-2238的存在下產(chǎn)生可檢測pNA的能力，測試含或不含PS的不同濃度的TT-173。圖8.在全血中的TT-173凝固活性和PS的作用。測試含或不含PS (O. ImM)的TT173使健康血漿和全血樣品凝血的能力。A)將TT 173和與PS (終濃度O. ImM) 一起溫育2小時的TT 173的等分試樣(10 μ I)加入含有130 μ I正常貧血小板血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20μ I氯化鈣(lOOmM)，并且借助于凝血計測定凝血時間(以秒表示)。(來自5個供體的血漿庫)。B)將含有該圖中表示的rTF量的TT-173或TT-173+PS (O. ImM)的等分試樣(200μ I)加入從健康供體中最近提取的血液的等分試樣(800μ I)中。借助于記時計測量從血液提取開始直到出現(xiàn)穩(wěn)定和良好固化的凝塊的凝血時間。Ν=3。圖9· ΤΤ-173的作用的假定機(jī)制。

圖10.在缺乏凝血因子VIII、IX或XI的血漿中的ΤΤ-173凝固活性。(A)將TT173或TT 173+PS (O. ImM)的等分試樣(10 μ I)加入含有130 μ I正常貧血小板血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20μ I氯化鈣(lOOmM)，并且借助于凝血計測定凝血時間(以秒 表示)。(來自5個供體的血漿庫)。(B)將如A中所述的相似等分試樣(10μ I)加入含有130 μ I因子VIII、因子IX或因子XI耗盡血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20 μ I氯化鈣(IOOmM)，并且借助于凝血計測定凝血時間(以秒表示)。(Ν=3 )。圖11.在缺乏凝血因子V或VII的血漿中的ΤΤ-173凝固活性。(A)將TT 173或TT 173+PS (0. ImM)的等分試樣(10 μ I)加入含有130 μ I因子V或因子VII耗盡血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20μ I氯化鈣(lOOmM)，并且借助于凝血計測定凝血時間(以秒表示)。(N=3)。圖12.在華法林處理的血漿中的TT-173凝固活性。(A)將TT 173或TT 173+PS(O. ImM)的等分試樣(10μ I)加入含有130μ I因子V或因子VII耗盡血漿的加溫比色杯中。之后立即加入20 μ I氯化鈣(lOOmM)，并且借助于凝血計測定凝血時間(以秒表示)。(N=3)。圖13. TT-173的重構(gòu)在促凝活性中的作用。當(dāng)通過用可透析去污劑處理分裂含和不含PS添加的TT-173囊泡，并且隨后在體外通過透析重構(gòu)時，喪失約50%的最初活性(小圖A)。然而，當(dāng)使用再脂質(zhì)化的rTF囊泡完成相似實驗時，在透析前和后未觀察到可觀差異(小圖B)。圖14. PS添加對不同含rTF囊泡的作用。在4°C制備來自下述任一的兩個等分試樣(各2mL) :i)以80:20的PC:PS濃度比的再脂質(zhì)化的rTF，ii)以70:30的PC:PS濃度比的再脂質(zhì)化的rTF，iii)從表達(dá)TF的重組酵母中分離的TT-173囊泡，或iiii)從由表達(dá)的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中分離的TT-173囊泡。將以0. ImM濃度的PS加入每種含rTF囊泡的等分試樣之一中，并且在R/T溫育2小時。在這個時間過程中，另一個等分試樣維持在4°C。在那之后，如圖例I中所述就促凝活性測試來自每種含rTF囊泡的兩個等分試樣。圖15. PS的添加對TT-173囊泡提供穩(wěn)定性。在這個研究中使用來自三批獨立的TT-173的四個等分試樣，各10mL。來自每個批次的兩個等分試樣與PS (0. ImM)—起在R/T溫育兩小時，并且將等分試樣的剩余部分維持在4°C。在這個時間后，根據(jù)圖I的圖例中所述的程序，來自十二個TT-173樣品的各10 μ L用于測定凝固活性(時間0)。之后立即將一半等分試樣(3個TT-173 - PS和3個TT-173+PS，其各自對應(yīng)于三個批次之一)在穩(wěn)定性實驗的剩余部分過程中維持在4°C，并且將剩余部分(3個TT-173 - PS和3個TT-173+PS)維持在20°C。在該圖中的指示時間，來自每個等分試樣的IOyL用于測定維持在4°C (A)或200C (B)的等分試樣的凝固活性。結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)差一起標(biāo)繪。還顯示了在4°C (C)和20°C(D)的不同分批中的最低限度穩(wěn)定性平均值。圖16. FVII、FVIIa, FX和FXa的添加擴(kuò)增TT-173的促凝作用。將不同濃度的FVII (20nM 和 60nM)、FVIIa (20nM 和 60nM)、FX (IOOOnM 和 3000nM)和 FXa (IOOOnM)力口入TT-173+PS O. I (mM)中。在以TF在血漿中45ng/ml的終濃度的標(biāo)準(zhǔn)凝血測量測定法中，就凝固活性檢查 TT-173+PS O. I (mM)/FVII、TT-173+PS O. I (mM)/FVIIa、TT-173+PSO. I (mM)/FX和TT-173+PS O. I (mM)/FXa混合物的等分試樣。如所示的，F(xiàn)VII、FVIIa和FX的添加使凝血時間減少約2秒，并且FXa的添加使凝血時間減少約7秒。發(fā)明詳述
