專利名稱：抗癌融合蛋白的制作方法
抗癌融合蛋白本發(fā)明涉及治療性融合蛋白、特別是重組融合蛋白的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白的序列片段和短的促細(xì)胞調(diào)亡肽的序列的融合蛋白，包含它們的藥物組合物，它們在治療、特別是抗癌試劑中的用途，以及編碼所述融合蛋白的多核苷酸序列,包含所述多核苷酸序列的表達(dá)載體，以及包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。細(xì)胞調(diào)亡(程序性細(xì)胞死亡)是在預(yù)防癌癥和治療癌癥(使用誘導(dǎo)異常癌細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡的試劑)中具有重要作用的過程。細(xì)胞調(diào)亡的信號傳導(dǎo)可以起源于細(xì)胞外部(外部或死亡受體途徑)或起源于細(xì)胞內(nèi)部(內(nèi)部或線粒體途徑)。人類癌細(xì)胞中的外部細(xì)胞調(diào)亡途徑的激活需要配體與細(xì)胞死亡受體結(jié)合以激活受體。在配體結(jié)合之后，激活的受體誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡信號。通過線粒體途徑的細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)部細(xì)胞調(diào)亡的起始可以起始于不同水平的細(xì)胞調(diào)亡級聯(lián)以最終引起促細(xì)胞調(diào)亡蛋白(細(xì)胞色素c、SmaCDiablo、AIF、p53、BC12蛋白家族，包括BH3結(jié)構(gòu)域家族)的功能的誘導(dǎo)或恢復(fù)，核酸降解或胱天蛋白酶的激活。TRAIL蛋白屬于細(xì)胞因子家族(腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)性配體)，也被稱作Apo2L(Apo2-配體)，是腫瘤細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞中的細(xì)胞調(diào)亡的強有力的激活子。TRAIL是體內(nèi)天然產(chǎn)生的配體。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，編碼DNA序列和蛋白表達(dá)系統(tǒng)首次公開于EP0835305A1。TRAIL蛋白通過與促細(xì)胞調(diào)亡TRAIL表面受體I和2 (TRAIL-R1/R2)結(jié)合并隨后激活這些受體來發(fā)揮其抗癌活性。這些受體，也被稱作DR4和DR5(死亡受體4和死亡受體5)，屬于TNF受體家族并且在不同類型的癌癥細(xì)胞上過表達(dá)。所述受體的激活可誘導(dǎo)獨立于抑制基因P53的外部細(xì)胞調(diào)亡信號傳導(dǎo)途徑，其通過激活的胱天蛋白酶-8引起執(zhí)行性胱天蛋白酶的激活，從而降解核酸。在TRAIL激活后釋放的胱天蛋白酶-8也可引起B(yǎng)id蛋白的釋放，從而間接激活線粒體途徑，Bid蛋白轉(zhuǎn)位至線粒體，在那里其刺激細(xì)胞色素c的釋放，因此間接擴大來自死亡受體的細(xì)胞調(diào)亡信號。TRAIL選擇性作用于腫瘤細(xì)胞，基本上不誘導(dǎo)健康細(xì)胞的調(diào)亡，健康細(xì)胞對該蛋白是抗性的。因此，認(rèn)識到TRAIL作為抗癌試劑的巨大潛力，其作用于多種不同類型的腫瘤細(xì)胞，包括血液惡性腫瘤和實體腫瘤，同時不影響正常細(xì)胞并顯示出潛在相對小的副作用。TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281個氨基酸的長度，在被蛋白酶切割后，其包含氨基酸殘基114-281的細(xì)胞外區(qū)域形成大小為20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是生物活性的。TRAIL和sTRAIL這兩種形式都能通過與存在于靶細(xì)胞上的TRAIL受體相互作用而激發(fā)細(xì)胞調(diào)亡。使用細(xì)胞系測試證明了 TRAIL分子的可溶性部分的強烈的抗腫瘤活性和非常低的系統(tǒng)性毒性。同樣，對于具有對應(yīng)于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重組人可溶性TRAIL (rhTRAIL)(在INN下稱作dulanermin)的人類臨床研究顯示出其良好的耐受性并且沒有劑量限制性毒性。近期的研究顯示TRAIL蛋白可具有比氨基酸114-281更短的形式，以這種形式也能結(jié)合DR家族的膜受體(死亡受體DR1、DR2、DcRU DcR2和0PG)并通過這些受體誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡(F. , FANG, A. , WANG, S. , F. , YANG, Anti tumor activity of a novelrecombinant mutanthuman tumor necrosis factor-related apoptosis-inducingligand, ActaPharmacologica Sinica2005Nov;26(11):1373 - 1381)。最近報道的重組TRAIL蛋白對于肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)似乎與修飾即多聚組氨酸標(biāo)簽相關(guān)，非標(biāo)簽化的TRAIL不顯示系統(tǒng)性毒性。然而，在進(jìn)一步研究和開發(fā)的過程中，很多癌癥細(xì)胞似乎也顯示出對于TRAIL的原發(fā)性或獲得性抗性(見例如W02007/022214)。雖然對于TRAIL的抗性的機理尚未完全了解，但是相信其可在不同水平的TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡途徑表現(xiàn)其自己，從細(xì)胞表面上的受體水平到信號傳導(dǎo)途徑內(nèi)的執(zhí)行性胱天蛋白酶。這種抗性限制了 TRAIL作為抗癌試劑的有用性。此外，在對患者進(jìn)行的臨床試驗中證明，TRAIL作為單一治療的實際有效性是低下的。為了克服這種低的效率和腫瘤對TRAIL的抗性，設(shè)計了與放療和化療試劑的多種組合治療，其產(chǎn)生了協(xié)同性細(xì)胞調(diào)亡效應(yīng)(W02009/002947; A. Almasan andA. Ashkenazi, CytokineGrowth Factor Reviewsl4(2003)337-348;RK Srivastava, Neoplasis, Vol3，No6, 2001，535-546，Soria JC et al. , J. Clin. Oncology, Vol28, No9 (2010), p. I527-1533)。在W02009/140469中描述了 rhTRAIL與所選擇的常規(guī)的化療試劑(紫杉醇、卡鉬)和單克隆抗-VEGF抗體組合用于癌癥治療的用途。然而，此類組合必然意味著公知的常規(guī)化療或放療的缺陷。包含通過金屬蛋白酶切割位點連接子連接的血管生成抑制劑血管抑制素(vasostatin)和TRAIL的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為在腫瘤細(xì)胞中顯示出誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的效應(yīng)，見 A. I. Guo et al, ChineseJournal of Biochemistry and MolecularBiology2008, vol. 24(10)，925-930。包含血管生成抑制劑腫瘤抑素(tumstatin)的Tumstatinl83_230和TRAIL114-281的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為顯示出誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡，見N. Ren et al, Academic Journal of Second MilitaryMedical University2008, vol. 28(5)，676-478。US2005/244370和對應(yīng)的W02004/035794公開了 TRAIL95-281 的構(gòu)建體，其作為效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，通過肽連接子與作為細(xì)胞表面結(jié)合結(jié)構(gòu)域的TNF家族配體的另一成員CD40的細(xì)胞外部分連接。其指出該構(gòu)建體的激活是通過其CD40部分的結(jié)合。此外，與TRAIL治療相關(guān)的問題已被證明是其低穩(wěn)定性和在施用后從體內(nèi)迅速被消除。雖然目前可獲得很多臨床癌癥治療法，但是它們通常不夠有效并且具有很多熟知的缺點，其中最令人苦惱和限制治療的缺點之一是缺乏針對癌細(xì)胞的選擇性、嚴(yán)重的副作用和抗性——原發(fā)性的或在治療過程中獲得的。目前，僅已知有限數(shù)目的既有效又對癌細(xì)胞具有選擇性的抗癌試劑。因此，對于能夠擴大可用的試劑的范圍并發(fā)現(xiàn)更有效(細(xì)胞毒性)和選擇性的試劑的需求仍然是迫切的和未滿足的。也需要具有增強的穩(wěn)定性和改善的藥代動力學(xué)的新的選擇性試劑。本發(fā)明提出了解決該問題的方案提供了新的融合蛋白，其包含源自TRAIL的結(jié)構(gòu)域和具有內(nèi)部(細(xì)胞內(nèi))或外部(細(xì)胞外)促細(xì)胞調(diào)亡活性的短的效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域，所述短的效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域不包括TRAIL片段，其增強或補充TRAIL的作用。此外，在很多情況下，本發(fā)明的融合蛋白被證明顯示出比可溶性TRAIL及其變體(包括序列的片段)更強的活性，在很多情況下還克服了對于TRAIL的抗性。此外，效應(yīng)子肽的加入引起了延長的半衰期和蛋白在腫瘤中的延長的保留并最終增強了其功效。


現(xiàn)在將通過閱讀附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。圖I顯示了根據(jù)Ex. UEx. 2、Ex. 3、Ex. 4和Ex. 5的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。圖2 顯示了根據(jù) Ex. 6、Ex. 7、Ex. 8、Ex.結(jié)構(gòu)。圖
意性結(jié)構(gòu)。圖意性結(jié)構(gòu)。圖
顯示了根據(jù) Ex. 11、Ex. 12、Ex. 13、顯示了根據(jù) Ex. 16、Ex. 17、Ex. 18、
9和Ex. 10的本發(fā)明的融合蛋白的示意性Ex. 14和Ex. 15的本發(fā)明的融合蛋白的示Ex. 19和Ex. 20的本發(fā)明的融合蛋白的示的本發(fā)明的融合蛋白以及Ex. 24,Ex. 25和Ex. 30和Ex. 31的本發(fā)明的融合蛋白的示Ex. 35和Ex. 36的本發(fā)明的融合蛋白的示Ex. 40和Ex. 41的本發(fā)明的融合蛋白的示Ex. 45和Ex. 46的本發(fā)明的融合蛋白的示10顯示了根據(jù)Ex. 47、Ex. 48、Ex. 49、Ex. 50和Ex. 51的本發(fā)明的融合蛋白的示11顯示了根據(jù)Ex. 52、Ex. 53、Ex. 54和Ex. 55的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)
