專(zhuān)利名稱(chēng)：使用alkL基因產(chǎn)物的生物催化的氧化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及借助alkL基因產(chǎn)物氧化有機(jī)化合物的生物催化方法以及在該方法中使用的微生物。
背景技術(shù)：
例如惡臭假單胞菌)的OCT質(zhì)粒含有alkL基因。此外,該質(zhì)粒編碼負(fù)責(zé)烷烴降解的基因產(chǎn)物。這些烷烴降解基因排列在該假單胞菌OCT質(zhì)粒上的2個(gè)alk操縱子中；第一個(gè)alk操縱子編碼基因產(chǎn)物AlkB、AlkF, AlkG, AlkH, AlkJ, AlkK和AlkL,第二個(gè)alk操縱子編碼AlkS和AlkT，其中AlkS對(duì)第一個(gè)alk操縱子的表達(dá)行使調(diào)節(jié)功能。關(guān)于該alk操縱子的詳細(xì)的綜述和其它基因的功能，參見(jiàn)Chen等人，J Bacteriol.1995 十二月，177(23) :6894-901?！?br> 另外，由EP277674已知一種借助于對(duì)非極性相有抗性的惡臭假單胞菌屬的微生物，將具有6-12個(gè)碳原子的非極性脂族化合物的末端羥基化，如生產(chǎn)I-辛醇，的微生物學(xué)方法，其中，尤其使用具有alkL基因的質(zhì)粒pGEc47，所述質(zhì)粒pGEc47也攜帶來(lái)自惡臭假單胞菌的2種alk操縱子。alkL基因的控制，是在天然操縱子啟動(dòng)子的控制下，并因此與alkB、alkF、alkG、alkH、alkj 和 alkK —起轉(zhuǎn)錄和翻譯。W02002022845描述了一種通過(guò)使用攜帶上述質(zhì)粒pGEc47的大腸桿菌細(xì)胞來(lái)羥基化N-芐基-4-哌啶，從而生產(chǎn)N-芐基-4-羥基哌啶的方法。EP0502524描述了一種將芳族5_或6_兀環(huán)雜環(huán)上的乙基末端輕基化的微生物學(xué)方法，其中使用alk操縱子生產(chǎn)不同的基因產(chǎn)物，這例如通過(guò)質(zhì)粒pGEc41編碼alkB、alkG、alkH、alkT和alkS的基因產(chǎn)物，但是不編碼alkL的基因產(chǎn)物。此外，該同一申請(qǐng)描述了一種質(zhì)粒pGMK921，其如pGEc41 —樣，含有alkB、alkG、alkH、alkT和alkS的基因，但是不含有alkL的基因，然而，其表達(dá)不僅可通過(guò)天然啟動(dòng)子的烷烴誘導(dǎo)，而且可通過(guò)tac啟動(dòng)子的IPTG 誘導(dǎo)(也參見(jiàn) US5306625)。Schneider 等人在AppI Environ Microbiol. 1998 Oct; 64 (10) : 3784-90 中描述了大腸桿菌中的飽和脂肪酸向其ω-1-、ω-2-和ω-3-羥基脂肪酸的生物轉(zhuǎn)化，其中使用細(xì)胞色素Ρ-450ΒΜ-3單加氧酶和上述質(zhì)粒pGEc47。Favre-Bulle 等人在 Nature Bio/Technology 9, 367-371 (1991 年 4 月)中描述了一種通過(guò)辛烷的生物轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)I-辛酸的方法，其中使用攜帶pGEc47的大腸桿菌細(xì)菌作為生物催化劑。在所述的方法中，兩種alk操縱子都完全表達(dá)。Rothen 等人在 Biotechnol Bioeng. 1998 May 20; 58 (4) :356-65 中遵循相同的方法。所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是，由用作生物催化劑的細(xì)胞過(guò)多地生產(chǎn)對(duì)所希望的氧化過(guò)程沒(méi)有重大貢獻(xiàn)的基因產(chǎn)物，并因此降低了其性能。此外，所述多余共合成的alk基因產(chǎn)物可能具有不希望的酶活性，所述酶活性，例如通過(guò)中間產(chǎn)物流失到不希望的副產(chǎn)物中而有損于所希望的產(chǎn)物形成。在希望的有機(jī)殘基的ω-羥基化中，alkj基因產(chǎn)物導(dǎo)致形成相應(yīng)的醛。在例如同時(shí)存在alkH基因產(chǎn)物的情況下，所生成的醛被進(jìn)一步氧化成 羧酸。因而，在EP0502524中，為了產(chǎn)生希望的羥基化的方法產(chǎn)物，僅需要alkB、alkG和alkT的基因產(chǎn)物，因此，例如，基因alkF、alkj、alkH和alkS是多余的。此外，在這里不利的是，其它alk基因產(chǎn)物的合成，對(duì)宿主的代謝能力提出了高要求。例如,alkj是一種含有FAD 的酶(Chen等人，J. Bacteriol, (1995)，6894-6901)。但是，同樣含有FAD的alkT的不可放棄的生產(chǎn)已經(jīng)對(duì)宿主的FAD庫(kù)(FAD-PooI)造成了負(fù)擔(dān)。因?yàn)樵诶绱竽c桿菌中的FAD合成能力是有限的，且同樣需要現(xiàn)存的細(xì)胞代謝，在生產(chǎn)不必要的alkj的情況下，給細(xì)胞加上了可避免的負(fù)擔(dān)。此外，alkB、alkj和alkH的基因產(chǎn)物是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的或細(xì)胞質(zhì)膜相結(jié)合的。呼吸鏈也位于該區(qū)域中。膜蛋白的過(guò)量生產(chǎn)，導(dǎo)致從細(xì)胞膜中的變化直至膜囊泡的脫離，所述膜囊泡遷移進(jìn)胞質(zhì)溶膠中(Nieboer等人，Molecular Microbiology (1993) 8(6)，1039-1051)。這最終導(dǎo)致所述細(xì)胞的過(guò)早裂解(Wubbolts等人，Biotechnology andBioengineering (1996),第52卷，301-308),所有這些在工業(yè)過(guò)程不可缺少的高細(xì)胞密度發(fā)酵中尤其如此。類(lèi)似地,在Schneider 等人中，alkB、alkF、alkG、alkH、alkJ、alkK、alkS 和 alkT 的基因產(chǎn)物被過(guò)多地共同合成，因?yàn)閷?shí)際用于所希望的反應(yīng)的酶是細(xì)胞色素-P-450BM-3單加氧酶。就工業(yè)過(guò)程而言，難以使用質(zhì)粒編碼的代謝途徑。隨著發(fā)酵罐體積的增加，使用抗生素用于維持提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的選擇壓力，首先變得非常昂貴，其次到達(dá)廢水的臨界點(diǎn)(abwasserkritisch).因此，大規(guī)模發(fā)酵實(shí)際上總是在沒(méi)有任何抗生素添加的情況下進(jìn)行。盡管如此，為了確保人造氧化代謝途徑的遺傳穩(wěn)定性，將使用的基因整合進(jìn)宿主生物的基因組中是合乎需要的。要整合的基因構(gòu)建體越小，這樣的做法就越好地成功。因?yàn)檫@里考慮的最小基因集合alkBGTL已經(jīng)具有相當(dāng)大的尺寸，必須避免并非絕對(duì)必需的任何其它核苷酸序列。除了減少必要的分子生物學(xué)工作的范圍和增加其成功的可能性，盡可能小的構(gòu)建體也有益于宿主生物的基因組穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的是，提供一種方法，所述方法能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的所述缺點(diǎn)中的至少一個(gè)。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在下文中描述的方法和遺傳修飾的細(xì)胞為實(shí)現(xiàn)所提出的目的做出了貢獻(xiàn)。因此，本發(fā)明涉及使用如在權(quán)利要求I中描述的alkL基因產(chǎn)物來(lái)生產(chǎn)被氧化的有機(jī)物質(zhì)的方法，以及在該方法中使用的重組細(xì)胞。本發(fā)明另外涉及alkL基因產(chǎn)物用于增加氧化速率的用途。優(yōu)點(diǎn)是，在所述方法中存在的資源的最佳利用，例如在細(xì)胞代謝方面，尤其是在高細(xì)胞密度發(fā)酵條件下。本發(fā)明描述了使用至少一種氧化酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物來(lái)氧化有機(jī)物質(zhì)的方法，其特征在于，獨(dú)立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物，提供所述alkL基因產(chǎn)物。