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在不存在去污劑的情況下，對衍生自酵母細(xì)胞且已含有PS的荷有TF的微囊泡添加額外的磷脂酰絲氨酸(PS)，令人驚訝地導(dǎo)致所述囊泡的促凝活性改善以及所述囊泡的穩(wěn)定性增加。增加的促凝性質(zhì)可以例如在本發(fā)明的實施例2和3中所示的實驗中觀察到，在其中明確顯示對包含TF的酵母衍生的微囊泡添加磷脂酰絲氨酸導(dǎo)致就未與磷脂接觸的囊泡而言，囊泡顯示增加的促凝性質(zhì)(減少的凝血時間)(參見例如圖2和表2)。不希望受任何理論束縛，認(rèn)為PS與荷有TF的微囊泡相互作用，導(dǎo)致囊泡召募涉及凝血酶原酶和X酶復(fù)合物形成的血漿因子的能力增加，這依次導(dǎo)致增加的凝血酶產(chǎn)生。囊泡的穩(wěn)定性增加例如顯示于本發(fā)明的實施例4中，在其中顯示用PS預(yù)處理的囊泡顯示在20°C和4 °C都增加的穩(wěn)定性。發(fā)明的第一種方法在第一個方面，本發(fā)明涉及用于制備具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法(下文本發(fā)明的第一種方法)，其包括( i )在真核細(xì)胞中表達(dá)具有促凝活性的TF或其變體，(ii)從步驟(i)的細(xì)胞中回收荷有TF的微囊泡，和(iii)在足以將所述磷脂摻入所述微囊泡內(nèi)的條件下，使步驟(ii)中獲得的微囊泡與負(fù)電荷磷脂(NCP)接觸。如本文使用的，術(shù)語“荷有TF的微囊泡”指任何脂質(zhì)微囊泡，其含有整合在所述脂質(zhì)微囊泡中的TF且衍生自真核細(xì)胞。脂質(zhì)微囊泡指小且閉合的區(qū)室，其基本上由脂質(zhì)單或雙層組成。本發(fā)明的荷有TF的微囊泡的尺寸可以在相對寬的范圍內(nèi)改變，通常，所述尺寸等于或低于10 μ m, 一般等于或低于O. 5 μ m。在特定實施方案中，本發(fā)明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡的尺寸范圍為10-0. 01 μ m。微囊泡通過來自真核細(xì)胞的脂質(zhì)膜或其片段形成。一般而言，膜指厚度形成細(xì)胞的邊界(即細(xì)胞或質(zhì)膜)或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的邊界的少數(shù)分子(脂質(zhì)和蛋白質(zhì))組構(gòu)層。一般地，膜由蛋白質(zhì)可以嵌入其中的兩個定向脂質(zhì)層(即脂質(zhì)雙層)組成。其為細(xì)胞膜的基本結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)雙層通常由水環(huán)境中的兩性分子(例如磷脂、脂肪酸等)形成，每個分子由在層外的親水基團(tuán)和層內(nèi)部的疏水基團(tuán)定向。在第一個步驟中，本發(fā)明的第一種方法包括在真核細(xì)胞中表達(dá)具有促凝活性的TF或其變體。
“真核細(xì)胞”在本發(fā)明中指含有在膜內(nèi)封閉的復(fù)雜結(jié)構(gòu)如核的任何細(xì)胞?？梢栽诒景l(fā)明的第一種方法中使用的真核細(xì)胞例子是真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞、魚細(xì)胞、爬行動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)。如本文使用的，術(shù)語“酵母細(xì)胞”包括任何產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目)、擔(dān)子菌酵母、和屬于不完全真菌(芽生菌)的酵母。因為酵母的分類在未來可能改變，所以為了本發(fā)明的目白勺，酵母應(yīng)如由 Skinner, F.等人(Biology 和 Activities of Yeast, Soc. App. Bacteriol.Symp. SeriesNo. 9)描述中所述定義。合適的酵母菌株包括但不限于，圓酵母的任何物種、面包酵母、啤酒酵母、酵母屬物種例如釀酒酵母(S. cerevisiae)、裂殖酵母屬物種、畢赤酵母屬物種例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、假絲酵母屬物種、漢遜酵母屬物種例如多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、和克魯維酵母屬物種例如乳酸克魯維酵母(Klyuveromyces Iactis)以及來自上述酵母物種的不同菌株,例如釀酒酵母T73菌株。還可以使用這些物種和菌株中的任何的混合物。如本文使用的，術(shù)語“植物細(xì)胞”包括來自植物的細(xì)胞，包括但不限于藻類、單子·葉植物、雙子葉植物和具體地谷類(例如玉蜀黍、稻、燕麥等)、豆科(例如大豆等)、十字花科(例如擬南芥、油菜等)或茄科(例如馬鈴薯、番茄、煙草等)。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織(merstematic)區(qū)、愈傷組織、葉、根、枝、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。因為本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解植物細(xì)胞可以是植物的部分或全植物，從而稱為“植物宿主系統(tǒng)”?！爸参锼拗飨到y(tǒng)”或分離的植物細(xì)胞可以處于不同成熟階段。植物宿主系統(tǒng)還指此類植物、種子、自交或雜交后代的任何克隆、無論是有性還是無性生成的繁殖體、和這些中的任何的后代例如插條或種子。如本文使用的，術(shù)語“動物細(xì)胞”包括來自動物的任何細(xì)胞。