6顯示了根據(jù) Ex. 27、Ex. 28、Ex. 29、
7顯示了根據(jù) Ex. 32、Ex. 33、Ex. 34、
9 顯示了根據(jù) Ex. 42、Ex. 43、Ex. 44、
顯示了根據(jù) Ex. 21、Ex. 22 和 Ex. 23Ex. 26的比較性融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。圖意性結(jié)構(gòu)。圖意性結(jié)構(gòu)。圖8 顯示了根據(jù) Ex. 37、Ex. 38、Ex. 39、
意性結(jié)構(gòu)。圖意性結(jié)構(gòu)。圖意性結(jié)構(gòu)。圖構(gòu)。圖12顯示了負(fù)載了結(jié)腸癌Colo205、以本發(fā)明的融合蛋白治療的SCID/N0D小鼠中的腫瘤體積隨時間的變化，與使用hTRAIL114-281治療的小鼠比較。圖13顯示了負(fù)載了結(jié)腸癌Colo205、以本發(fā)明的融合蛋白治療的小鼠在實驗第29天的腫瘤生長抑制值，與使用hTRAILl 14-281治療的小鼠比較。圖14顯示了負(fù)載了人肺癌NCI-H460、以本發(fā)明的融合蛋白治療的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的腫瘤體積隨時間的變化，與使用hTRAIL114_281治療的小鼠比較。圖15顯示了負(fù)載了人肺癌NCI-H460、以本發(fā)明的融合蛋白治療的小鼠在實驗第29天的腫瘤生長抑制，與使用hTRAILl 14-281治療的小鼠比較。圖16顯示了負(fù)載了人小細(xì)胞肺癌A549、以本發(fā)明的融合蛋白治療的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的腫瘤體積隨時間的變化，與使用hTRAIL114_281治療的小鼠比較。圖17顯示了負(fù)載了人小細(xì)胞肺癌A549、以本發(fā)明的融合蛋白治療的小鼠在實驗第34天的腫瘤生長抑制，與使用hTRAILl 14-281治療的小鼠比較。圖18顯示了負(fù)載了人胰腺癌上皮樣細(xì)胞系PANC-1、以本發(fā)明的融合蛋白治療的小鼠Crl:SHO-PrkdcscidHrhr中的腫瘤體積隨時間的變化，與使用hTRAIL114_281治療的小鼠比較。圖19顯示了負(fù)載了人胰腺癌上皮樣細(xì)胞系PANC-1、以本發(fā)明的融合蛋白治療的小鼠在實驗第43天的腫瘤生長抑制，與使用hTRAILl 14-281治療的小鼠比較。圖 20 顯示了 Ex. I, Ex. 2，Ex. 14，Ex. 24，Ex. 51 和 Ex. 42 的融合蛋白以及rhTRAI114-281的圓二色性光譜，以比橢圓性(specific ellipticity)表示。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含結(jié)構(gòu)域(a)，其為可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或與其具有至少70%同源性的序列，和結(jié)構(gòu)域(b)，其為促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽的序列，其通過內(nèi)部細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮其促細(xì)胞調(diào)亡作用，其中結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端。術(shù)語“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”應(yīng)該被理解為指可溶性hTRAIL的任何能夠誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡信號的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識到TRAIL的70%的同源性的存在是本領(lǐng)域已知的。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“肽”應(yīng)被理解為從通過肽鍵連接在一起的多個氨基酸的分子構(gòu)建物。因此，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“肽”包括寡肽、多肽和蛋白質(zhì)。應(yīng)該理解，本發(fā)明的融合蛋白中的效應(yīng)子肽的結(jié)構(gòu)域(b )不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分。在本發(fā)明中，肽的氨基酸序列將以本領(lǐng)域采納的常規(guī)方式表示，從肽的N末端(N-端)至其C末端(C-端)。因此，任何序列均為左側(cè)為N末端，右側(cè)為C末端。本發(fā)明的融合蛋白可包含效應(yīng)子肽的單一結(jié)構(gòu)域(b)，其連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端或N末端。本發(fā)明的融合蛋白也可以包含效應(yīng)子肽的2個結(jié)構(gòu)域(b)，在這種情況下，一個結(jié)構(gòu)域(b)連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端,另一個連接于結(jié)構(gòu)域(a)的N末端。當(dāng)本發(fā)明的融合蛋白包含效應(yīng)子肽的2個結(jié)構(gòu)域(b)時，這些結(jié)構(gòu)域可以是相同或不同的。優(yōu)選地，在該情況下，結(jié)構(gòu)域(b)是不同的。在具體實施方式
中，結(jié)構(gòu)域(a)是hTRAIL序列的片段，始于hTRAIL114至hTRAIL121 (含端點)的氨基酸，終于氨基酸hTRAIL281，或公開于GenBank登記號P50591的hTRAIL序列的其他功能片段。特別地，結(jié)構(gòu)域(a)可以選自對應(yīng)于下列的序列hTRAILl 14-281 (SEQ.No. 27), hTRAILl19-281(SEQ. No. 28)和 hTRAIL121-281(SEQ. No. 29), hTRAILl16-281 和hTRAIL120-281o在另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(a)可以是序列hTRAIL95_281。
結(jié)構(gòu)域(b)的促細(xì)胞調(diào)亡效應(yīng)子肽，通過內(nèi)部細(xì)胞調(diào)亡途徑(細(xì)胞內(nèi)地)發(fā)揮其細(xì)胞調(diào)亡活性，可通過激活細(xì)胞調(diào)亡的線粒體途徑的信號傳導(dǎo)級聯(lián)成分直接誘導(dǎo)調(diào)亡，或通過直接誘導(dǎo)細(xì)胞中的線粒體細(xì)胞調(diào)亡而誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。在本發(fā)明的融合蛋白的一個實施方式中，效應(yīng)子肽是選自下列的通過內(nèi)部細(xì)胞調(diào)亡途徑作用的肽SEQ. No. 30，No. 31, SEQ. No. 32，SEQ. No. 33，SEQ. No. 34，SEQ.No. 35，SEQ. No. 36，SEQ. No. 37，SEQ. No. 38，SEQ. No. 39，No. 40，SEQ. No. 41，SEQ. No. 42，SEQ.No. 43，SEQ. No. 44，SEQ. No. 45，SEQ. No. 46，和 SEQ. No47,或 SEQ. No. 151，SEQ. No. 152，SEQ.No. 153，SEQ. No. 154，SEQ. No. 155，SEQ. No. 156，SEQ. No. 157，SEQ. No. 158SEQ. No. 159，SEQ.No. 160，No. 161，SEQ. No. 162，SEQ. No. 163，SEQ. No. 164，SEQ. No. 165 和 SEQ. No. 166。上述組的SEQ. NO. 30的效應(yīng)子肽是源自Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的肽，其抑制抗細(xì)胞調(diào)亡因子，具體為如下所示的16個氨基酸的肽KKLSECLKRI ⑶ELDS SEQ. No. 30。相信基于Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的序列的肽能夠有效結(jié)合抗細(xì)胞調(diào)亡蛋白Bcl_2和Bcl-XL。Bcl-2和Bcl-XL蛋白的抗細(xì)胞調(diào)亡活性是基于它們與存在于負(fù)責(zé)細(xì)胞調(diào)亡的起始的因子(Bax, Bak, Bad)中的BH3結(jié)構(gòu)域的相互作用。BH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合阻止蛋白Bcl_2和Bcl-XL與它們的天然配體的相互作用，并抑制它們的活性，從而促成細(xì)胞調(diào)亡的起始。上述組的SEQ. NO. 31的效應(yīng)子肽是如下所示的包含Bid蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的15個氨基酸的肽RNIARHLAQV ⑶SMD (SEQ. No. 31)。Bid蛋白屬于Bcl-2家族，其主要負(fù)責(zé)促細(xì)胞調(diào)亡因子Bax的激活。相信引入到本發(fā)明的融合蛋白中的包含Bid蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的16個氨基酸的肽將有效誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。上述組的SEQ. NO. 32的效應(yīng)子肽是核糖核酸酶A (RNase A)的肽同源物，如下所示KETA AKFERQHMDS STSAASSSNY CNQMMKSRNL TKDRCKPVNT FVHESLADVQAVCSQKNVAC KNGQTNCYQS YSTMSITDCR ETGSSKYPNC AYKTTQANKHIIVACEGNPY VPVHFDASV(SEQ. No. 32).核糖核酸酶是具有潛在抗癌性質(zhì)的小的蛋白，在與帶負(fù)電的細(xì)胞膜結(jié)合后通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，然后泄露進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在那里它們作為酶引起RNA的降解。從IOnM的濃度開始，它們阻抑細(xì)胞周期并引起細(xì)胞調(diào)亡。上述組的SEQ. NO. 33的效應(yīng)子肽是如下所示的細(xì)胞色素C分子⑶VEKGKKIFIMKCS QCHTVEKGGK HKTGPNLHGL FGRKTGQAPG YSYTAANKNKGIIffGEDTLM EYLENPKKYI PGTKMIFVGI KKKEERADLI AYLKKATNE(SEQ. No. 33)細(xì)胞色素C從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)是通過所謂的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的主要信號之一。該蛋白是調(diào)亡體復(fù)合物的一部分，其激活胱天蛋白酶9。上述組的SEQ. NO. 34的效應(yīng)子肽是粒酶(granzyme) B,如下所示IIGGHVAKPH SRPYMAYLMI WDQKSLKRCG GFLIRDDFVL TAAHCffGSSINVTLGAHNIKEQEPTQQFIP VKRAIPHPAT NPKNFSNDIM LLQLERKAKRTRAVQPLRLP SNKAQVKPGQ TCSVAGffGQT APLGKHSHTL QEVKMTVQEDRKCESDLRHY YDSTIELCVG DPEIKKTSFK ⑶SGGPLVCN KVAQGIVSYG