與本發(fā)明有關(guān)的所述的alk基因編碼類(lèi)似地命名為AlkX的蛋白序列。如果同時(shí)描述多個(gè)基因alkX、alkY和alkZ，則使用命名法alkXYZ，或類(lèi)似地，在蛋白質(zhì)的情況中，使用命名法AlkXYZ。與本發(fā)明有關(guān)的表述“有機(jī)物質(zhì)的氧化”被理解為例如，羥基化或環(huán)氧化，醇轉(zhuǎn)化成醛或酮，醛轉(zhuǎn)化成羧酸，或雙鍵的水合。同樣地，在此表述下面也合并了多級(jí)氧化過(guò)程，所述多級(jí)氧化過(guò)程如尤其可通過(guò)使用多種氧化酶來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，在多個(gè)位點(diǎn)(例如在ω位置和ω-I位置)處烷基殘基的羥基化，所述羥基化由多種單加氧酶催化。與本發(fā)明有關(guān)的表述“使用至少一種氧化酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物”被理解為，靶向地提供所述酶和基因產(chǎn)物，更確切地說(shuō)，以被認(rèn)為在天然自然界中本身不存在的每種單一酶或基因產(chǎn)物的形式。這可以如下進(jìn)行例如，通過(guò)異源生產(chǎn)或過(guò)量生產(chǎn)在細(xì)胞中使 用的蛋白，或通過(guò)提供至少部分地純化的蛋白；但是，在這里也包括與存在于天然自然界中的酶相比改變的環(huán)境，例如，以經(jīng)過(guò)修改的含有所述酶的天然細(xì)胞的形式，以這樣的方式，它例如以修飾形式，例如，弱化或強(qiáng)化，或具有點(diǎn)突變來(lái)生產(chǎn)某些其它蛋白。與本發(fā)明有關(guān)的表述“alkL基因產(chǎn)物”被理解為滿足下述2個(gè)條件中的至少一個(gè)的蛋白
1.)所述蛋白被鑒別為OmpW蛋白超家族(在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD)中的蛋白家族3922)的一個(gè)成員，其中該分配如下做出使用標(biāo)準(zhǔn)搜索參數(shù)，小于O. 01的e值(英語(yǔ)“e-ValUe”)，并使用算法“blastp 2. 2. 23+”，將所述蛋白的氨基酸序列與在2010年3月22日之前已經(jīng)保藏的NCBI的⑶D中存在的數(shù)據(jù)庫(kù)條目進(jìn)行比對(duì)，
2.)在借助于RPS-BLAST在NCBI⑶D(2. 20版)中搜索有關(guān)氨基酸序列中含有的保守蛋白結(jié)構(gòu)域時(shí)，以小于1X10_5的e值(英語(yǔ)“e-value”),觀察到保守結(jié)構(gòu)域“OmpW,夕卜膜蛋白 W，，(C0G3047)的存在((英語(yǔ)domain hit”))。與本發(fā)明有關(guān)的表述“獨(dú)立于由含有alk基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物提供”被理解為，所述alkL基因產(chǎn)物的提供獨(dú)立于至少一種其它alk基因產(chǎn)物，所述其它alk基因產(chǎn)物以天然存在的形式與所述alkL基因產(chǎn)物的形成相關(guān)聯(lián)。例如，在一個(gè)包含基因alkBFGHJKL的操縱子中，各alkBFGHJ和K的alk基因產(chǎn)物與所述alkL基因產(chǎn)物的形成相關(guān)聯(lián)，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)同一個(gè)啟動(dòng)子來(lái)提供。給出的所有百分比(%)是質(zhì)量百分比，除非另外說(shuō)明。取決于使用的氧化酶，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于氧化被該氧化酶接受為底物的任意有機(jī)物質(zhì)；優(yōu)選的有機(jī)物質(zhì)選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組
支鏈的或無(wú)支鏈的、優(yōu)選支鏈的、
飽和的或不飽和的、優(yōu)選飽和的、
任選取代的
烷烴、烯烴、炔烴、醇、醛、酮、羧酸、羧酸酯、胺和環(huán)氧化物，其中它們優(yōu)選地具有3-22個(gè)、尤其是6-18個(gè)、更優(yōu)選地8-14個(gè)、尤其是12個(gè)碳原子。在根據(jù)本發(fā)明的方法中特別優(yōu)選的有機(jī)物質(zhì)選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組
羧酸及其對(duì)應(yīng)的酯，尤其是具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個(gè)碳原子，尤其是烷烴的羧酸，尤其是烷烴的無(wú)支鏈羧酸，尤其是月桂酸及其酯，尤其是月桂酸甲酯和月桂酸乙酯、癸酸、癸酸酯、肉豆蘧酸和肉豆蘧酸酯，
具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個(gè)碳原子的未被取代的烷烴，優(yōu)選無(wú)支鏈烷烴，尤其是選自包含、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組辛烷、癸烷、十二烷和十四烷，
具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個(gè)碳原子的未被取代的烯烴，優(yōu)選無(wú)支鏈烯經(jīng)，尤其是選自包含、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組反式_羊_1_烯、反式_壬_1_烯、反式-癸-I-烯、反式-十一碳-I-烯、反式-十二碳-I-烯、反式-十二碳-I-烯、反式-十四碳-I-烯、順式_羊-I-烯、順式_壬-I-烯、順式_癸_1_烯、順式_十一碳-I-烯、順式-十二碳_1_烯、順式_十二碳-I-烯、順式_十四碳-I-烯、反式_辛_2_烯、反式-壬_2_烯、反式-癸-2-烯、反式-十一碳-2-烯、反式-十二碳-2-烯、反式_十二 碳-2-烯和反式_十四碳-2-烯、反式-辛-3-烯、反式-壬-3-烯、反式-癸-3-烯、反式_十一碳_3_烯、反式-十二碳-3-烯、反式-十二碳-3-烯和反式_十四碳-3-烯、反式-辛-4-烯、反式-壬-4-烯、反式-癸-4-烯、反式-十一碳-4-烯、反式-十二碳-4-烯、反式-十二碳-4-烯、反式-十四碳-4-烯、反式-癸-5-烯、反式-十一碳-5-烯、反式-十二碳-5-烯、反式-十二碳-5-烯、反式_十四碳-5-烯、反式-十二碳-6-烯、反式-十二碳-6-烯、反式_十四碳-6-烯和反式_十四碳-7-烯,所述組特別優(yōu)選地由下述物質(zhì)組成反式-辛-I-烯、反式-癸-I-烯、反式-十二碳-I-烯、反式-十四碳-I-烯、順式-辛-I-烯、順式-癸-I-烯、順式-十二碳-I-烯、順式-十四碳-I-烯、反式_辛-2-烯、反式-癸-2-烯、反式-十二碳-2-烯和反式_十四碳-2-烯、反式-辛_3_烯、反式-癸-3-烯、反式-十二碳-3-烯和反式-十四碳-3-烯、反式-辛-4-烯、反式_癸_4_烯、反式-十二碳-4-烯、反式_十四碳-4-烯、反式-癸-5-烯、反式-十二碳-5-烯、反式_十四碳_5_烯、反式-十二碳-6-烯、反式_十四碳-6-烯和反式_十四碳-7-烯，
具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個(gè)碳原子的未被取代的一元醇，優(yōu)選無(wú)支鏈的一元醇，尤其是選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組I-辛醇、I-壬醇、I-癸醇、l-i^一醇、I-十二醇、I-十三醇和I-十四醇，
特別優(yōu)選地，所述組由下述物質(zhì)組成1-辛醇、I-癸醇、I-十二醇和I-十四醇，
具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個(gè)碳原子的未被取代的醛，優(yōu)選無(wú)支鏈的醛，尤其是選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組辛醛、壬醛、癸醛、十二醛和十四醛，具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個(gè)碳原子的未被取代的一元胺，優(yōu)選無(wú)支鏈的一元胺，尤其是選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組1_氨基辛烷、I-氨基壬燒、I-氨基癸燒、I-氨基十一燒、I-氨基十二燒、I-氨基十二燒和1_氨基十四燒，
特別優(yōu)選地，所述組由下述物質(zhì)組成1_氨基辛燒、1_氨基癸燒、1_氨基十二燒和
I-氨基十四燒，