動物細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞、魚細(xì)胞、爬行動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。動物細(xì)胞可以衍生自動物的任何組織(原代培養(yǎng)細(xì)胞)或可以是永生化細(xì)胞。永生化細(xì)胞可以得自腫瘤組織或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)永生化，例如由病毒感染(例如EP1212420)或正常細(xì)胞與永生化細(xì)胞系的融合。昆蟲細(xì)胞包括但不限于Sf9細(xì)胞、SF21細(xì)胞、SF+細(xì)胞、Hi-Five細(xì)胞、或昆蟲幼蟲細(xì)胞?？梢杂善浍@得細(xì)胞的哺乳動物包括大鼠、小鼠、猴、人等。適合于本發(fā)明的哺乳動物細(xì)胞包括上皮細(xì)胞系、骨肉瘤細(xì)胞系、成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系、上皮癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞系、CHO (中國倉鼠卵巢)細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、911細(xì)胞、AT1080細(xì)胞、A549細(xì)胞、293細(xì)胞或PER. C6細(xì)胞、人ECC NTERA-2細(xì)胞、mESC系的D3細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞例如 HS293 和 BGV01、SHEF1、SHEF2 和 HS181、NIH3T3 細(xì)胞、293T 細(xì)胞、REH 細(xì)胞和 MCF-7細(xì)胞和hMSC細(xì)胞。如本文使用的，術(shù)語“組織因子”或“TF”也稱為“促凝血酶原激酶”、“血小板組織因子”、“⑶142”或“凝血因子III”，指廣泛分布在動物界中的整合膜糖蛋白，其在內(nèi)皮下組織、血小板和白細(xì)胞中出現(xiàn)，并且是來自酶原凝血酶原的凝血酶形成起始所需的。用于在本發(fā)明中使用的合適TF多肽包括任何動物物種包括人的天然或野生型(wt)TF。可以在本發(fā)明中使用的示例性TF蛋白質(zhì)包括人TF(UniProtKB登記號P13726)、小鼠TF(UniProtKB登記號 P20352)、大鼠 TF (UniProtKB 登記號 P42533)、豬 TF (NCBI Prot 登記號 NP 998950)、牛 TF (NCBI Prot 登記號 AAB20755)、犬 TF (NCBI Prot 登記號 BAD98568)、豚鼠 TF (NCBIProt登記號AAF36523)和不同生物體的TF蛋白質(zhì)。因為天然TF含有幾個糖基化位點，所以可以通過在能夠執(zhí)行N糖基化反應(yīng)的宿主中表達(dá)TF獲得顯示不同程度糖基化的TF變體。成熟TF含有位于Asnll (序列 Asnll-Leul2-Thrl3)、Asnl24 (序列 Asnl24-Vall25_Thrl26)和 Asnl37 (序列Asnl37-Asnl38-Thrl39)上具有共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr的三個潛在N聯(lián)糖基化。因此，用于在本發(fā)明中使用的TF分子包括在一個或多個N糖基化位點中具有可變程度的N聯(lián)糖基化的TF變體。在酵母中，糖 基化一般涉及經(jīng)由兩個GIcNAc殘基與天冬酰胺連接的約十個甘露糖殘基的內(nèi)核，和50-100個甘露糖殘基的分支外部鏈。因此，N聯(lián)糖基化可以潛在地將多達(dá)300個甘露糖殘基加入TF中，分子量中約60kDa的增加。此外，幾個甘露糖殘基可以附著至多個(超過25個)0聯(lián)糖基化位點也是可能的。在特定實施方案中，本發(fā)明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡包含糖基化的TF蛋白質(zhì)。如本文使用的，術(shù)語“糖基化的”包括任何程度的糖基化。術(shù)語“具有促凝活性的TF的變體”指顯示與TF基本上相同的生物學(xué)活性，且起因于一個或多個氨基酸殘基的插入、缺失或置換的化合物。可以用于評估給定多肽是否是TF的功能等價變體的合適功能測定法是基于TF變體特異性結(jié)合FVIIa的能力的測定的那些測定法，或基于在血漿或全血中的凝血時間的體外測定，通過在嚴(yán)重出血動物模型中的體內(nèi)測定法或通過在致命性出血動物模型中的體內(nèi)測定法。用于執(zhí)行這些測定法的程序已在現(xiàn)有技術(shù)中描述，并且在本發(fā)明的實施例中(節(jié)段“方法”)以及申請W02008080989中概括。根據(jù)本發(fā)明的變體包括與上文提及的天然TF分子至少60%、70%、80%、90%、95%或96%相似或相同的氨基酸序列。如本領(lǐng)域已知的，通過比較一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列及其保守氨基酸置換與第二種蛋白質(zhì)的序列來測定在兩種蛋白質(zhì)之間的“相似性”。在兩種蛋白質(zhì)之間的同一性程度使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛已知的計算機(jī)算法和方法進(jìn)行測定。在兩個氨基酸序列之間的同一性優(yōu)選通過使用BLASTP算法[BLASTManual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIHBethesda,Md. 20894, Altschul, S.