RNNGMPPRAC TKVSSFVHWI KKTMKRY(SEQ. No. 34).粒酶,在文獻(xiàn)中也被稱作斷裂蛋白(fragmentin),是Tc淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞顆粒性的典型的絲氨酸蛋白酶。在人類中目前鑒定了 5種不同的粒酶A，B, H,K(tryptase)和M(metioninase)。研究已經(jīng)確認(rèn)這些酶是淋巴細(xì)胞針對祀細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)的元件。已經(jīng)表明這些酶激活穿孔蛋白(perforin)，穿孔蛋白是在細(xì)胞膜中產(chǎn)生孔并從而介導(dǎo)細(xì)胞毒性應(yīng)答的蛋白。此外，相信這些酶直接參與靶細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。粒酶B將選擇的前胱天蛋白酶激活為它們的活性形式(例如胱天蛋白酶3)，并通過蛋白水解釋放Bid蛋白(屬于Bcl-2蛋白家族的蛋白)的活性形式，其通過摻入線粒體膜并在膜上產(chǎn)生孔而起始細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)途徑，然后釋放細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)性因子(細(xì)胞色素C、胱天蛋白酶9、Apaf)。通過與組蛋白結(jié)合，粒酶B也可參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的松弛，其引起它的松弛并增加核酸內(nèi)切酶與DNA的靠近。上述組的SEQ. NO. 35的效應(yīng)子肽是Nur77蛋白的片段，如下所示 FSRSLHSLL (SEQ. No. 35)。核受體Nur77是非常強的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)子。其作用機理之一是與Bcl_2蛋白結(jié)合的能力，Bcl-2蛋白是重要的抗-細(xì)胞調(diào)亡因子。這種相互作用引起B(yǎng)cl-2結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，使其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞調(diào)亡的誘導(dǎo)子。上述片段是來自Nur77的序列的9個氨基酸的區(qū)域，其被鑒定為負(fù)責(zé)結(jié)合并轉(zhuǎn)化Bcl-2和誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡(Kolluri et al, CancerCelll4:285-298，2008)。上述組的SEQ. NO. 36的效應(yīng)子肽是包含Bak蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的15個氨基酸的肽，如下所示GQVGRQLAII ⑶DIN (SEQ. No. 36)。相信摻入本發(fā)明的融合蛋白中的該短肽將有效誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡信號。上述組的SEQ. NO. 37的效應(yīng)子肽是蛋白PUMA/BBC3的BH3結(jié)構(gòu)域，如下所示EEQffAREIGA QLRRMADDLN AQYE SEQ. No. 37。PUMA/BBC3(細(xì)胞調(diào)亡/Bcl-2結(jié)合成分3的p53上調(diào)的調(diào)節(jié)子)是Bcl_2蛋白家族的成員(僅-BH3亞家族)。其通過p53依賴性和非依賴性方式介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。PUMA/BBC3與所有已知的促存活Bcl-2蛋白的直接相互作用引起它們的失活、線粒體功能失調(diào)并由此引起胱天蛋白酶的激活和細(xì)胞死亡。PUMA還間接影響諸如Bak和Bax的分子的促細(xì)胞調(diào)亡活性的恢復(fù)。BH3結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)PUMA與促存活蛋白的結(jié)合。上述組的SEQ. NO. 38的效應(yīng)子肽是蛋白PUMA/BBC3，如下所示ARAR QEGSSPEPVE GLARDGPRPF PLGRLVPSAV SCGLCEPGLA AAPAAPTLLPAAYLCAPTAP PAVTAALGGS RffPGGPRSRP RGPRPDGPQPSLSLAEQHLESPVPSAPGAL AGGPTQAAPG VRGEEEQffAR EIGAQLRRMA DDLNAQYERRRQEEQQRHRR SPffRVLYNLI MGLLPLPRGH RAPEMEPN(SEQ. No. 38).相信當(dāng)被摻入本發(fā)明的融合蛋白中時，蛋白PUMA/BBC3及其BH3結(jié)構(gòu)域都能有效誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡信號。上述組的SEQ. NO. 39的效應(yīng)子肽是蛋白SMAC/Diablo的8個氨基酸的片段，如下所示AVPIAQKP (SEQ. No. 39)。
SMAC/DIABLO (具有低PI的胱天蛋白酶/直接IAP結(jié)合蛋白的第二線粒體衍生的激活子)是從線粒體釋放的胱天蛋白酶的激活子。其N末端基序競爭性結(jié)合IAP蛋白，阻止它們的BIR2和BIR3結(jié)構(gòu)域使胱天蛋白酶失活。相信當(dāng)摻入本發(fā)明的融合蛋白中時，該短肽將有效誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡信號。上述組的SEQ. NO. 40的效應(yīng)子肽是buforin IIb肽,如下所示RAGLQFPVGR LLRRLLRRLL(SEQ. No. 40)。buforin IIb是源自組蛋白H2A的肽，其能夠獨立地穿透細(xì)胞膜并具有抗細(xì)菌性質(zhì)(Park et al, Biochem Biophys. Res. Commun. , 244:253-257，1998)。關(guān)于其用作抗癌試劑的研究表明其能夠選擇性結(jié)合多種癌細(xì)胞，穿透細(xì)胞并在細(xì)胞核中累積，通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡(Lee et al, Cancer Letters, 271:47-55，2008)。上述組的SEQ. NO. 41的效應(yīng)子肽是豹娃酶(onconase)肽,如下所示QDffLT FQKKHITNTR DVDCDNMST NLFHCKDKNTFIYSRPEPVK AICKGIIASKNVLTTSEFYL SDCNVTSRPC KYKLKKSTNK FCVTCENQAP VHFVGVGSC(SEQ. NO.41).豹娃酶或P-30是最初源自娃(Rana pipiens)卵母細(xì)胞的裂解物的蛋白。其為單鏈蛋白，具有12kDa的分子量，是RNase A的結(jié)構(gòu)同源物。關(guān)于該蛋白的研究顯示其具有針對腫瘤細(xì)胞的顯著的細(xì)胞毒性活性(Y Wu，SM Mikulski，W Ardelt, SM Rybak and RJYoule, The Journal of Biological Chemistry268, 10686-10693)。關(guān)于豹娃酶的作用機理的研究顯示，在內(nèi)化過程之后其進(jìn)入細(xì)胞，在那里進(jìn)行28S和18S核糖體rRNA的降解過程，這導(dǎo)致蛋白合成的抑制和細(xì)胞死亡。上述組的SEQ. NO. 42的效應(yīng)子肽是pl4ARF蛋白的20個氨基酸的N末端片段，其是促存活Mdm2蛋白的抑制子,如下所示VRRFLVTLRI RRACGPPRV (SEQ. No. 42)。P14ARF是調(diào)節(jié)Mdm2蛋白活性的蛋白，其結(jié)合腫瘤抑制子p53并導(dǎo)致其降解并因此引起轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的存活的可能性。P14ARF蛋白通過結(jié)合Mdm2而阻止其與p53的相互作用。據(jù)報道源自P14ARF的短肽足以阻斷Mdm2與p53的相互作用并阻止后者的降解(Midgleyet al,0ncogenel9:2312-2323, 2000)。上述組的SEQ. NO. 43的效應(yīng)子肽是結(jié)合Mdm2的11個氨基酸的肽，如下所示PRFMDTffEGL N (SEQ. No. 43)。上述肽顯示出與p53的序列的序列同源性并顯著有效抑制Mdm2_p53相互作用(Bott er et al，0ncogenel3:2141-2147, 1996)，從而阻止 p53 的降解。上述組的SEQ. NO. 44的效應(yīng)子肽是Iunasin肽的17個氨基酸的片段，如下所示CEKHIMEKIQ GRGDDDD (SEQ. No. 44)。Lunasin是源自大豆(Glycine max)的43個氨基酸的肽,具有強抗癌潛力。該分子的一般作用機理在于抑制組蛋白的乙?；?。已知具有脫乙酰酶活性的分子也具有轉(zhuǎn)錄過程的共抑制劑的作用(Leong et al, Cancer Lett, 18:42-48,2007)。上述組的SEQ. NO. 45的效應(yīng)子肽是Bik蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域，如下所示LALRLAC I⑶EMDVS (SEQ. No. 45)。Bik蛋白與起始存活信號的細(xì)胞和病毒因子(例如Bcl-2)相互作用，從而刺激細(xì)胞調(diào)亡。與很多其它促細(xì)胞調(diào)亡蛋白一樣，其包含與Bcl-2相互作用必需的BH3結(jié)構(gòu)域。包含BH3結(jié)構(gòu)域的源自該蛋白的肽可通過激活其它促細(xì)胞調(diào)亡蛋白或通過抑制抗細(xì)胞調(diào)亡蛋白而起始細(xì)胞調(diào)亡(Del Gaizo Moore, V, et al, Blond, 111: 2300-2309，2008)。上述組的SEQ. NO. 46的效應(yīng)子肽是合成的肽一蛋白酶體抑制劑，如下所示AGAGGGAGG AGAGGGAGGA G (SEQ. No. 46)。該肽由Gly和Ala殘基的一系列重復(fù)序列組成，其是蛋白酶體抑制劑，能夠通過誘導(dǎo)TRAIL受體DR5的過表達(dá)而加強TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡。上述組的SEQ. NO. 47的效應(yīng)子肽是蛋白酶體S5a的C末端片段的結(jié)構(gòu)域，如下所示MTISQQEFG RTGLPDLSSM TEEEQIAYAM QMSLQGAEFG QAESADIDAS SAMDTSEPAKEEDDYDVMQD PEFLQSVLEN LPGVDPNNEA IRNAMGSLAS QATKDGKKDK KEEDK(SEQ.No.47).來自蛋白酶體S5a片段的該結(jié)構(gòu)域包含直接參與泛素結(jié)合的UIM基序并因此具有誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的能力。上述組的SEQ. NO. 151的效應(yīng)子肽是azurin衍生的肽。azurin是含銅的氧化還原蛋白，由致病細(xì)菌銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)釋放，對于很多癌細(xì)胞系具有高度細(xì)胞毒性。