以及被取代的化合物，所述化合物尤其含有一個(gè)或多個(gè)羥基_、氨基(Amin)-、酮-、羧基-、環(huán)丙基殘基-或環(huán)氧官能團(tuán)作為其它取代基，尤其是選自包含、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組1，8-辛二醇、1,9-壬二醇、1，10-癸二醇、1，11-^^一烷二醇、1，12-十二烷二醇、1，13-十三烷二醇、1，14-十四烷二醇、8-氨基-[I-辛醇]、9_氨基-[I-壬醇]、10_氨基-[I-十二醇]、11-氨基-[I-i^一醇]、12-氨基-[I-十二醇]、13-氨基-[I-十三醇]、14-氨基-[I-十四醇]、8_羥基-[I-辛醛]、9_羥基-[I-壬醛]、10-羥基-[I-癸醛]、
11-羥基-[I-十一醛]、12-羥基-[I-十二醛]、13-羥基-[I-十三醛]、14-羥基-[I-十四醛]、8-氨基-[I-辛醛]、9-氨基-[I-壬醛]、10-氨基-[I-癸醛]、11-氨基-[I-i^一醛]、12-氨基-[I-十二醛]、13-氨基-[I-十三醛]、14-氨基-[I-十四醛]、8-羥基-[I-辛酸]、9-羥基-[I-壬酸]、10-羥基-[I-癸酸]、11-羥基-[I-十一烷酸]、12-羥基-[I-十二烷酸]、13-羥基-[I-十一烷酸]、14-羥基-[I-十四烷酸]、8-羥基-[I-辛酸甲酯]、9-羥基-[I-壬酸甲酯]、10-羥基-[I-癸酸甲酯]、11-羥基-[I-十一烷酸甲酯]、
12-羥基-[I-十二烷酸甲酯]、13-羥基-[I-十一烷酸甲酯]、14-羥基-[I-十四烷酸甲酯]、8_羥基-[I-辛酸乙酯]、9_羥基-[I-壬酸乙酯]、10_羥基-[I-癸酸乙酯]、11_羥基-[I-十一烷酸乙酯]、12_羥基-[I-十二烷酸乙酯]、13_羥基-[I-十一烷酸乙酯]和14-羥基-[I-十四烷酸乙酯]， 特別優(yōu)選地，所述組由下述物質(zhì)組成1，8_辛二醇、1，10-癸二醇、1，12-十二烷二醇、1，14-十四烷二醇、8-氨基-[I-辛醇]、10-氨基-[I-十二醇]、12-氨基-[I-十二醇]、14-氨基-[I-十四醇]、8-羥基-[I-辛醛]、10-羥基-[I-癸醛]、12-羥基-[I-十二醛]、14-羥基-[I-十四醛]、8-氨基-[I-辛醛]、10-氨基-[I-癸醛]、12-氨基-[I-十二醛]、14-氨基-[I-十四醛]、8_羥基-[I-辛酸]、10_羥基-[I-癸酸]、12_羥基-[I-十二烷酸]、14-羥基-[I-十四烷酸]、8-羥基-[I-辛酸甲酯]、10-羥基-[I-癸酸甲酯]、12-羥基-[I-十二烷酸甲酯]、14-羥基-[I-十四烷酸甲酯]、8-羥基-[I-辛酸乙酯]、10-羥基-[I-癸酸乙酯]、12_羥基-[I-十二烷酸乙酯]和14-羥基-[I-十四烷酸乙酯]，
其中月桂酸及其酯，尤其是月桂酸甲酯和月桂酸乙酯，是特別優(yōu)選的。用根據(jù)本發(fā)明的方法，取決于使用的氧化酶和使用的有機(jī)物質(zhì)，可以生產(chǎn)多種氧化產(chǎn)物，尤其是醇、醛、酮和羧酸?？梢酝ㄟ^(guò)如下列舉的有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法得到這些氧化產(chǎn)物
-使烷烴/烯烴/炔烴反應(yīng)，以形成醇(例如用單加氧酶)
-使醇反應(yīng)，以形成醛(例如用醇脫氫酶或醇氧化酶)
-使醇反應(yīng)，以形成酮(例如用醇脫氫酶或醇氧化酶)
-使醛反應(yīng)，以形成羧酸(例如用醛脫氫酶)
-使環(huán)氧化物反應(yīng)，以形成羥腈(例如用鹵代醇脫鹵素酶)
在該背景下，優(yōu)選地，使用根據(jù)本發(fā)明的方法，尤其是以羥基化反應(yīng)的形式，生產(chǎn)醇和醛，優(yōu)選醇，尤其是ω-醇，非常特別地ω-羥基羧酸。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以有利地使有機(jī)物質(zhì)，尤其是羧酸和羧酸酯，在ω-位
置處氧化。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有氧化酶，因?yàn)樗峁┑腶lkL基因產(chǎn)物的功能不取決于氧化酶。這樣的酶在氧化還原酶名稱(chēng)下是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且可以參見(jiàn)國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(InternationalUnion of Biochemistry and Molecular Biology)的酶委員會(huì)的系統(tǒng)命名法的酶類(lèi)別ECI. X. X. X。
優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用的氧化酶是烷烴單加氧酶、二甲苯單加氧酶、醛脫氫酶、醇氧化酶或醇脫氫酶，優(yōu)選烷烴單加氧酶。 適用于二甲苯單加氧酶的基因是，例如，xylM-或xylA基因，其中含有這2種基因的質(zhì)粒具有GENBANK登記號(hào)M37480。在該背景下，一種特別優(yōu)選的烷烴單加氧酶的特征在于，它是細(xì)胞色素-P450單加氧酶，尤其是來(lái)自下述生物的細(xì)胞色素-P450單加氧酶酵母，尤其是畢赤酵母屬iPichia、、子囊菌酵母屬(Jarrowia )和假絲酵母屬{Candida、，例如熱帶假絲酵母{Candida 或麥芽糖假絲酵母maltose、，或植物，例如鷹嘴豆QCicerarietinum L.)，或哺乳動(dòng)物，例如褐家鼠、Rattus人尤其是CYP4A1。來(lái)自熱帶假絲酵母的合適的細(xì)胞色素-P450單加氧酶的基因序列公開(kāi)在例如W0-A-00/20566中，而來(lái)自鷹嘴豆的合適的細(xì)胞色素-P450單加氧酶的基因序列可以參見(jiàn)例如Barz等人，“Cloning and characterization of eight cytochrome P450 cDNAs from chickpea{Cicer arietinum L. ) cell suspension cultures，，，Plant Science,第 155 卷，第101-108 頁(yè)(2000)ο其它優(yōu)選的烷烴單加氧酶由來(lái)自惡臭假單胞菌GPol的alk操縱子的alkB基因編碼。alkB基因序列的分離，描述在例如，van Beilen等人，“Functional Analysisof Alkane Hydroxylases from Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria，，，Journalof Bacteriology,第 184 (6)卷，第 1733-1742 頁(yè)(2002)。alkB 基因的其它同系物也可以參見(jiàn)van Beilen 等人，“Oil & Gas Science and Technology”，第 58 (4)卷，第427-440 頁(yè)(2003)。另外，優(yōu)選的烷烴單加氧酶是這樣的姑基因產(chǎn)物，其由來(lái)自選自下述的生物的W姑基因編碼革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是假單胞菌，那里是假單胞菌屬
尤其是門(mén)多薩假單胞菌iPseudomorms mendocina),海洋柄菌屬iOceanicaulis、，優(yōu)選亞歷山大海洋柄菌 iOceanicaulis aIexandrii、HTCC2633,柄桿菌屬 iCaulobacter、，優(yōu)選地柄桿菌屬K31種，海洋桿菌屬{Marinobacter )，優(yōu)選Marinobacter aquaeolei，特別優(yōu)選地 Marinobac ter aquaeolei VTS,海洋焼徑降解菌屬{Alcani vorax )，優(yōu)選地 Alcani voraxborkumensisj 醋桿菌懷^ (Acetobacter\ 無(wú)色桿菌 HAchromobacter)，嗜酸菌屬{AcidiphiIium),食酸菌屬(Acidovorax)，氣微菌屬 iAeromicrobium), AlkaliIimnicola,交替單胞菌目(Alteromonadales\魚(yú)渥藻屬(Anabaena), Aromatoleum固氮弧菌屬(Azoarcus),固氮螺菌屬Uizospirilliim),固氮菌屬iAzotobacter)，博德特菌屬iBorde tella )，短根瘤菌屬iBradyrhizobi)，伯霍爾德桿菌屬iBurkholderia )，綠菌屬{Chlorobium), Citreicella,梭菌屬 UJlostridium\ 科爾韋爾氏菌屬 iColwellia、，叢毛平胞菌屬(Comamonas )，Conexibac ter，Congregibac ter，棒桿菌屬(Corynebac terium)，貪銅菌屬Q(mào)Cupriavidus \藍(lán)絲菌屬iCyanothece、，代爾夫特菌屬脫硫微菌屬{Desulfomi crobi um ), Desulfona tronospira, Dethiobacter，Dinoroseobac ter,赤桿菌屬 iErythrobacter)，弗朗西絲菌屬{Francisella、，Glaciecola，大頭荼屬 iGordonia\Grimon tia，Hahella，鹽陸生菌屬 iHalo terrigena )，鹽硫桿狀菌屬 iHalo thiobaciIlus )，Hoeflea，生絲單月包菌 M iHyphomonas), Janibacter, Jannaschia, Jonquetellaj 克雷伯菌屬{Klebsiella、，軍團(tuán)病桿菌屬 iLegionella、，Limnobacter, Lutiella,磁螺菌屬{MagnetospiriIlum\ 中間根瘤菌屬 Uiesorhizobium)，Methylibium，甲基桿菌(Me thylobac teri訓(xùn) )，嗷甲基菌屬(ife thylophaga )，分枝桿菌屬 iMycobac teri訓(xùn) )，奈瑟球菌屬亞硝化單胞菌屬(yVitmsr遍諾卡爾菌屬念珠藻科(Nostoc), Novosphingobium，Octadecabacter，雖I]球菌屬(Paracoccus), Parvibaculum，短小盒菌屬 iParvularcula),消化鏈球菌屬 iPeptostreptococcus \ Phaeobacter,苯基桿菌屬 iPhenylobacterium)，發(fā)光細(xì)菌屬{Photobacterium\ Polaromonas,普雷沃氏菌屬 iPre vo tella )，假交替單胞菌屬 iPseudoal teromonas )，Pseudo vi bri ο,嗜冷桿菌屬 iPsychrobacter、，冷彎菌屬 iPsychroflexus\ 羅爾斯通氏菌屬 iRalstonia)，紅桿菌屬(Mhodobacter \紅球菌屬iRhodococcus、，紅育菌屬iRhodoferax\紅微菌屬(Rhodomicrobi訓(xùn) )，紅假單胞菌屬 iRhodopseudomonas )，紅螺菌屬(MhodospiriIlum )，玫瑰桿菌屬(Moseobacter、，Roseovariusj Ruegeria, Sagi斯瓦尼菌屬 iShewanella\Silicibacter,狹長(zhǎng)平胞屬 iStenotrophomonas、，眼點(diǎn)粘球菌屬 iStigmatella、，鏈霉菌屬{Streptomyces ), Sulfi tobacter, Sulfurimonas, Sulfurovum,聚球藻屬(Synechococcus ), Thalassi obi um,熱 求菌 M (Thermococcus ),高溫單 包菌 M (Thermomonospora ),Thioalkalivibrio，硫桿菌 MiiShiobaciIlus\ 硫微螺菌 HThiomicrospira),Thi omonas，冢村氏菌屬(Tsukamurella )，弧菌屬(Ki bri ο)或黃單胞菌屬 iXan thomonas )，其中特別優(yōu)選的是來(lái)自亞歷山大海洋柄菌、柄桿菌屬
aquaeolei 的那些。在該背景下，如果除了 AlkB以外提供alkG和alkT基因產(chǎn)物是有利的；這些可以是可從生產(chǎn)alkB基因產(chǎn)物的生物分離出的基因產(chǎn)物，或者是來(lái)自惡臭假單胞菌61/ /的alkG和alkT。優(yōu)選的醇脫氫酶是，例如，由WAJ基因編碼的酶(EC I. I. 99. 8)，尤其是由來(lái)自惡臭假單胞菌GPol的基因編碼的酶(van Beilen等人，Molecular Microbiology,(1992) 6 (21)，3121-3136)。來(lái)自惡臭假單胞菌 GPol、borkumensis^副百日咳博代氏菌iBordetella parapertussis、、支氣管炎博德特菌{Bordetellabronchiseptica )或 Roseobacter denitrifican 的 alk~S 基因的基因序列，可以參見(jiàn)例如 KEGG 基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes)。另外，優(yōu)選的醇脫氫酶是這樣的醇脫氫酶，其由來(lái)自選自下述的生物的基因編碼革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是假單胞菌，那里是假單胞菌屬尤其是門(mén)多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina),海洋柄菌屬i0cemiicmilis \優(yōu)選地亞歷山大海洋柄菌(Oceanicaulis alexandrii、HTCC2633，柄桿菌屬(Caulobac ter )，優(yōu)選地柄桿菌屬 K31 種，海洋桿菌屬 iMarinobacter\\jt選塊Marinobacter aquaeolei，特別優(yōu)選地iferi/ aquaeolei VT8,海洋焼徑降解菌屬{Alcani vorax )，優(yōu)選地 Alcani vorax borkumensis，醋桿菌屬(如<9 tobac ter )，無(wú)色桿菌屬{Achromobac ter )，嗜酸菌屬diphiIi訓(xùn) )，食酸菌屬(Acidovorax\ 氣微菌屬 Uieromicrobium\ Alkalilimnicola,交替單胞菌目{Alteromonadales),魚(yú)渥藻屬 iAnabaena \ Aromatoleum,固氮弧菌屬(Azoarcus),固氮螺菌屬(AzospiriIlum )，固氮菌屬(Azo tobac ter )，博德特菌屬iBorde tella )，短根瘤菌屬CSra辦伯霍爾德桿菌屬 IBurkhoIderia \ 綠菌屬 iChlorobium、，Citreicella,梭菌屬iClostridium、，科爾韋爾氏菌屬iColwellia、，叢毛平胞菌屬iComamonas、，Conexi bac ter，Congregi bac ter，棒桿菌屬{Corynebac teri um)，貪銅菌屬(Cupri a vi dus )，藍(lán)絲菌屬(Cyano thece )，代爾夫特菌屬(Melftia )，脫硫微菌屬U)esulfomi crobi um )，Desulfonatronospira, Dethiobacter，Dinoroseobacter·, ^If ^ M (BrytArobacter),弗朗西絲菌屬Glaciecolaj 大茶儀i (Mordonia), Grimontia, Hahella,鹽陸生菌屬iHalo terrigena )，鹽硫桿狀菌屬(Malo thi obaci Ilus )，Hoefl ea,生絲單胞菌屬{Hyphomonas), Janibacter, Jannaschia，Jonquetella,克雷伯菌屬{Klebsiella),軍團(tuán)病桿菌屬{Legionella、，Limnobacter, Lutiella,磁螺菌屬 iMagnetospiriIIum)，中間根瘤菌屬 iMesorhizobium\ Methylibium，甲基桿菌 iMethylobacterium、，嗷甲基菌屬(Methylophaga \分枝桿菌屬奈瑟球菌屬)，亞硝化單胞菌屬(Λ trosomonas)，諾卡爾菌屬 iNocardia ),念珠藻科 Qtostoe)，Novosphingobium，Octadecabacter，副球菌屬(Paracoccus), Parvibaculum,短小盒菌屬(Parvularcula ),消化鏈球菌屬 iPep tos trep tococcus )，Phaeobac ter，苯基桿菌屬 iPhenylobac teri um )，發(fā)光細(xì)菌屬iPhotobacteriuni)，Polaromonas,普雷沃氏菌屬iPrevotella \假交替單胞菌屬 iPseudoalteromonas、，Pseudovibrio，嗜冷桿菌屬 iPsychrobacter)，冷彎菌屬iPsychroflexus\羅爾斯通氏菌屬(Malstonia \紅桿菌屬iRhodobacter \紅球菌 屬iRhodococcus、，紅育菌屬iRhodoferax\紅微菌屬iRhodomicroMim)，紅假單胞菌M(Mhodopseudomonas\ 紅螺菌 HRhodospiriIIirn)，玫瑰桿菌 M\iRoseobacter\Roseovarius, Ruegeria, Sagi ttula,斯瓦尼菌 M iShewanella), Silicibacter，I夾長(zhǎng)平胞屬 iStenotrophomonas\ 眼點(diǎn)粘球菌屬 iStigmatella、，鏈霉菌屬 iStreptomyces\Sulfi tobac ter, Sulfurimonas, Sulfurovum j 1 ] iSynechococcus), Thalassi obi um,熱球菌 M (Thermococcus ),高溫單抱菌 M (Thermomonospora ), Thioalkalivibrio，硫桿菌屬iThiobacillus\硫微螺菌屬iThiomicrospira\ Thiomonas，冢村氏菌屬(Tsukamurella )，弧菌屬(Ki bri ο )或黃單胞菌屬 iXan thomonas )。