等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)]進(jìn)行測定。TF蛋白質(zhì)具有定義明確的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，其包含(I)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)從未成熟加工為成熟形式時，被翻譯后加工的具有32氨基酸引導(dǎo)序列的信號肽或區(qū)域；(2)包含約219個末端氨基酸的N糖基化親水細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；(3)約23個氨基酸的片段，主要是疏水性的，其被認(rèn)為形成跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸；和(4) 21-氨基酸羧基末端，其被認(rèn)為是形成蛋白質(zhì)細(xì)胞質(zhì)片段的部分的氨基酸。hTF蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)允許例如蛋白質(zhì)或其功能片段的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生。在特定實施方案中，具有促凝活性的TF的片段包含成熟的TF蛋白質(zhì)。如本文使用的術(shù)語“成熟TF”指其氨基酸序列缺乏信號肽的TF蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，所述成熟TF蛋白質(zhì)包含人成熟TF蛋白質(zhì)。進(jìn)一步地，在特定實施方案中，所述人成熟TF蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO I中所不的氣基酸序列。具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)的片段可以是糖基化的，部分糖基化的或非糖基化的。因此，在特定實施方案中，本發(fā)明的荷有TF的脂質(zhì)微囊泡包含具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)的非糖基化片段，而在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的所述荷有TF的酵母衍生的微囊泡包含具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)的糖基化片段。如上所述，術(shù)語“糖基化的”包括任何程度的糖基化。在優(yōu)選實施方案中，具有促凝活性的TF或其功能變體含有至少一個無功能的N糖基化位點。在優(yōu)選實施方案中，一個或多個N糖基化位點是對應(yīng)于在成熟人TF中的位置11-13上的N糖基化位點NLT、在位置124-126上的NVT、或在位置137-139上的NNT的那些。在一個更優(yōu)選的實施方案中，TF攜帶Asn殘基成為并非N糖基化受體的殘基的一個或多個置換。在一個更加優(yōu)選的實施方案中，TF變體包含對應(yīng)于在成熟人TF中的位置11、124或137的位置中的Asn殘基中的一個或多個Asn-至-Ala突變。糖基化將取決于用于產(chǎn)生荷有TF的脂質(zhì)囊泡的表達(dá)系統(tǒng)而改變。因此，本發(fā)明提供了重組哺乳動物組織因子蛋白質(zhì)，其包括至少一種植物特異性聚糖、酵母特異性聚糖或動物特異性聚糖。此外，如在TF蛋白質(zhì)的情況下，在執(zhí)行本發(fā)明中使用的具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)的片段可以是融合蛋白的成員，所述融合蛋白含有與包含另一種肽或蛋白質(zhì)的第二個區(qū)域 結(jié)合，包含其具有促凝活性的所述TF蛋白質(zhì)片段的第一個區(qū)域。所述第二個區(qū)域可以與所述TF蛋白質(zhì)片段的氨基末端區(qū)域結(jié)合，或備選地，所述第二個區(qū)域可以與所述TF蛋白質(zhì)片段的羧基末端區(qū)域結(jié)合。第一個和第二個區(qū)域可以直接結(jié)合或通過在所述第一個和第二個區(qū)域之間的接頭多肽結(jié)合。在特定實施方案中，所述融合蛋白包含具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)的片段和與所述TF蛋白質(zhì)片段的C末端或N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的標(biāo)簽。所述標(biāo)簽一般是可以在所述融合蛋白的分離或純化中使用的肽或氨基酸序列。適合于產(chǎn)生這種融合蛋白的標(biāo)簽的舉例說明性、非限制性例子包括先前與融合蛋白結(jié)合提及的那些，在所述融合蛋白中第一個區(qū)域是TF蛋白質(zhì)。在特定實施方案中，所述標(biāo)簽是與具有促凝活性的所述TF蛋白質(zhì)或其片段的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的His-標(biāo)簽。在另一個實施方案中，所述標(biāo)簽是與具有促凝活性的所述TF蛋白質(zhì)或其片段的N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的His-標(biāo)簽。在特定實施方案中，融合蛋白包含成熟TF蛋白質(zhì)，優(yōu)選人成熟TF蛋白質(zhì)。這種融合蛋白還具有促凝活性，其促凝活性可以如先前提及的進(jìn)行測定，例如通過實施例2中提及的凝血測定法中的任何一種進(jìn)行測定。