其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并遷移至細(xì)胞核。其活性嚴(yán)格依賴于癌細(xì)胞中P53的活性形式的存在。已經(jīng)表明azurin結(jié)合p53并翻譯后地增加p53和Bax的水平。就Mdm2-p53功能相互作用的這種表觀的拮抗作用表明azurin與p53的結(jié)合可能干擾Mdm2-p53結(jié)合并因此阻止p53的降解。在結(jié)合之后，其激發(fā)線粒體細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。該過程激活胱天蛋白酶(包括胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-7)級聯(lián)，從而起始細(xì)胞調(diào)亡過程(Punj V, et al Oncogene. 2004Mar25; 23 (13) : 2367-78，F(xiàn)unari G et al. J Mol Recognit. 2010Jul Aug; 23 (4) : 343-51)。關(guān)于源自 azurin 序列的肽的活性的詳細(xì)分析揭示了負(fù)責(zé)有效的細(xì)胞穿透并激發(fā)細(xì)胞調(diào)亡的28個氨基酸的區(qū)域(Yamada i wsp. , Cell Microbiol, 7:1418 - 1431，2005)。上述組的SEQ. NO. 152的效應(yīng)子肽是全長的azurin肽。上述組的SEQ. NO. 153的效應(yīng)子肽是從aPP蛋白和Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域設(shè)計而來的肽。在EP1309680中報告了 aPP蛋白和重新設(shè)計的促細(xì)胞調(diào)亡Bak蛋白的嵌合物是人Bcl-2和Bcl-X的高度強烈的和特異性的配體(另見Chin Jff, Schepartz A. Design andevolution of a miniature Bcl-2 binding protein Angew Chem Int Ed Engl. 20010ct15;40(20):3806-3809)。上述組的SEQ. NO. 154的效應(yīng)子肽是從aPP蛋白和Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域設(shè)計而來的另一種肽。上述組的SEQ. NO. 155的效應(yīng)子肽是Reticulon RTNl-C衍生的肽。RTNl-C蛋白是位于ER并表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的膜蛋白，其生物學(xué)作用尚未完全知曉。RTNl-C的C末端區(qū)域，對應(yīng)于殘基186-208的片段，能夠結(jié)合核酸并與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)相互作用，降低它們的活性。上述組的SEQ. NO. 156的效應(yīng)子肽是全長人Reticulon3(同種型a)。Reticulon(RTN)構(gòu)成一組整合膜蛋白，其與其它已知的細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)結(jié)構(gòu)域不具有同源性。RetiCulon3同種型a在腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)，使它們對于TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡變得敏感。上述組的SEQ. NO. 157的效應(yīng)子肽是是修飾的組成型活性的胱天蛋白酶_3 (單鏈)(Srinivasula SM, Ahmad M,MacFarlane M, Luo Z,Huang Z, Fernandes-AlnemriTj Alnemri ES. Generation of constitutively active recombinant caspases-3and_6byrearrangement of their subunits. J Biol Chem. 1998Apr24;273(17):10107-11)。上述組的SEQ. NO. 158的效應(yīng)子肽是來自Par_4蛋白(前列腺細(xì)胞調(diào)亡應(yīng)答蛋白par-4)的SAC結(jié)構(gòu)域。Par-4是具有促細(xì)胞調(diào)亡功能的腫瘤抑制子蛋白。Par_4的癌癥特異性促細(xì)胞調(diào)亡作用在于位于其中心的SAC結(jié)構(gòu)域。該分子的功能通過兩種不同方式實現(xiàn)細(xì)胞死亡機構(gòu)的分子成分的激活(Fas和FasL向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)位)和促存活因子的抑制(NF-κ B途徑)(Zhao Y, Rangnekar VM. Apoptosis and tumor resistance conferred by Par~4. CancerBiol Ther.2008Dec;7 (12):1867-74. Epub 2008 Dec 8. Review) 上述組的SEQ. NO. 159的效應(yīng)子肽是Noxa蛋白。Noxa編碼Be I _2蛋白家族的Be I _2僅同源物3 (BH3)成員；該成員包含BH3區(qū)域但不含其它BH結(jié)構(gòu)域。Noxa是p53依賴性細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)子并經(jīng)歷BH3基序依賴性的向線粒體的定位，并與抗細(xì)胞凋亡Bcl-2家族成員相互作用，引起胱天蛋白酶-9的激活。上述組的SEQ. NO. 160的效應(yīng)子肽是線粒體定位必需的Noxa蛋白的IOAA (KLLNLISKLF)片段(MTD-線粒體靶向結(jié)構(gòu)域或CKP —細(xì)胞殺傷肽)。其被描述于 W02006/001582 和 Young-Woo Seo et al. The Journal of Biological ChemistryVol. 278, No. 48, Issue of November 28，pp.48292 - 48299，2003。上述組的SEQ. NO. 161的效應(yīng)子肽是短的雜合肽Antp-TPR，其被描述于W02010055929。Antp-TPR是靶向Hsp90的工程化的雜合肽，由于抑制了 Hsp90與Hop的TPR2A結(jié)構(gòu)域的相互作用而具有針對癌細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性活性。上述組的SEQ. NO. 162的效應(yīng)子肽是Stat3蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域的肽抑制劑。Stat蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)一系列導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞生長和分化的事件，其是通過響應(yīng)于生長因子和細(xì)胞因子的正常STAT信號傳導(dǎo)。上述組的SEQ.N0. 163的效應(yīng)子肽是源自Bak蛋白(Bcl_2家族)的BH3結(jié)構(gòu)域的妝 GQVGRQLAIIGDDINR(Castelli M, Reiners JJ, Kessel D. A mechanism for theproapoptotic activity of ursodeoxycholic acid:effects on Bcl_2 conformation.Cell Death Differ. 2004Aug; 11 (8) :906-14) Bak 蛋白是 Bcl_2 家族的促細(xì)胞凋亡成員，其參與細(xì)胞凋亡的起始。上述組的SEQ. NO. 164的效應(yīng)子肽是源自Bad蛋白(Bcl_2家族)的BH3結(jié)構(gòu)域的肽 KNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGL(Wang JL, Zhang ZJ, Choksi S，Shan S，LuZ,Croce CM,Alnemri ES,Korngold R,Huang Z.CelI permeable Bcl_2bindingpeptides:a chemical approach to apoptosis induction in tumor cells. CancerRes.2000Marl5;60(6):1498-502)。上述組的SEQ. NO. 165的效應(yīng)子肽是來自Bfll蛋白的肽ATAP。
ATAP (兩性的尾部錨定肽)(雙功能的Bcl2家族蛋白Bfll的殘基147-175)特異性靶向線粒體并誘導(dǎo)胱天蛋白酶依賴性的不需要Bax或Bak的細(xì)胞凋亡。上述組的SEQ. NO. 166的效應(yīng)子肽是來自Bfll蛋白的另一個ATAP肽。ATAP蛋白融合于來自 HCCSl 的 MTS 結(jié)構(gòu)域(Ko JK, Choi KH, Pan Z, Lin P, Weisleder N, Kim Cff, MaJ. The tail-anchoring domain of Bfll and HCCSl targets mitochondrial membranepermeability to induce apoptosis. J Cell Sci.2007 Aug 15;120(Pt 16):2912-23.Epub 2007Jul 31)。如上文所描述，結(jié)構(gòu)域(b)的促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽的第一變體可以是通過內(nèi)部細(xì)胞凋亡途徑(細(xì)胞內(nèi)的)發(fā)揮其細(xì)胞凋亡活性的肽，其通過激活細(xì)胞凋亡的線粒體途徑的信號傳導(dǎo)級聯(lián)成分而直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或通過直接誘導(dǎo)細(xì)胞中的線粒體細(xì)胞凋亡。在第一變體的一個實施方式中，通過內(nèi)部途徑發(fā)揮其活性的結(jié)構(gòu)域(b)的一組促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽可以是在結(jié)合后抑制和/或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗細(xì)胞凋亡或促存活因子例如抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的肽。上述組的示例性效應(yīng)子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其存在于實施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 37所示的肽，其存在于實施例11和47的融合蛋白中；SEQ. NO. 45所示的肽，其摻入實施例21的融合蛋白中；SEQ. NO. 158所示的肽，其存在于實施例42和43的融合蛋白中；SEQ. NO. 159所示的肽，其摻入實施例44的融合蛋白中。在所述第一變體的另一個實施方式中，通過內(nèi)部途徑發(fā)揮其活性的結(jié)構(gòu)域(b)的一組促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽可以是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其直接破壞效應(yīng)以阻抑細(xì)胞周期的肽。