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物的特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物的生產(chǎn)在天然宿主中由二環(huán)丙基酮誘導(dǎo)；在該背景下，另外優(yōu)選地，alkL基因的表達(dá)作為一組基因的一部分，例如在調(diào)節(jié)子例如操縱子中進(jìn)行。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的alkL基因產(chǎn)物優(yōu)選地由來(lái)自下述生物的alkL基因編碼，所述生物選自革蘭氏陰性細(xì)菌組，尤其是含有下述生物、優(yōu)選地由下述生物組成的組假單胞菌，特別是惡臭假單胞菌，尤其是惡臭假單胞菌GPol和P1、固氮菌屬、Desulfi伯霍爾德桿菌屬、優(yōu)選洋蔥伯克霍爾德菌iBurkholderia cepacia、、黃單胞菌屬(Janthomonas')、紅桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬、代爾夫特菌屬和立克次體屬
)、海洋柄菌屬、優(yōu)選亞歷山大海洋柄菌^7iX2633、柄桿菌屬iCaulobacter、、優(yōu)選地柄桿菌屬K31種、海洋桿菌屬、優(yōu)選^Marinobacter aquaeoleiΛ特別優(yōu)選Marinobacter aquaeolei VT8 和紅假單胞菌屬。如果所述alkL基因產(chǎn)物源自與形成根據(jù)本發(fā)明使用的氧化酶不同生物則是有利的。在該背景下，非常特別優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物由來(lái)自惡臭假單胞菌GPol和Pl的alkL基因編碼，所述基因由Seq ID Nr. I和Seq ID Nr. 3描述，以及具有多肽序列Seq IDNr. 2或Seq ID Nr. 4的蛋白，或是具有下述多肽序列的蛋白相對(duì)于Seq ID Nr. 2或SeqID Nr. 4，在所述多肽序列中最多60%、優(yōu)選地最多25%、特別優(yōu)選地最多15%、尤其是最多
10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸殘基通過(guò)刪除、插入、置換或它們的組合被修飾，且所述產(chǎn)物仍然具有各個(gè)參照序列Seq ID Nr. 2或Seq ID Nr. 4的蛋白的活性的至少50%、優(yōu)選65%、特別優(yōu)選80%、尤其是超過(guò)90%，其中參照蛋白的100%活性被理解為與不存在參照蛋白的生物催化劑的活性相比，用作生物催化劑的細(xì)胞的活性(換而言之，單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)的量)(基于使用的細(xì)胞重量計(jì)，單位/克細(xì)胞干質(zhì)量(細(xì)胞干重)[U/gCDW])的增加,更確切地說(shuō)，在實(shí)施例所述的系統(tǒng)中，其中作為氧化酶使用來(lái)自惡臭假單胞菌GPol的alkBGT的基因產(chǎn)物用于在大腸桿菌細(xì)胞中將月桂酸甲酯轉(zhuǎn)化成12-羥基月桂酸甲酯。選擇用于測(cè)定氧化速率的方法可以參見(jiàn)實(shí)施例。這里的單位的定義，是酶動(dòng)力學(xué)中的常規(guī)定義。I單位的生物催化劑在I分鐘內(nèi)將IMmol的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。
] Ρ — I - ] / Yp · -；·.I·4-V-·* k - I - Λ- ! I i' 4 I不會(huì)導(dǎo)致給定的多肽的性質(zhì)和功能的重大變化的給定多肽序列的氨基酸殘基的修飾，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，有些氨基酸經(jīng)?？梢匀菀椎乇舜私粨Q；這樣的合適的氨基酸置換的實(shí)例是
Ala 置換 Ser ；Arg 置換 Lys ；Asn 置換 Gln 或 His ；Asp 置換 Glu ；Cys 置換 Ser ；Gln 置換Asn ;Glu 置換 Asp ;Gly 置換 Pro ;His 置換 Asn 或 Gln ;Ile 置換 Leu 或 Val ;Leu 置換 Met 或Val ；Lys 置換 Arg 或 Gln 或 Glu ；Met 置換 Leu 或 lie ；Phe 置換 Met 或 Leu 或 Tyr ；Ser 置換Thr ；Thr置換Ser ；Trp置換Tyr ；Tyr置換Trp或Phe ；Val置換Ile或Leu。同樣已知，特另Ij在多肽的N-或C-端處例如以氨基酸插入或刪除的形式的修飾經(jīng)常對(duì)多肽的功能沒(méi)有重大影響。一種根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法的特征在于，所述其它基因產(chǎn)物選自下述的至少一種
AlkB、AlkF、AlkG、AlkH、AlkJ 和 AlkK,
尤其是 AlkF、AlkG、AlkH、AlkJ 和 AlkK，
其中其它基因產(chǎn)物尤其選自含有下述基因組合，優(yōu)選地由下述基因組合組成alkBF、alkBG、alkFG、alkBJ、alkFJ、alkGJ、alkBH、alkFH, alkGH、alkJH、alkBK、alkFK、alkGK、alkJK、alkHK、alkBFG、alkBFJ、alkBFH、alkBFK、alkBGJ、alkFGJ、alkBGH、alkFGH、alkBGK、alkFGK、alkBJH、alkFJH、alkGJH、alkBJK、alkFJK、alkGJK、alkFHK、alkBHK、alkFHK、alkGHK、alkBG JH、alkBGJK、alkBGHK、alkBFGJ、alkBFGH、alkFG JH、alkBFGK、alkFG JK、alkGJHK、alkBFJH、alkBFJK、alkFJHK、alkBFHK、alkBFG JH、alkBFG JK 和 alkBFG JHK，
尤其是 alkFHJK 和 alkBFGHJK。如果所述氧化酶和所述alkL基因產(chǎn)物由微生物提供，則對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的方法而言是有利的。在該情況下，兩種酶可以各自在一種微生物中各自分別提供，或在一種微生物中一起提供，其中后者是優(yōu)選的。因此，一種根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方法的特征在于，它在至少一種微生物中或在包圍至少一種微生物的培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述微生物提供所述氧化酶和所述alkL基因產(chǎn)物。在該背景下優(yōu)選的是，在至少一種微生物中重組地提供所述氧化酶和所述alkL基因產(chǎn)物。那么下述關(guān)于重組生產(chǎn)的評(píng)論不僅與氧化酶有關(guān)，而且與alkL基因產(chǎn)物有關(guān)。