此外，可以提供形成融合蛋白的部分的TF蛋白質(zhì)，所述融合蛋白含有與第二個區(qū)域連接的包含TF蛋白質(zhì)的第一個區(qū)域，所述第二個區(qū)域包含另一種肽或蛋白質(zhì)。所述第二個區(qū)域可以與所述TF蛋白質(zhì)的氨基末端區(qū)域結(jié)合，或備選地，所述第二個區(qū)域可以與所述TF蛋白質(zhì)的羧基末端區(qū)域結(jié)合。第一個和第二個區(qū)域可以彼此直接結(jié)合，或可以通過在所述第一個和第二個區(qū)域之間的接頭多肽結(jié)合在特定實施方案中，所述融合蛋白包含TF蛋白質(zhì)和與所述TF蛋白質(zhì)的C末端或N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的標(biāo)簽，通常為肽標(biāo)簽。所述標(biāo)簽一般是可以在所述融合蛋白的分離或純化中使用的肽或氨基酸序列。因此，所述標(biāo)簽?zāi)軌蚺c一種或多種配體結(jié)合，例如親和基質(zhì)例如具有高親和力的色譜載體或珠的一種或多種配體。所述標(biāo)簽的例子是組氨酸標(biāo)簽(His-標(biāo)簽或HT)，例如包含6個組氨酸殘基的標(biāo)簽(His6或H6)，其可以以高親和力與鎳(Ni2+)或鈷(Co2+)柱結(jié)合。如實施例I (圖4)中所示的，His-標(biāo)簽具有希望特征，它可以在對于大多數(shù)蛋白質(zhì)變性且破壞大多數(shù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的條件下結(jié)合其配體。因此，在誘餌已參與其中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用破壞后，它可以用于去除由H6加上標(biāo)簽的引誘蛋白。
對于分離或純化融合蛋白有用的標(biāo)簽的另外舉例說明性、非限制性例子包括Arg-標(biāo)簽、FLAG-標(biāo)簽、Strep-標(biāo)簽,能夠由抗體識別的表位例如c_myc-標(biāo)簽(由c_myc抗體識別)、SBP-標(biāo)簽、S-標(biāo)簽，鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽，麥芽糖結(jié)合蛋白，NusA、TrxA、DsbA、Avi-標(biāo)簽等(TerpeK.、Αρρ1·Microbiol. Biotechnol. (2003),60:523-525),氨基酸序列例如 Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO: 2)；Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser (SEQIDN0:3) ；Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys (SEQ ID NO:4) ; β -半乳糖苷酶等。在特定實施方案中，所述標(biāo)簽是與所述TF蛋白質(zhì)的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的His-標(biāo)簽。在另一個實施方案中，所述標(biāo)簽是與所述TF蛋白質(zhì)的N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合的His-標(biāo)簽。在特定實施方案中，融合蛋白包含具有促凝活性的缺乏信號肽或其變體的人TF，其具有在糖基化位點上的N124A突變和在C末端上的六組氨酸標(biāo)簽，并且由(SEQ ID NO 5) 全A屮
口 ED ο所述融合蛋白可以通過常規(guī)方式獲得，例如借助于在合適酵母細(xì)胞中基因表達(dá)編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。需要時，最后標(biāo)簽可以用于所述融合蛋白的分離或純化。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的第一種方法的第一個步驟涉及在真核細(xì)胞中表達(dá)具有促凝活性的TF的片段。根據(jù)本發(fā)明，具有促凝活性的所述TF蛋白質(zhì)或其片段的部分整合在所述脂質(zhì)膜中。通常，所述部分包含所述蛋白質(zhì)或片段的親脂區(qū)域(即TF的中心結(jié)構(gòu)域)，而其親水區(qū)域(即所述TF蛋白質(zhì)的氨基末端區(qū)域和羧基末端區(qū)域)面對膜的外質(zhì)或內(nèi)質(zhì)側(cè)面。關(guān)于TF蛋白質(zhì)的親脂和親水區(qū)域的信息可以得自W02008080989。在特定實施方案中，具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段的N末端結(jié)構(gòu)域面對所述膜的外質(zhì)側(cè)面，而在另一個特定實施方案中，具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段的N末端結(jié)構(gòu)域面對所述膜的內(nèi)質(zhì)側(cè)面。TF或其變體的表達(dá)方法取決于使用的真核細(xì)胞。一般地，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含與在可以在本發(fā)明中使用的任何細(xì)胞中的功能啟動子可操作地連接的，編碼具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段的核苷酸序列真菌、酵母、植物或動物(魚、爬行動物、哺乳動物、昆蟲等)細(xì)胞。編碼具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段的cDNA可以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，使用cDNA文庫作為模板和合適引物。