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中在細(xì)胞內(nèi)的直接破壞效應(yīng)可以通過效應(yīng)子肽在不同水平的胱天蛋白酶級聯(lián)上起始，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的實例有核酸的降解，特別是完整細(xì)胞RNA或DNA的降解，和降解性核酸酶的誘導(dǎo)。此類效應(yīng)可通過例如核糖核酸酶來進(jìn)行，例如胰腺RNAse A超家族的核糖核酸酶，包括人胰腺RNAse，人血管生長素(核糖核酸酶5，hAng)，人嗜曙紅細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)和牛核糖核酸酶，以及它們的同源物和變體。RNAse同源物的實例有豹娃酶(onconase),分離自Rana catesbiana和Ranajaponica的核糖核酸酶。上述通過降解核酸發(fā)揮作用的示例性效應(yīng)子肽是SEQ. NO. 32所示的肽，其存在于實施例3、4和27的融合蛋白中；SEQ. NO. 41所示的肽，其存在于實施例16、17和46的融合蛋白中；SEQ. NO. 157所示的肽，其存在于實施例41的融合蛋白中。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是胱天蛋白酶激活。此類效應(yīng)可通過下列來實現(xiàn)例如細(xì)胞色素c (SEQ. NO. 33)，其存在于實施例5和6的融合蛋白中；粒酶B(SEQ. NO. 34)，其存在于實施例7和8的融合蛋白中，或源自蛋白Smac/DIABLO的肽(SEQ. NO. 39)，其存在于實施例14、21、33、34和35的融合蛋白中。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是蛋白酶體抑制，由于促細(xì)胞凋亡蛋白的穩(wěn)定化對于P53功能恢復(fù)的影響。通過蛋白酶體抑制而發(fā)揮作用的上述組的示例性效應(yīng)子肽是SEQ. NO. 46所示的肽，其摻入實施例22的融合蛋白中；SEQ. NO. 47所示的肽，其摻入實施例23的融合蛋白中。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是由于促細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)對于P53功能恢復(fù)的影響的增強而調(diào)節(jié)組蛋白。通過調(diào)節(jié)組蛋白而發(fā)揮作用的上述組的示例性效應(yīng)子肽是buforin IIb肽,如SEQ. NO. 40所示，其摻入實施例15的融合蛋白；SEQ. NO. 44所示的lunasin，其摻入實施例20的融合蛋白。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是p-53功能的恢復(fù)，例如通過抑制其降解。抑制p-53降解可通過抑制p-53的負(fù)調(diào)節(jié)子例如鼠雙微體2 (MDM2)以破壞其負(fù)調(diào)節(jié)來實現(xiàn)。這可以通過MDM2結(jié)合性肽來實現(xiàn)，其與MDM2競爭向p_53的結(jié)合，所述結(jié)合性肽是例如Azurin,其是含銅的氧化還原蛋白；細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子pl4ARF,或SuperTIP (ThioredoxinInsert蛋白，細(xì)菌硫氧還蛋白的活性位點環(huán)內(nèi)的mdm_2結(jié)合肽),或它們的片段。通過恢復(fù)p-53的功能而發(fā)揮作用的上述組的示例性效應(yīng)子肽是SEQ. NO. 42所示的肽，其摻入實施例18的融合蛋白中；SEQ. NO. 43的肽，其摻入實施例19的融合蛋白中；SEQ. NO. 151的肽，其存在于實施例29、30和31的融合蛋白中；SEQ. NO. 152的肽，其摻入實施例32的融合蛋白中。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是影響即激活、抑制或調(diào)節(jié) Bcl-2 蛋白家族，例如蛋白 Bax, Bak, Bok, Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma,Bik, BNIP3 和 Spike,更具體是僅 BH3 蛋白家族，包括 Bid, Bim, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma,Bik, BNIP3和Spike。特別地，Bcl-2家族成員的BH3結(jié)構(gòu)域的片段將是優(yōu)選的效應(yīng)子肽。其它組的效應(yīng)子肽是細(xì)胞核受體RXR(類維生素a X受體)家族的片段，例如細(xì)胞核受體Nur770通過影響B(tài)cl-2蛋白家族而發(fā)揮作用的上述組的示例性效應(yīng)子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其摻入實施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 31所示的肽，其存在于實施例2、4和8的融合蛋白中；SEQ. NO. 32所示的肽，其摻入實施例3的融合蛋白中；SEQ. NO. 35所示的肽，其摻入實施例9的融合蛋白中；SEQ. NO. 36所示的肽，其摻入實施例10的融合蛋白中；SEQ.NO. 37所示的肽，其存在于實施例11和47的融合蛋白中；SEQ. NO. 38所示的肽，其存在于實施例12和13的融合蛋白中；SEQ. NO. 159所示的肽，其摻入實施例44的融合蛋白中；SEQ.NO. 160所示的肽，其摻入實施例45的融合蛋白中；SEQ. NO. 163所示的肽，其摻入實施例51的融合蛋白中；SEQ. NO. 164所示的肽，其存在于實施例52和53的融合蛋白中；SEQ. NO. 165所示的肽，其摻入實施例54的融合蛋白中；SEQ. NO. 166所示的肽，其摻入實施例55的融合蛋白中。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是會聚TRAIL與TRAIL受體結(jié)合特別是通過胱天蛋白酶激活而誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是促進(jìn)凋亡體的形成。通過促進(jìn)凋亡體的形成而發(fā)揮作用的上述組的示例性效應(yīng)子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其摻入實施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 31所示的肽，其摻入實施例2的融合蛋白中；SEQ. NO. 33所示的肽，其摻入實施例5和6的融合蛋白中；SEQ. NO. 35所示的肽，其摻入實施例9的融合蛋白中；SEQ. NO. 36所示的肽，其摻入實施例10的融合蛋白中；SEQ. NO. 37所示的肽，其摻入實施例47的融合蛋白中；SEQ. NO. 39所示的肽，其存在于實施例33、34和35的融合蛋白中；SEQ. NO. 40所示的肽，其摻入實施例14的融合蛋白中；SEQ. NO. 45所示的肽，其摻入實施例21的融合蛋白中；SEQ. NO. 153所示的肽，其存在于實施例36和37的融合蛋白中；SEQ. NO. 154所示的肽，其摻入實施例38的融合蛋白中；SEQ. NO. 157所示的肽，其摻入實施例41的融合蛋白中；SEQ. NO. 158所示的肽，其存在于實施例42和43的融合蛋白中；SEQ. NO. 159所示的肽，其摻入實施例44的融合蛋白中；SEQ. NO. 160所示的肽，其摻入實施例45的融合蛋白中；SEQ. NO. 163所示的肽，其摻入實施例51的融合蛋白中；SEQ.NO. 164所示的肽，其存在于實施例52和53的融合蛋白中。所述的在線粒體內(nèi)部途徑中效應(yīng)子肽的直接破壞效應(yīng)的另一個實例是促進(jìn)線粒體外膜(MOMP)滲透，由此，線粒體釋放的蛋白能夠在胱天蛋白酶激活水平上發(fā)揮作用。通過促進(jìn)MOMP滲透而發(fā)揮作用的上述組的示例性效應(yīng)子肽是SEQ. NO. 30所示的肽，其摻入實施例I的融合蛋白中；SEQ. NO. 31所示的肽，其摻入實施例2和48的融合蛋白中；SEQ. NO. 33所示的肽，其摻入實施例5和6的融合蛋白中；SEQ. NO. 39所示的肽，其存在于實施例14、33、34和35的融合蛋白中；SEQ. NO. 40所示的肽，其摻入實施例15的融合蛋白中；SEQ. NO. 41所示的肽，其摻入實施例46的融合蛋白中；SEQ. NO. 45所示的肽，其摻入實施例21的融合蛋白中。如上文所描述，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域(b)的促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽的第二變體是通過外部途徑(細(xì)胞外地)發(fā)揮作用的促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽的組，它們的效應(yīng)需要結(jié)合存在于癌細(xì)胞表面上的受體。下列TNF-配體(TNF—腫瘤壞死因子)或TNF-類似物作為在細(xì)胞外作用的肽，用作比較性效應(yīng)子肽-VANPQAEGQL 十肽(SEQ. No. 48)；-LANGVE 六肽(SEQ. No. 49)，或-七肽CPSEGLC (SEQ. No. 50)。SEQ. NO. 48所示的十肽在JP60，226，816中被描述為TNF的類似物/激動劑。SEQ. NO. 49所示的六肽源自TNF，在DE3，841，768中已被描述。SEQ. NO. 50所示的七肽是在C末端和N末端側(cè)接2個半胱氨酸殘基的5個氨基酸的肽，其是源自TNF細(xì)胞因子與其細(xì)胞受體TNFR55和TNFR75的相互作用的表面的TNF細(xì)胞因子的一部分。半胱氨酸殘基通過形成氨基酸之間的硫橋而使肽環(huán)穩(wěn)定。環(huán)化的目的是使肽穩(wěn)定并改善其活性。與癌細(xì)胞表面上存在的TRAIL受體結(jié)合之后，融合蛋白將發(fā)揮雙重效應(yīng)。結(jié)構(gòu)域(a), TRAIL的功能性片段，將發(fā)揮其已知的激動活性，即，與細(xì)胞表面上的死亡受體結(jié)合并激活細(xì)胞凋亡的外部途徑。在包含細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的促細(xì)胞凋亡肽的融合蛋白通過胞吞內(nèi)化之后，結(jié)構(gòu)域(b)將能夠潛在地在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其作用，與TRAIL結(jié)構(gòu)域的活性平行。通過這種方式，TRAIL的抗癌活性可通過細(xì)胞凋亡的其它元件和機制的激活得以加強。摻入了在細(xì)胞外發(fā)揮作用的促細(xì)胞凋亡肽的比較性融合蛋白應(yīng)該潛在地另外地起始細(xì)胞凋亡途徑，其是通過結(jié)合并激活除了 TRAIL受體以外的促細(xì)胞凋亡受體。在本發(fā)明的一個實施方式中，融合蛋白的結(jié)構(gòu)域(a)和(b)可彼此直接連接。在另一實施方式中，結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)通過結(jié)構(gòu)域(C)連接,結(jié)構(gòu)域(C)包含被存在于細(xì)胞環(huán)境、特別是腫瘤細(xì)胞環(huán)境中的蛋白酶識別的切割位點序列。