原則上，重組生產(chǎn)可以如下實(shí)現(xiàn)增加編碼所述蛋白的一個(gè)或多個(gè)基因序列的拷貝數(shù)，使用經(jīng)修飾的啟動(dòng)子，修改基因的密碼子使用，以多種方式增加mRNA或酶的半衰期，修改基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，或使用編碼對(duì)應(yīng)蛋白的基因或等位基因，和任選地，組合這些措施。具有這樣的基因供給的細(xì)胞例如用含有下述希望的基因、該基因的等位基因或其部分，和使得所述基因的表達(dá)成為可能的啟動(dòng)子的載體通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或這些方法的組合來(lái)制備。尤其通過(guò)將所述基因或等位基因整合進(jìn)細(xì)胞的染色體或染色體外復(fù)制的載體中，使得異源表達(dá)成為可能。就異檸檬酸裂合酶的實(shí)例而言，在EP0839211中給出了在細(xì)胞中重組生產(chǎn)的可能性的綜述，在此將該文獻(xiàn)作為引用并入本文，且其關(guān)于在細(xì)胞中重組生產(chǎn)的可能性的公開(kāi)內(nèi)容，形成本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的一部分。上述和所有在下文中提及的蛋白質(zhì)和/或基因的提供和/或生產(chǎn)和/或表達(dá)均是借助于I維和2維凝膠電泳和隨后使用相應(yīng)的評(píng)價(jià)軟件對(duì)凝膠中的蛋白濃度進(jìn)行光學(xué)鑒別可檢測(cè)的。如果發(fā)現(xiàn)的表達(dá)性能僅僅是基于增加對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)，則可以通過(guò)對(duì)比野生型和遺傳修飾的細(xì)胞之間的I維或2維蛋白分離，以簡(jiǎn)單的方式定量測(cè)定重組表達(dá)。在棒狀桿菌的情況下，用于制備蛋白凝膠和用于鑒別蛋白的常規(guī)方法，是Hermann等人(Electrophoresis, 22: 1712. 23 (2001))描述的做法。同樣可以如下分析蛋白濃度 通過(guò)使用對(duì)要檢測(cè)的蛋白特異性的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡雜交(Sambrook等人，MolecularCloning: a laboratory manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989),隨后使用用于濃度測(cè)定的相應(yīng)軟件進(jìn)行光學(xué)評(píng)價(jià)(Lohaus和 Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), AngewandteChemie 111: 2630-2647)。如果通過(guò)增加蛋白的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，則例如增加對(duì)應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子-和調(diào)節(jié)區(qū)域或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。另外，通過(guò)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可以增加在任意的時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。但此外，也可以將所謂的“增強(qiáng)子”指定給蛋白基因作為調(diào)控序列，它們通過(guò)RNA聚合酶和DNA之間改善的相互作用同樣起增加基因表達(dá)的作用。通過(guò)延長(zhǎng)mRNA的壽命的措施，同樣改善表達(dá)。為了增加各個(gè)基因的重組表達(dá)，使用例如附加型質(zhì)粒?？梢钥紤]的質(zhì)粒或載體原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用于該目的的所有實(shí)施方式。這樣的質(zhì)粒和載體可以參見(jiàn)，例如，來(lái)自 Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech 或 Gibco BRL 的公司小冊(cè)子。其它優(yōu)選的質(zhì)粒和載體可以參見(jiàn)Glover, D. Μ. (1985), DNA cloning: a practicalapproach,第 I-III 卷，IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R. L.和Denhardt, D. T.(編)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologousgene expression, Methods EnzymoI. 185, 3-7; Sambrook, J. ; Fritsch, E. F.和Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 第 2版，ColdSpring Harbour Laboratory Press, New York。然后通過(guò)接合或轉(zhuǎn)化，將含有要擴(kuò)增的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)希望的菌株中。接合的方法例如描述于 Schjifer 等人，Applied and Environmental Microbiology 60:756-759 (1994)。用于轉(zhuǎn)化的方法例如描述于 Thierbach 等人，Applied Microbiologyand Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican 和 Shivnan, Bio/Technology 7:1067-1070 (1989)，以及 Tauch 等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 123: 343-347(1994)。在借助于“交叉”事件進(jìn)行同源重組以后，得到的菌株含有有關(guān)基因的至少2個(gè)拷貝。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地使用重組微生物，由于良好的遺傳可達(dá)性，所述微生物優(yōu)選地選自細(xì)菌，尤其是革蘭氏陰性細(xì)菌，特別選自含有下述生物，優(yōu)選地由下述生物組成的組大腸桿菌、假單胞菌屬sp.)、突光假單胞菌(AeWtZofflmasfluorescens)、惡臭假單胞菌、食酸假單胞菌iPseudomorms acidovorans)、銅綠假單抱菌 iPsGudomorms aeruginosa )、食酸菌屬 dit/o vorax sp.)、溫和假單胞菌(Jcido vorax
)、不動(dòng)桿菌屬sp.)、伯霍爾德桿菌屬sp.)、氰
基細(xì)菌(Cyanobacteria)、克雷伯菌屬(Z/e/wieJJa sp.)、沙門(mén)菌屬sp.)、根瘤菌屬sp.)和苜猜根瘤菌膨7i7oii),其中大腸桿菌是特別優(yōu)選的。 在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞同樣是本發(fā)明的組成部分。因此，經(jīng)這樣遺傳修飾的微生物是本發(fā)明的主題，所述微生物增強(qiáng)合成至少一種氧化有機(jī)物質(zhì)的酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物，其中獨(dú)立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物而合成所述alkL基因產(chǎn)物。在該背景下，優(yōu)選的氧化酶是在根據(jù)本發(fā)明的方法中優(yōu)選地使用的相同氧化酶；類(lèi)似地適用于優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物、由含有alkL基因的alk操縱子編碼的優(yōu)選基因產(chǎn)物、優(yōu)選的有機(jī)物質(zhì)以及優(yōu)選的微生物。本發(fā)明的另一個(gè)主題是，alkL基因產(chǎn)物，優(yōu)選在微生物中，用于增加至少一種氧化有機(jī)物質(zhì)的酶的氧化速率的用途，其特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物的使用獨(dú)立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物而進(jìn)行。在該背景下，所述氧化優(yōu)選地是將有機(jī)物質(zhì)氧化成醛或醇，尤其是氧化成醇。因此，在該背景下，優(yōu)選地增加羥基化速率，尤其是在羧酸的ω -位置，優(yōu)選地與羧酸及其酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的ω-羥基化的化合物，尤其是十二烷酸甲酯轉(zhuǎn)化成羥基十二烷酸甲酯有關(guān)。在該背景下，優(yōu)選的氧化酶是在根據(jù)本發(fā)明的方法中優(yōu)選地使用的相同氧化酶；類(lèi)似地適用于優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物、由含有alkL基因的alk操縱子編碼的優(yōu)選基因產(chǎn)物、優(yōu)選的有機(jī)物質(zhì)以及優(yōu)選的微生物。 在下文詳述的實(shí)施例中，示例性地描述了本發(fā)明，而不應(yīng)將本發(fā)明限于在所述實(shí)施例中提及的實(shí)施方式中，本發(fā)明的應(yīng)用范圍源自整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)。下面的附圖是實(shí)施例的組成部分