實施例I公開了在3’末端具有18個額外核苷酸(編碼六組氨酸)的成熟hTF蛋白質(zhì)的cDNA擴(kuò)增。如本文使用的，“載體”指能夠轉(zhuǎn)運它已與之連接的另一種核酸的核酸分子。如本文使用的，術(shù)語“酵母表達(dá)載體”指在酵母中由載體攜帶的DNA表達(dá)構(gòu)建體，例如核酸區(qū)段、質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、能夠合成由其各自重組基因(即具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段)編碼的主題蛋白質(zhì)的病毒或病毒顆粒?？商娲?，使用非定向或同源重組，核酸區(qū)段還可以用于制備轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞，其中基因或目的基因穩(wěn)定整合到酵母基因組內(nèi)。通常，酵母表達(dá)載體包含與在酵母細(xì)胞中起作用的啟動子(即酵母功能啟動子)可操作地連接的，編碼具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列。用于與本發(fā)明一起使用的載體是例如在酵母細(xì)胞中能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)它們與之連接的核酸的載體。在本說明書中，術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用形式的載體。此外，本發(fā)明預(yù)期包括此類其他形式的表達(dá)載體，其發(fā)揮等價功能并且隨后關(guān)于這點變得本領(lǐng)域已知的。所述酵母表達(dá)載體可以是酵母附加型表達(dá)載體或酵母整合型表達(dá)載體，并且它們可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得。因此，在一個實施方案中，所述酵母表達(dá)載體是酵母附加型表達(dá)載體。如本文使用的術(shù)語“酵母附加型表達(dá)載體”指在酵母細(xì)胞質(zhì)中作為染色體外DNA分子維持的表達(dá)載體。在特定實施方案中，除了與酵母功能啟動子可操作地連接的，編碼具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段的核苷酸序列外，所述酵母附加型表達(dá)載體進(jìn)一步包含(i)酵母選擇基因；(ii)酵母復(fù)制起點；(iii)細(xì)菌選擇基因jP(iv)酵母轉(zhuǎn)錄終止信號。有利地，所述酵母附加型表達(dá)載體進(jìn)一步包含在酵母功能啟動子的控制下用于克隆所選基因(具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段)的獨特限制位點，且隨后為酵母轉(zhuǎn)錄終止信號。實際上任何酵母功能啟動子、酵母選擇基因、酵母復(fù)制起點、細(xì)菌選擇基因、酵母轉(zhuǎn)錄終止信號和用于克隆的限制位點，可以用于制造所述酵母附加型表達(dá)載體；然而，在特定實施方案中，3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(pGPD)用作酵母功能啟動子；在另一個特定實施方案中，URA3基因(URA3)用作酵母選擇基因；在另一個特定實施方案中，酵母2微米(2 μ )復(fù)制起點用作酵母復(fù)制起點；在另一個特定實施方案中，氨芐青霉素抗性基因(Amp) 用作細(xì)菌選擇基因；并且在另一個特定實施方案中，磷酸甘油酸酯激酶(PGKt)的轉(zhuǎn)錄終止信號用作特異性酵母轉(zhuǎn)錄終止信號。因此，在特定實施方案中(實施例1-2)，酵母附加型表達(dá)載體包含(i)URA3基因；(ii)用于在大腸桿菌(E. coli)中選擇且繁殖載體的Amp基因；
(iii)酵母2 μ復(fù)制起點；(iv)pGPD ;(v)PGKt的特異性酵母轉(zhuǎn)錄終止信號jP(vi)獨特的BamHI限制位點，其允許在pGPD的控制下克隆所選基因，且隨后為PGKt序列。在其他實施方案中，所述酵母表達(dá)載體是酵母整合型表達(dá)載體。如本文使用的術(shù)語“酵母整合型表達(dá)載體”指能夠整合到酵母基因組內(nèi)的載體。在特定實施方案中，所述酵母整合型表達(dá)載體包含(i)細(xì)菌選擇基因jP(ii)插入酵母選擇基因中的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒進(jìn)一步包含酵母功能啟動子、酵母轉(zhuǎn)錄終止信號和用于克隆所選基因(具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段)的獨特限制位點。實際上任何細(xì)菌選擇基因、插入酵母選擇基因中的表達(dá)盒、酵母功能啟動子、酵母轉(zhuǎn)錄終止信號和用于克隆所選基因的獨特限制位點可以用于制造所述酵母整合型表達(dá)載體；然而，在特定實施方案中，氨芐青霉素抗性基因(Amp)用作細(xì)菌選擇基因；在另一個特定實施方案中，插入URA3基因的中心區(qū)域中的表達(dá)盒PGPD-BamHI-PGKt用作含有酵母功能啟動子(PGDP)、酵母轉(zhuǎn)錄終止信號(PGKt)和用于在URA3基因的中心區(qū)域中克隆所選基因的獨特限制位點(BamHI)的表達(dá)盒。事實上對用所述酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化敏感的任何酵母細(xì)胞都可以用于本發(fā)明中，所述酵母表達(dá)載體包含與酵母功能啟動子可操作地連接的，編碼具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段的核苷酸序列。