蛋白酶切割位點可以選自 被金屬蛋白酶MMP識別的序列，特別是序列PLGLAG (SEQ. No. 51), PLGIAGE (SEQ.No.171)或 PLGLAGQ(SEQ. No. 173)；被尿激酶uPA識別的序列，特別是RVVR序列(SEQ. No. 52);和被弗林蛋白酶識別的序列，特別是序列RKKR(SEQ. No. 53)或序列RKKRVKR(SEQ.No. 172)；以及它們的組合。特別地，蛋白酶切割位點是被金屬蛋白酶MMP識別的序列與被尿激酶uPA識別的序列的組合，以任何順序彼此相鄰。在一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(c)是MMP/uPA SEQ. NO. 51/SEQ. NO. 52的組合，即序列PLGLAGRVVR,或 uPA/MMP SEQ. No52/SEQ. No. 51 的組合，即序列 RWRPLGLAG。蛋白酶金屬蛋白酶、尿激酶和/或弗林蛋白酶在腫瘤環(huán)境中過表達(dá)。被蛋白酶識別的序列的存在使得構(gòu)建體在內(nèi)化之后能夠使結(jié)構(gòu)域(a)從結(jié)構(gòu)域(b)切割下來，即釋放功能性結(jié)構(gòu)域(b)并由此實現(xiàn)其激活。蛋白酶切割位點的存在允許迅速釋放效應(yīng)子肽，由此增加了融合蛋白被存在于細(xì)胞中的蛋白酶隨機降解之前肽向其作用位點轉(zhuǎn)運的機會。另外，可以向本發(fā)明的融合蛋白的效應(yīng)子肽的結(jié)構(gòu)域(b)上添加轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)，其選自(dl)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列；(d2)穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的多聚精氨酸序列，其包含6、7、8或9個Arg殘基；(d3)銅綠假單胞菌的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(SEQ. NO. 54)；(d4)膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；(d5)細(xì)胞核定位結(jié)構(gòu)域；和(d6)線粒體靶向結(jié)構(gòu)域；及其組合。結(jié)構(gòu)域(dl)、(d2)和(d3)的組合可具體包含下列組合(dl)/(d2)，(dl)/(d3)或(dl)/(d2)/(d3)。結(jié)構(gòu)域(dl)，(d2)，(d3)，(d4)和(d5)的組合可具體包含下列組合(dl) /(d2), (dl)/(d3), (dl)/(d4), (dl)/(d5)和(dl)/(d2)/(d3), (d3)/(d5), (d2)/(d5), (dl)/(d3)/(d5), (d2)/(d3)/(d6)。此外，結(jié)構(gòu)域(dl)，(d2)，(d3)，(d4)和(d5)的組合可包括彼此相鄰并連接至結(jié)構(gòu)域(b)的一個末端的結(jié)構(gòu)域；和/或連接至結(jié)構(gòu)域(b)的不同末端的結(jié)構(gòu)域。應(yīng)該理解,在融合蛋白既具有連接至結(jié)構(gòu)域(b)的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)又具有結(jié)構(gòu)域(a)與(b)之間的切割位點結(jié)構(gòu)域(C)的情況下，結(jié)構(gòu)域(C)的位置是在構(gòu)建體被切割之后，轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)仍然與結(jié)構(gòu)域(b)相連。換言之，如果融合蛋白包含轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)和切割位點結(jié)構(gòu)域(c)，則結(jié)構(gòu)域(d)位于結(jié)構(gòu)域(b)與結(jié)構(gòu)域(c)之間，或位于結(jié)構(gòu)域(b)的與連接了結(jié)構(gòu)域(d)的位置相對的末端。本發(fā)明不包含這樣的變體，其中結(jié)構(gòu)域(d)位于結(jié)構(gòu)域(c)與結(jié)構(gòu)域(a)之間，即，當(dāng)構(gòu)建體被切割之后，轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域仍然與TRAIL結(jié)構(gòu)域相連。
轉(zhuǎn)運序列可以連接于結(jié)構(gòu)域(b)的N末端或C末端。在一些實施方式中，轉(zhuǎn)運序列也可以是整個構(gòu)建體的末端部分，例如C末端或N末端部分，這取決于結(jié)構(gòu)域(a)和(b)的連接方式。銅綠假單胞菌的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域能夠通過溶酶體膜轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，并且可用于將效應(yīng)子肽導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞腔室。銅綠既假單胞菌的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域是熟知的，如下所示PEGGSLA ALTAHQACHL PLETFTRHRQ PRGffEQLEQC GYPVQRLVAL YLAARLSffNQVDQVIANALA SPGSGGDLGE AIRESPEQAR LALTLAAAES ERFVRQGTGNDEAGAANGPA D (SEQ. No. 54)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列(dl)可以是本領(lǐng)域已知的靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的任何信號序列，例如但不限于 KDEL, HDEL, RDEL, DDEL, ADEL, SDEL, KEDL0 序列(dl)優(yōu)選選自序列 KDEL(SEQ. No. 55)和 KEDL (SEQ. No. 56)。優(yōu)選地，靶向序列(dl)位于本發(fā)明的融合蛋白的C末端并構(gòu)成其C末端部分。膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d4)可以是本領(lǐng)域已知的通過質(zhì)膜轉(zhuǎn)運的任何信號序列，例如但不限于 KPRRPY 或 K PRRPYR。細(xì)胞核定位序列(d5 )可以是本領(lǐng)域已知的靶向細(xì)胞核的任何信號序列，例如但不限于 EEEAAGRKRKKRT (SEQ. No. 168)，F(xiàn)FFAAGRKRKKRT, NNNAAGRKRKKRT, YYYAAGRKRKKRT, AAKKK或 GR KRKKRT。線粒體靶向結(jié)構(gòu)域(d6)可以是本領(lǐng)域已知的靶向線粒體的任何信號序列，例如但不限于RVSFCRPGWSAMARSRLTATSVSQVQENGFVK(SEQ. No. 166)，人細(xì)胞色素氧化酶亞基IV (hCOXIVl)的片段MLATRVFSLVGKRAISTSVCVR，或鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶先導(dǎo)肽。除了融合蛋白的主要功能元件轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域和切割位點結(jié)構(gòu)域之外，本發(fā)明的融合蛋白可包含結(jié)構(gòu)域(e)，即促進(jìn)三聚體穩(wěn)定性的多聚半胱氨酸基序，例如但不限于CkkCkkkC 序列(SEQ. No. 177)或 CAAECAAAC (SEQ. No. 178)。此外，多聚半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(e)可連接于結(jié)構(gòu)域(b)的一個末端和/或連接于結(jié)構(gòu)域(b)的不同末端。應(yīng)該理解，在融合蛋白既具有連接于結(jié)構(gòu)域(b)的多聚半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(e)又具有結(jié)構(gòu)域(a)與(b)之間的切割位點結(jié)構(gòu)域(C)的情況下，結(jié)構(gòu)域(C)的位置是在構(gòu)建體被切割之后，多聚半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(e)仍然與結(jié)構(gòu)域(a)相連。換言之，如果融合蛋白包含多聚半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(e)和切割位點結(jié)構(gòu)域(C)，則結(jié)構(gòu)域(e)位于結(jié)構(gòu)域(a)與結(jié)構(gòu)域(C)之間，或位于結(jié)構(gòu)域(a)的與連接了結(jié)構(gòu)域(d)的位置相對的末端。本發(fā)明不包含這樣的變體，其中結(jié)構(gòu)域(e)位于結(jié)構(gòu)域(C)與結(jié)構(gòu)域(b)之間，S卩，當(dāng)構(gòu)建體被切割之后，多聚半胱氨酸結(jié)構(gòu)域仍然與效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域相連。除了融合蛋白的主要功能元件轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域和切割位點結(jié)構(gòu)域之外，本發(fā)明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空間連接子(間隔子)的序列，其包含丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸和絲氨酸殘基。此類連接子/間隔子是本領(lǐng)域熟知的并且在文獻(xiàn)中有描述。將它們摻入融合蛋白的序列中是為了使得通過在宿主細(xì)胞中過表達(dá)而產(chǎn)生的蛋白的正確折疊。特別地，柔性空間連接子可以選自GGSG(SEQ. No. 57)，GGGS(SEQ.No. 58)，GGGGS (SEQ. No. 59)，GGSGG (SEQ. No. 60)，GGGSGG (SEQ. No. 61), GGGSGGG (SEQ.No. 62)，GGGSGGGS (SEQ. No. 63)，GGGSGGGGS (SEQ. No. 64)，ASGG (SEQ. No. 65)，GGGSASGG (SEQ.No. 66)SGCGS(SEQ. No. 169)，GGGGSGGGG(SEQ. No. 180)，GGSHG(SEQ. No. 182)，SGGCGGS(SEQ.No. 183)和 AACAA (SEQ. No. 184)。在一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)之間另外還有(f)適合將本發(fā)明的融合蛋白與PEG分子連接的結(jié)構(gòu)域(PEG連接子)。此類連接子可以是已知的序列AlaSerGlyCysGlyProGlu (以單字符表示是ASGCGPE),在序列表中表示為SEQ. NO. 170。PEG連接子也可以選自AlaAlaCysAlaAla(AACAA)，SerGlyGlyCysGlyGlySer (SGGCGGS)和(SGCGS)，在序列表中分別表示為 SEQ.No. 178，SEQ. No. 177 和 SEQ. No. 179。在另一實施方式中，結(jié)構(gòu)域(a) (b) (c) (d) (e)和(f)另外可被至多3個氨基酸殘基間隔開，所述氨基酸殘基特別地選自甘氨酸和谷氨酰胺。此外，在一些實施方式中，融合蛋白可包含hTRAIL的非功能性片段，作為整個構(gòu)建體的C末端部分，例如序列hTRAIL95-121，其位于允許其從構(gòu)建體上被切割下來的序列、有利地是蛋白酶切割位點、優(yōu)選地凝血酶識別的序列之后。