圖I:大腸桿菌質(zhì)?！皃BT10_alkL”。實(shí)施例
對(duì)比實(shí)施例I:來(lái)自惡臭假單胞菌GPol的AlkBGT烷烴羥化酶體系的表達(dá)載體，其沒(méi)有
alkL
從 pCOM 體系(Smits 等人，2001 Plasmid 64: 16-24)開(kāi)始，生產(chǎn)構(gòu)建體 pBTIO (SeqID Nr. 5)，其含有來(lái)自惡臭假單胞菌的3種組分烷烴羥化酶(AlkB)、紅素氧還蛋白(AlkG)和紅素氧還蛋白還原酶(AlkT)。為了表達(dá)這3個(gè)基因，將alkBFG基因序列置于alkB啟動(dòng)子控制下，并將alkT基因置于alkS啟動(dòng)子控制下。
為了簡(jiǎn)化alkB和alkG的克隆，與alkB和alkG 一起擴(kuò)增和克隆位于二者之間的基因alkF。AlkF對(duì)于要催化的反應(yīng)而言不是重要的。載體pBTIO的制備的詳細(xì)描述，可以參見(jiàn)W02009077461。實(shí)施例I:來(lái)自惡臭假單胞菌GPol的AlkBGT烷烴羥化酶體系的表達(dá)載體，其具有alkL
在另一個(gè)方案中，將alkL基因靶向克隆進(jìn)alkBFG操縱子中，以便能夠與氧化所需的酶的最小集合(Minimalsatz) —起合成它。為此目的，通過(guò)PCR，擴(kuò)增 pGEc47 (Eggink 等人，1987，J Biol Chem 262，17712-17718)的 alkL 基因。
為此使用的引物Pl和P2在靶序列之外同樣含有SalI限制酶切位點(diǎn)，用于克隆進(jìn)質(zhì)粒pBTIO的SalI限制酶切位點(diǎn)。此外，將終止密碼子摻入在SalI限制酶切位點(diǎn)下游的正向引物Pl中，以終止可能的alkH殘基翻譯。
Pl ACGCGTCGACCTGTAACGACAACAAAACGAGGGTAG (Sec ID Kr. 6)P2 ACHGTCGAa:TK'GACAGTGACAGACCTG (Sec ID K'r, 7}
為了擴(kuò)增，使用了 Finnzyme Phusion 聚合酶(New England Biolabs)。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，混合34μ1 Η20、10μ1 5 XPhusion HF緩沖液、 μ dNTPs (各10 mM)U. 25μ1 Ρ1、1·25μ1 Ρ2 (對(duì)于 O. 5μΜ 的末端引物濃度)、2μ1 pGEc47 質(zhì)粒溶液(150ng/μ )和O. 5μ1 Phusion聚合酶，并在薄壁PCR埃彭道夫管中用于PCR。根據(jù)聚合酶生產(chǎn)商的提議，將下述PCR方案程序化
[980C /30 秒]，([98 /10 秒][72 /60 秒])30χ, [72°C /10 分鐘]
根據(jù)生產(chǎn)商的方案，借助于“peqGOLD循環(huán)純化試劑盒”(PEQLAB Biotechnology GmbH,Erlangen)，純化得到的具有754 bp長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，并用T4多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化。為此，將15μ1純化得到的PCR產(chǎn)物溶液與2μ1 ATP溶液(100 mM)、2μ1激酶緩沖液和 μ Τ4多核苷酸激酶混合，并在37°C溫育20分鐘。然后通過(guò)加熱至75°C持續(xù)10分鐘，將該酶滅活。然后，根據(jù)生產(chǎn)商的方案，現(xiàn)將如此制備的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)來(lái)自Iucigen公司的PSMART載體中。通過(guò)熱激(42°C持續(xù)45秒)，將2μ1連接批次轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)的DH5 α大腸桿菌細(xì)胞中。在卡那霉素平板上過(guò)夜溫育以后，在液體培養(yǎng)基(5 ml含有3(^g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基)中在37°C培養(yǎng)選擇的菌落過(guò)夜，并借助于peqGOLD Miniprep試劑盒(PEQLABBiotechnologie GmbH (Erlangen))分離質(zhì)粒。通過(guò)用SalI進(jìn)行限制酶切，并隨后進(jìn)行凝膠電泳，鑒別出正確地連接的質(zhì)粒。以較大的量制備這樣的質(zhì)粒，并用SalI切割。通過(guò)瓊脂糖凝膠(peqGOLD凝膠提取試劑盒)的純化，分離得到的693 bp片段。質(zhì)粒pBTIO同樣以較大的量來(lái)制備，并用SalI切割，并使用堿性磷酸酶(小牛腸[堿性]磷酸酶，CIP) (NEB)將末端去磷酸化。這些操作在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)進(jìn)行。為此，將13. 3μ1質(zhì)粒DNA與4μ1緩沖液、
19.2μ1水、2μ1堿性磷酸酶和I. 5μ1 Sail (NEB)相混合，并在37°C溫育2 h。通過(guò)瓊脂糖凝膠，如上所述地同樣純化切割并去磷酸化的載體。為了在連接中設(shè)置載體和插入片段的正確比例，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，確定相應(yīng)的DNA溶液的濃度。為了連接，將10μ1切割的載體-DNA溶液與5μ1插入片段-DNA溶液相混合，以使DNA質(zhì)量比為1: 5，摻入2μ1連接酶緩沖液、 μ 水以及 μ 連接酶，然后在22°C溫育2 h，此后在4°C過(guò)夜孵育。通過(guò)電穿孔，將5μ1該批次轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5 α大腸桿菌細(xì)胞中。在5 ml含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)卡那霉素抗性的菌落過(guò)夜，并如上所述制備質(zhì)粒。通過(guò)EcoRV限制酶切來(lái)自5個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，在三種情況下，分別顯示出在8248Bp,2234 Bp和1266 Bp的帶。該模式證實(shí)了 alkL的正確克隆。 得到的質(zhì)粒被稱(chēng)作pBT10_alkL (參見(jiàn)

圖1)，且具有Seq ID Nr. 8。實(shí)施例2:月桂酸甲酯向ω-羥基月桂酸甲酯的轉(zhuǎn)化
為了生物轉(zhuǎn)化，通過(guò)在42°C持續(xù)2 min的熱激，將質(zhì)粒pBTIO或pBT10_alkL轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)的菌株大腸桿菌 W3110 中(Hanahan D. , DNA cloning: A practical approach.IRL Press, Oxford, 109-135)。為了合成羥基月桂酸甲酯，在100 ml含有30 mg/1卡那霉素的 M9 培養(yǎng)基(Na2HPO4 6 g/1, KH2PO4 3 g/1, NaCl 0.5 g/1, NH4Cl I g/1, 2 mM MgSO4,0.1 mM CaCl2, 0.5%葡萄糖)中，在30°C和180 rpm下過(guò)夜培養(yǎng)大腸桿菌W3110_pBT10和W3110-pBT10_alkL，并通過(guò)離心進(jìn)行收獲。在無(wú)菌條件下，在250 ml含有0. 5%葡萄糖和30mg/ 卡那霉素的M9培養(yǎng)基中，重新懸浮部分生物質(zhì)，到0D450 = 0. 2，并在搖瓶中在30°C和180 rpm下進(jìn)一步培養(yǎng)。在4 h的生長(zhǎng)時(shí)間以后,通過(guò)加入0. 025% (v/v)的二環(huán)丙基酮,誘導(dǎo)alk基因的表達(dá)，并在相同條件下，將培養(yǎng)物振搖另外4小時(shí)。然后將細(xì)胞離心分離，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于KPi緩沖液(50 mM, pH 7.4)中，并置于調(diào)節(jié)溫度至30°C的生物反應(yīng)器中。設(shè)定約I. 8 g CDff/1的生物質(zhì)濃度。在劇烈攪拌(1500 min-1)和2 vvm (體積/體積*分鐘)的空氣流入下，以比例1:2將底物月桂酸甲酯加入細(xì)胞懸浮液中(100 ml細(xì)胞懸浮液，50 ml月桂酸甲酯)。使溫度保持恒定在30°C。通過(guò)反應(yīng)批次的GC分析，檢測(cè)羥基月桂酸甲酯的形成。為此，在作為陰性對(duì)照的Omin以后,和在150 min以后,通過(guò)反應(yīng)器的提升管,用注射器取樣,并在Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)中在2 ml埃彭道夫管中在13 200 rpm下離心5分鐘用于相分離。借助于氣相色譜法(Thermo Trace GC Ultra),分析有機(jī)相。使用的柱是 Varian Inc. FactorFourTM VF_5m，長(zhǎng)度30 m,膜厚度0. 25Mm,內(nèi)徑0· 25 mm。分析條件