用所述酵母表達(dá)載體的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法執(zhí)行(Sambrook 等人，2001, Molecular Cloning A LaboratoryManual)。在優(yōu)選實施方案中，所述酵母是非絮凝酵母(即當(dāng)它們在發(fā)酵過程中分散時，不會絮凝(聚集)的酵母細(xì)胞)。有利地，所述酵母細(xì)胞是GRAS酵母細(xì)胞?？梢栽诒景l(fā)明的過程中使用的酵母細(xì)胞的舉例說明性、非限制性例子是所謂的液劑酵母(liquor yeast)物種(用于制備液劑的酵母)，其通過代謝釀造材料液體來產(chǎn)生酒精、碳酸氣、面包酵母等。具體地，優(yōu)選酵母選自釀酒酵母。此類液劑酵母的例子包括啤酒酵母細(xì)胞、葡萄酒酵母細(xì)胞和清酒酵母細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，酵母細(xì)胞是葡萄酒酵母細(xì)胞例如釀酒酵母T73ura3-(實施例I)。如本文使用的，術(shù)語“植物表達(dá)載體”指在植物中由載體攜帶的DNA表達(dá)構(gòu)建體，例如核酸區(qū)段、質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、能夠合成由其各自重組基因(即具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段)編碼的主題蛋白質(zhì)的病毒或病毒顆粒。可替代地，使用非定向或同源重組，核酸區(qū)段還可以用于制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中基因或目的基因穩(wěn)定整合到植物基因組內(nèi)。通常，植物表達(dá)載體包含與在植物細(xì)胞中起作用的啟動子(即植物功能啟動子)可操作地連接的，編碼具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列?？梢栽诒景l(fā)明中使用的植物功能啟動子可以選自玉米蔗糖合成酶I、玉米醇脫氫酶I、玉米捕光復(fù)合物、玉米熱休克蛋白、豌豆小亞基RuBP羧化酶、Ti質(zhì)粒甘露堿合酶、Ti質(zhì)粒胭脂堿合酶、碧冬茄查爾酮異構(gòu)酶、豆富含甘氨酸蛋白質(zhì)I、馬鈴薯patatin、凝集素、CaMV 35S和S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。植物宿主系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化可以通過使用常規(guī)方法來執(zhí)行。關(guān)于植物的遺傳轉(zhuǎn)移的綜述可以在通過 Marta Izquierdo,Ed. Piramide (1999)的名稱為〃Ingenieri a genetica and transferencia genica〃白勺教科書，特另I」是第 9 章〃Transferencia genica a plantas〃，第283-316頁中可見。用于與本發(fā)明一起使用的載體是例如在酵母細(xì)胞中能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)它們與之連接的核酸的載體。在本說明書中，術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用形式的載體。此外，本發(fā)明預(yù)期包括此類其他形式的表達(dá)載體，其發(fā)揮等價功能并且隨后關(guān)于這點變得本領(lǐng)域已知的。所述酵母表達(dá)載體可以是植物附加型表達(dá)載體或植物整合型表達(dá)載體，并且它們可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得。實際上任何植物功能啟動子、植物選擇基因、植物復(fù)制起點、細(xì)菌選擇基因、植物轉(zhuǎn)錄終止信號和用于克隆的限制位點，可以用于制造所述植物附加型表達(dá)載體。已開發(fā)了大量特定植物生產(chǎn)系統(tǒng)。這些包括在油體上表達(dá)蛋白質(zhì)(Rooi jen等人(1995)Plant Physiology 109 :1353-61 ;Liu 等人(1997) Molecular Breeding3:463-70)、通過根分泌(rhizosecretion) (Boris juk 等人(1999) Nature Biotechnology17:466-69)、在種子中(Hood 等人(1997) Molecular Breeding 3:291-306 ;Hood 等人(1999) InChemicals via Higher Plant Bioengineering (編輯 Shahidi 等人)Plenum Publishing Corp.第 127-148 頁；Kusnadi 等人(1997) Biotechnology andBioengineering 56:473-84 ;Kusnadi 等人(1998)Biotechnology and Bioengineering60:44-52 ;Kusnadi 等人(1998)Biotechnology Progress 14 :149-55 ；ffitcher 等人(1998) MolecularBreeding 4:301-12)、作為在病毒表面上的表位(Verch 等人(1998)J.Immunological Methods 220:69-75 ；Brennan 等人(1999) J. Virology73:930_38 ;Brennan等人(1999) Microbiology 145:211-20)、和通過在馬鈴薯塊莖中穩(wěn)定表達(dá)蛋白質(zhì)(Arakawa 等人(1997) TransgenicResearch 6:403-13 ;Arakawa 等人(1998) NatureBiotechnologyl6:292-97 ;Tacket 等人(1998) Nature Medicine 4:607-09)。