此類小的hTRAIL非功能片段的摻入賦予了整個構(gòu)建體更大的親水性，因此允許在表達(dá)過程中改善蛋白的溶解性。在純化步驟之后，hTRAIL95-121將被凝血酶切割。在這樣的情況下，hTRAIL95_121將不會存在于用于制備藥物組合物的融合蛋白中。本領(lǐng)域已知的被凝血酶識別的任何序列都可使用，特別是序列LVPRGS (SEQ.No. 174)。在親脂性效應(yīng)子肽的情況下并且當(dāng)結(jié)構(gòu)域(a)起始于全TRAIL的114位氨基酸或更高位的氨基酸時，此類另外的hTRAIL95-121序列是特別優(yōu)選的。本發(fā)明的融合的蛋白的具體實例是包含在細(xì)胞內(nèi)作用的促細(xì)胞凋亡肽的融合蛋白，選自SEQ. No. I, SEQ. No. 2，SEQ. No. 3，SEQ. No. 4，SEQ.，No. 5，SEQ. No. 6，SEQ. No. 7，SEQ.No. 8，SEQ. No. 9，SEQ. No. 10，SEQ. No. 11，SEQ. No. 12，SEQ. No. 13，SEQ. No. 14，SEQ.No. 15，SEQ. No. 16，SEQ. No. 17，SEQ. No. 18，SEQ. No. 19，SEQ. No. 20，SEQ. No. 21，SEQ.No. 22，SEQ. No23, SEQ. No. 93，SEQ. No. 94，SEQ. No. 95，SEQ. No. 96，SEQ.，No. 97，SEQ.No. 98，SEQ. No. 99，SEQ. No. 100，SEQ. No. 101，SEQ. No. 102，SEQ. No. 103，SEQ. No. 104，SEQ.No. 105，SEQ. No. 106，SEQ. No. 107，SEQ. No. 108，SEQ. No. 109，SEQ. No. 110，SEQ. No. Ill, SEQ.No. 112，SEQ. No. 113，SEQ. No. 114，SEQ. Nol 15，SEQ. No. 116，SEQ. No. 117，SEQ. No. 118，SEQ.No. 119，SEQ. No. 120 和 SEQ. No. 121。本發(fā)明的融合蛋白的其它具體實施方式
是包含在細(xì)胞外作用的促細(xì)胞凋亡肽的融合蛋白，選自SEQ. No. 24，SEQ. No. 25 和 SEQ. No. 26。上述代表性融合蛋白的詳細(xì)描述顯示于圖1-5和9-13，以及如下文的實施例所描述。根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白意思是包含2個或更多個蛋白或其片段的單一的蛋白分子，所述2個或更多個蛋白或其片段通過它們各自的肽鏈內(nèi)的肽鍵共價連接而無另外的化學(xué)連接子。融合的蛋白也可另外被描述為蛋白構(gòu)建體或嵌合蛋白。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“構(gòu)建
19體”或“嵌合蛋白”如果被使用的話，應(yīng)該被理解為是指上文定義的融合蛋白。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，顯而易見的是由此定義的融合蛋白可通過肽和蛋白的已知的化學(xué)合成方法來合成。融合蛋白可通過化學(xué)肽合成的方法來合成，特別是使用合適的樹脂作為載體，使用固相肽合成技術(shù)進(jìn)行。此類技術(shù)是常規(guī)的和本領(lǐng)域已知的，特別描述于例如下列專論中Bodanszky 和 Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag,New York, Stewart et al. , Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, PierceChemical Company。融合蛋白可通過肽的化學(xué)合成方法作為連續(xù)蛋白來合成?；蛘?，可以單獨合成蛋白的各個片段(結(jié)構(gòu)域)，然后通過一個肽片段的氨基末端與另一個肽的羧基末端的縮合經(jīng)由肽鍵而組合在一起。此類技術(shù)是常規(guī)的和本領(lǐng)域已知的。為了驗證得到的肽的結(jié)構(gòu)，可以使用肽的氨基酸組成的已知的分析方法，例如高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，以確定肽的分子量。為了確認(rèn)肽的序列，也可以使用蛋白測序儀，其依次降解肽并鑒定氨基酸的序列。然而，優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白是重組蛋白，通過編碼融合蛋白的多核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法來產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面是編碼如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特別是DNA序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的編碼如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特別是DNA序列是針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的序列。本發(fā)明的另一個方面是包含多核苷酸序列、特別是如上所述的本發(fā)明的DNA序列的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個方面是包含上文所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的優(yōu)選宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。用于產(chǎn)生重組蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。簡而言之，該技術(shù)為產(chǎn)生編碼靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，將編碼靶蛋白的多核苷酸分子摻入合適的表達(dá)載體，其確保多肽的有效表達(dá)。然后將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以進(jìn)行轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以過表達(dá)靶蛋白，純化所獲得的蛋白，任選地通過切割用于表達(dá)或純化蛋白的標(biāo)簽序列而切下來。用于表達(dá)和純化的合適的技術(shù)描述于例如下列專著Goeddel, Gene ExpressionTechnology, Methods in Enzymologyl85, Academic Press,San Diego,CA(1990)和A.Staron et al. , Advances Mikrobiol. , 2008, 47, 2, 1983-1995。作為用于導(dǎo)入和在宿主細(xì)胞中復(fù)制DNA序列的表達(dá)載體，可以使用粘粒、質(zhì)?；蛐揎椀牟《?。通常使用質(zhì)粒作為表達(dá)載體。合適的質(zhì)粒是熟知的和商業(yè)上可獲得。本發(fā)明的表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于轉(zhuǎn)錄和翻譯摻入合適的宿主細(xì)胞的編碼序列的必要的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的選擇取決于宿主細(xì)胞的類型，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地進(jìn)行。此類調(diào)節(jié)序列的實例是包含轉(zhuǎn)錄起始信號的、插入編碼序列之前的轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子或RNA聚合酶結(jié)合序列，核糖體結(jié)合序列，和插入編碼序列之后的轉(zhuǎn)錄終止序列。此外，取決于所用的宿主細(xì)胞和載體，可以將其它序列導(dǎo)入表達(dá)載體，例如復(fù)制起始子，另外的DNA限制性位點，增強子和允許誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的序列。表達(dá)載體還包含標(biāo)記物基因序列，其賦予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞確定的表型并使得能夠特異性選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。此外，載體還可以包含第二標(biāo)記物序列，其允許將以包含插入的編碼靶蛋白序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與攝取了無插入物的質(zhì)粒的細(xì)胞區(qū)分開。通常，使用典型的抗生素抗性標(biāo)記物，然而，任何其它本領(lǐng)域已知的報告子基因均可使用，其在細(xì)胞(在體內(nèi))中的存在可使用放射自顯影技術(shù)、分光光度法或生物和化學(xué)發(fā)光法容易地確定。例如，取決于宿主細(xì)胞，可使用例如下列報告基因半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶、螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或綠色熒光蛋白。此外，表達(dá)載體可包含信號序列，將蛋白轉(zhuǎn)運至合適的細(xì)胞腔室，例如周質(zhì)，在那里促進(jìn)折疊。另外，可以存在編碼標(biāo)記物/標(biāo)簽例如連接于N末端的HisTag或連接于C末端的GST的序列，其促進(jìn)后續(xù)使用親和法、通過鎳柱上的親和層析純化所產(chǎn)生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保護(hù)蛋白免于宿主細(xì)胞中的蛋白水解降解，以及增強其溶解性的序列。連接于靶蛋白的序列的輔助元件可能阻斷其活性，或者由于別的原因而具有有害效應(yīng)，例如由于毒性。此類元件必須被除掉，這可通過酶促或化學(xué)切割來完成。特別地，為了允許通過親和層析而純化蛋白而連接的6個組氨酸的標(biāo)簽HisTag或這種類型的其它標(biāo)記物應(yīng)該被除去，因為其被描述對于可溶性TRAIL蛋白的肝毒性具有影響?？梢允褂没诙喾N熟知的宿主細(xì)胞的異源表達(dá)系統(tǒng)，包括原核細(xì)胞細(xì)菌，例如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌；酵母，例如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母；和真核細(xì)胞系(昆蟲、哺乳動物、植物)。優(yōu)選地，由于培養(yǎng)和遺傳操作的容易性和大量的獲得的產(chǎn)物，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。因此，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列將針對在大腸桿菌中的表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化，即，其將包含在大腸桿菌中表達(dá)優(yōu)化的編碼序列密碼子，選自本領(lǐng)域已知的可能的序列變體。