烘箱溫度80-280°C
漸變速度15°C /min
分流比15
注射體積IW
載體流速I(mǎi). 5 ml/min
PTV 注射器80-280°C，在 15°C/s
檢測(cè)器基礎(chǔ)溫度320°C。
現(xiàn)在可以將測(cè)得的12-羥基月桂酸甲酯的形成速率轉(zhuǎn)化成生物催化劑的活性，并與使用的細(xì)胞團(tuán)相關(guān)聯(lián)。在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的線性范圍內(nèi)，由下式給出活性
權(quán)利要求
1.使用至少一種氧化酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物來(lái)氧化有機(jī)物質(zhì)的方法，其特征在于，獨(dú)立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物，提供所述alkL基因產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)物質(zhì)選自 支鏈的或無(wú)支鏈的、飽和的或不飽和的、任選地取代的烷烴、烯烴、炔烴、醇、醛、酮、羧酸、羧酸酯、胺和環(huán)氧化物，其中它們優(yōu)選地具有3-22個(gè)、尤其是6-18個(gè)、更優(yōu)選地8-14個(gè)、尤其是12個(gè)碳原子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)物質(zhì)選自 羧酸及其對(duì)應(yīng)的酯， 未被取代的烷烴，其具有3-22個(gè)碳原子， 未被取代的烯烴，其具有3-22個(gè)碳原子， 未被取代的一兀醇，其具有3-22個(gè)碳原子， 未被取代的醛，其具有3-22個(gè)碳原子， 未被取代的一兀胺，其具有3-22個(gè)碳原子 以及被取代的化合物，所述化合物尤其具有一個(gè)或多個(gè)羥基_、氨基_、酮_、羧基_、環(huán)丙基殘基-或環(huán)氧官能團(tuán)作為其它取代基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)物質(zhì)被氧化成醇，被氧化成醛，被氧化成酮，或被氧化成酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)物質(zhì)，尤其是羧酸或羧酸酯，在ω-位置處被氧化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述氧化酶是烷烴單加氧酶、二甲苯單加氧酶、醛脫氫酶、醇氧化酶或醇脫氫酶，優(yōu)選烷烴單加氧酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述烷烴單加氧酶是細(xì)胞色素-Ρ450單加氧酶，尤其是來(lái)自下述生物的細(xì)胞色素-Ρ450單加氧酶假絲酵母屬，例如熱帶假絲酵母，或植物，例如鷹嘴豆。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述烷烴單加氧酶是alkB基因產(chǎn)物，其由來(lái)自選自下述的生物的alkB基因編碼革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是假單胞菌，尤其是惡臭假單胞菌GPoI。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述醇脫氫酶是由基因編碼的醇脫氫酶，尤其是由來(lái)自下述的生物的a從J基因編碼的醇脫氫酶革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是假單胞菌，尤其是惡臭假單胞菌GPol。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物是由來(lái)自選自下述的生物的alkL基因編碼革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是假單胞菌，特別是惡臭假單胞菌，尤其是惡臭假單胞菌GPol和Pl,固氮菌屬伯霍爾德桿菌屬，優(yōu)選洋蔥伯克霍爾德菌，黃單胞菌屬，紅桿菌屬，羅爾斯通氏菌屬，代爾夫特菌屬和立克次體屬，海洋柄菌屬，優(yōu)選地亞歷山大海洋柄菌故iX2633，柄桿菌屬，優(yōu)選地柄桿菌屬K31種，海洋桿菌屬，優(yōu)選地iferifloAacier aquaeolei,特別優(yōu)選地iferifloAacier aquaeoleiVT8和紅假單胞菌屬。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物選自 由來(lái)自惡臭假單胞菌GPol和Pl的alkL基因編碼的蛋白，所述alkL基因由Seq ID Nr.I和Seq ID Nr. 3描述，和 具有多肽序列Seq ID Nr. 2或Seq ID Nr. 4的蛋白，或具有下述多肽序列的蛋白相對(duì)于Seq ID Nr. 2或Seq ID Nr. 4，在所述多肽序列中最多60%的氨基酸殘基通過(guò)刪除、插入、置換或它們的組合進(jìn)行修飾，且所述產(chǎn)物仍然具有各個(gè)參照序列Seq ID Nr. 2或SeqID Nr. 4的蛋白的活性的至少50%。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述其它基因產(chǎn)物選自下述的至少一種AlkB、AlkF、AlkG, AlkH, AlkJ 和 AlkK0
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在至少一種微生物中或在包圍至少一種微生物的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中的至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述氧化酶和所述alkL基因產(chǎn)物在微生物中重組地合成。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述微生物選自細(xì)菌，尤其是革蘭氏陰性，尤其是大腸桿菌、假單胞菌屬、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、食酸假單胞菌、銅綠假單孢菌、食酸菌屬、溫和假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬、伯霍爾德桿菌屬、氰基細(xì)菌、克雷伯菌屬、沙門(mén)菌屬、根瘤菌屬和苜蓿根瘤菌。
16.微生物，所述微生物被如此遺傳修飾，以至于其增強(qiáng)合成至少一種氧化有機(jī)物質(zhì)的酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物，其特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物獨(dú)立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物來(lái)合成。
17.alkL基因產(chǎn)物用于提高至少一種氧化有機(jī)物質(zhì)的酶的氧化速率的用途，其特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物的使用獨(dú)立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明的主題是借助于alkL基因產(chǎn)物來(lái)氧化有機(jī)化合物的生物催化方法以及在該方法中使用的微生物。
文檔編號(hào)C07K14/21GK102947328SQ201180030465
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者M.佩特, A.施密德, B.比勒, H-G.亨內(nèi)曼, M.K.祖爾辛格, S.沙費(fèi)爾, T.哈斯, M.施雷韋, S.科內(nèi)利森, M.羅斯, H.赫格 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限公司