重組蛋白質(zhì)還可以靶向種子、葉綠體或被分泌，以鑒定給出最高水平的蛋白質(zhì)聚集的位置。這些各自可以適合于在合適的植物宿主中表達(dá)組織因子或片段。用于在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的另外一般方法已得到報道。參見給予Bascomb，N.等人的PCT/US02/23624 ;和給予Hall，G.等人的PCT/US02/17927。這些可以容易地適合于在例如擬南芥屬(Arabadopsis)以及多種其他植物中表達(dá)組織因子蛋白質(zhì)或片段。用于在單子葉植物和雙子葉植物中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的進(jìn)一步方法已得到報道。這些包括導(dǎo)致目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和組成性表達(dá)的方法1) 土壤桿菌屬介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移；2)直接DNA攝取包括用于將DNA直接攝取到原生質(zhì)體內(nèi)的方法；3)通過植物細(xì)胞的短暫電休克誘導(dǎo)的DNA攝取，4)通過粒子轟擊、通過使用微量吸管系統(tǒng)或通過DNA與萌發(fā)的花粉的直接溫育將DNA注射到植物細(xì)胞或組織內(nèi)；和5)使用植物病毒作為基因載體。這些方法之一或組合可以用于制備表達(dá)組織因子或其功能片段的植物。借助于改造的土壤桿菌屬菌株的基因轉(zhuǎn)移已變成用于大多數(shù)雙子葉植物和用于一些單子葉植物的常規(guī)。參見例如，F(xiàn)raley等人(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:4803。用于與本發(fā)明一起使用的進(jìn)一步載體包括公開于例如美國專利號5，591，616和 EPA 0604662A1 中的那些“超二兀的(super-binary)”。還參見 Hood 等人(1984)Biotechnol. 2:702-709 ;Hood 等人(1986) J. Bacteriol. 168 :1283-1290 ;Komari 等人(1986) J. Bacteriol. 166:88-94 Jin 等人(1987) J. Bacteriol. 169:4417-4425 ；Komari·T. (1989) Plant Science 60:223-229 ;ATCC 登記號 37394)。如本文使用的，術(shù)語“動物表達(dá)載體”指在動物中由載體攜帶的DNA表達(dá)構(gòu)建體，例如核酸區(qū)段、質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、能夠合成由其各自重組基因(即具有促凝活性的TF蛋白質(zhì)或其片段)編碼的主題蛋白質(zhì)的病毒或病毒顆粒?？商娲?，使用非定向或同源重組，核酸區(qū)段還可以用于制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞，其中基因或目的基因穩(wěn)定整合到動物基因組內(nèi)。通常，動物表達(dá)載體包含與在動物細(xì)胞中起作用的啟動子(即動物功能啟動子)可操作地連接的，編碼具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列。在特定實施方案中，動物細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。昆蟲轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的例子包括在本發(fā)明中使用的昆蟲特異性病毒例如重組桿狀病毒(參見實施例)，及其他例如在美國專利US6130074A中所述的那些。在其中TF或其變體待在其中表達(dá)的細(xì)胞是酵母的那些實施方案中，使用用于處理酵母和酵母遺傳學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)處理酵母。參見例如，Bacila等人，編輯(1978，Biochemistry and Genetics of Yeast, Academic Press, New York)；以及 Rose 和Harrison. (1987, The Yeasts (2. sup. nd ed. ) Academic Press, London)。將外源 DNA 引入酵母宿主內(nèi)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。存在用于酵母轉(zhuǎn)化的廣泛多樣的方法。原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化由 Hinnen 等人(1978，Proc. Natl. Acad. Sci. USA75 :1919-1933) ；Beggs (1978，Nature 275 (5676) :104-109);和 Stinchcomb 等人(EP0
發(fā)明者J·繆拉莫雷諾, J·R·羅德里格斯費爾南德斯-阿爾巴 申請人:斯洛柏塔蓋茲歐洲有限公司