此外，表達(dá)載體將包含適合大腸桿菌的連接于編碼序列的上述元件。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列選自下組的多核苷酸序列SEQ. No. 67，SEQ. No. 68，SEQ. No. 69，SEQ. No. 70，SEQ. No. 71，SEQ. No. 72，SEQ.No. 73，SEQ. No. 74，SEQ. No. 75，SEQ. No. 76，SEQ. No. 77，SEQ. No. 78，SEQ. No. 79，SEQ.No. 80，SEQ. No. 81，SEQ. No. 82，SEQ. No. 83，SEQ. No. 84，SEQ. No. 85，SEQ. No. 86，SEQ.No. 87，SEQ. No. 88)，SEQ. No. 89，SEQ. No. 90，SEQ. No. 91，SEQ. No. 92，SEQ. No. 122，SEQ.No. 123，SEQ. No. 124，SEQ. No. 125，SEQ. No. 126，SEQ. No. 127，SEQ. No. 128，SEQ. No. 129，SEQ.No. 130, SEQ. No. 131，SEQ. No. 132，SEQ. No. 133，SEQ. No. 134，SEQ. No. 135，SEQ.No. 136，SEQ. No. 137，SEQ. No. 138，SEQ. No. 139，SEQ. No. 140，SEQ. No. 141，SEQ. No. 142，SEQ.No. 143)，SEQ. No. 144，SEQ. No. 145，SEQ. No. 146，SEQ. No. 147; SEQ. No. 148，SEQ. No. 149，和SEQ. No. 150 ；其分別編碼具有對應(yīng)于選自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白SEQ. No. I, SEQ. No. 2，SEQ. No. 3，SEQ. No. 4，SEQ. No. 5，SEQ. No. 6，SEQ. No. 7，SEQ.No. 8，SEQ. No. 9，SEQ. No. 10，SEQ. No. 11，SEQ. No. 12，SEQ. No. 13，SEQ. No. 14，SEQ.No. 15，SEQ. No. 16，SEQ. No. 17，SEQ. No. 18，SEQ. No. 19，SEQ. No. 20，SEQ. No. 21，SEQ.No. 22)，SEQ. No. 23，SEQ. No. 24，SEQ. No. 25，SEQ. No. 26，SEQ No. 93，SEQ. No. 94，SEQ.No. 95，SEQ. No. 96，SEQ. No. 97，SEQ. No. 98，SEQ. No. 99，SEQ. No. 100，SEQ. No. 101，SEQ.No. 102，SEQ. No. 103，SEQ. No. 104，SEQ. No. 105，SEQ. No. 106，SEQ. No. 107，SEQ. No. 108，SEQ.No. 109，SEQ. No. 110，SEQ. No. 111，SEQ. No. 112，SEQ. No. 113，SEQ. No. 114，SEQ. No. 115，SEQ.No. 116，SEQ. No. 117 和 SEQ. No. 118，SEQ. No. 119，SEQ. No. 120 和 SEQ. No. 121。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明還提供了適合于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的表達(dá)載體，其包含上述選自SEQ. NO. 67至SEQ. NO. 92和SEQ. NO. 122至SEQ. NO. 150的多核苷酸序列，以及以此類表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化，即將DNA序列導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞特別是大腸桿菌，通常在準(zhǔn)備好攝取DNA的感受態(tài)細(xì)胞上進(jìn)行，例如通過以鈣離子在低溫(4° C)處理，然后進(jìn)行熱擊(37-42° C)或通過電穿孔進(jìn)行。此類技術(shù)是熟知的并且通常由表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)商確定。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中過表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的程序?qū)⒃谙挛脑斒?。本發(fā)明還提供了包含如上文所述的本發(fā)明的融合蛋白作為活性成分以及合適的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和常規(guī)輔助性成分的藥物組合物。藥物組合物將包含有效量的本發(fā)明的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的溶解或分散于載體或稀釋劑中的輔助性成分，優(yōu)選是配制為單元劑型或包含多劑的制劑的藥物制劑的形式。藥物形式和其配制方法以及其它成分、載體和稀釋劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在文獻(xiàn)中有描述。例如，描述于下列專著Remington’s PharmaceuticalSciences,ed. 20，2000，Mack Publishing Company, Easton, USA。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和輔助性成分”包含本領(lǐng)域已知的任何溶劑、分散介質(zhì)、表面活性劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑(例如抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)等滲劑。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體可包含多種類型的載體、稀釋劑和賦形劑，這取決于所選的施用途徑和需要的劑型，例如液體、固體和氣霧劑形式，用于口服、胃腸外、吸入、表面，以及所選的形式對于施用途徑(例如注射)是否必須是無菌的。本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選施用途徑是胃腸外，包括注射途徑，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)或通過單次或連續(xù)靜脈內(nèi)輸注。在一個實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以通過直接注射至腫瘤來施用。在另一實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可通過靜脈內(nèi)施用。在另一實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可皮下或腹膜內(nèi)施用。用于胃腸外施用的藥物組合物可以是藥學(xué)上可接受的水性或非水性介質(zhì)中的溶液或分散體，所述介質(zhì)緩沖至合適的PH和與體液等滲(如果必要)，并且還可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和可溶性物質(zhì)，其使得組合物與受體的組織或血液相容?？砂诮M合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液體乙二醇，脂質(zhì)例如甘油三酯,植物油,脂質(zhì)體。合適的流動性和物質(zhì)粒度可通過涂覆性物質(zhì)例如卵磷脂和表面活性劑例如羥丙基纖維素、聚山梨酸酯等來提供。用于液體胃腸外組合物的合適的等滲劑是例如糖，例如葡萄糖，和氯化鈉，及其組合。
或者，用于通過注射或輸注施用的藥物組合物可以是粉末形式，例如凍干的粉末，用于在臨使用前以合適的載體例如無菌無熱源水進(jìn)行重構(gòu)。用于胃腸外施用的本發(fā)明的藥物組合物也可具有經(jīng)鼻施用的形式，包括溶液、噴霧劑或氣霧劑。優(yōu)選地，用于經(jīng)鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等滲的或緩沖至保持從大約5. 5至大約6. 5的pH，以維持類似于鼻分泌物的性質(zhì)。此外，其將包含防腐劑或穩(wěn)定劑，例如熟知的鼻內(nèi)制劑中包含的那些。組合物可包含多種抗氧化劑，其延遲一種或多種成分的氧化。此外，為了防止微生物的作用，組合物可包含多種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，包括例如，但不限于，尼鉬金酯類，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和這種類型的類似的已知物質(zhì)。一般地，本發(fā)明的藥物組合物可以包含例如至少大約O. 01wt%的活性成分。更具體地，組合物可包含1%至75%重量的活性成分,或例如25%至60%重量,但不限于這些數(shù)值。施用于患者包括人類的根據(jù)本發(fā)明的組合物的實際劑量將由物理和生理因素決定，例如體重、病況的嚴(yán)重性、被治療的疾病的類型，之前或同時的治療性干預(yù)，患者和施用途徑。合適的單元劑量，總劑量和組合物中的活性成分的濃度將由主治醫(yī)生決定。組合物可例如以下列劑量施用大約I μ g/kg體重至大約1000mg/kg患者體重，例如5mg/kg體重至100mg/kg體重,或5mg/kg體重至500mg/kg體重。融合蛋白和包含它的組合物顯示出抗癌或抗腫瘤活性，可用于治療癌癥疾病。本發(fā)明還提供了如上所述的本發(fā)明的融合蛋白用于治療哺乳動物包括人類中的癌癥疾病的用途。本發(fā)明還提供了治療哺乳動物包括人類中的癌癥的方法，包括向有此需要的受試者施用抗癌有效量的如上所述的本發(fā)明的融合蛋白，任選為合適的藥物組合物的形式。本發(fā)明的融合蛋白可用于治療血液惡性腫瘤，例如白血病，肉芽腫病，骨髓瘤和其它血液惡性腫瘤。融合蛋白也可用于治療實體瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，腎癌，腦癌等。用于治療癌癥的融合蛋白的合適的施用途徑特別為胃腸外途徑以注射或輸注的形式、在組合物中和以適合于該施用途徑的形式施用本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明將以下列一般性程序和具體融合蛋白的實例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。用于過表達(dá)融合蛋白的一般性程序質(zhì)粒的制備靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以產(chǎn)生編碼它的DNA序列，包含針對在大腸桿菌中的表達(dá)優(yōu)化的密碼子。此程序允許增大在大腸桿菌中進(jìn)行靶蛋白合成的后續(xù)步驟的效率。然后自動化合成得到的核苷酸序列。另外，將限制性酶Ndel (在引導(dǎo)鏈的5’末端)和Xhol(在引導(dǎo)鏈的3’末端)的切割位點添加到得到的編碼靶蛋白的基因中。它們用于將基因克隆進(jìn)入載體pET28a(Novagen)。它們也可用于將編碼蛋白的基因克隆進(jìn)入其它載體。從該構(gòu)建體表達(dá)而來的靶蛋白在N末端具有多聚組氨酸標(biāo)簽(6個組氨酸)，其之前是凝血酶識別的位點，該位點用于后續(xù)通過親和層析進(jìn)行純化。首先通過使用酶Ndel和Xhol對分離的質(zhì)粒進(jìn)行限制性分析、然后通過靶蛋白的整個閱讀框的自動化測序來確認(rèn)得到的構(gòu)建體的正確性。用于測序的引物互補于存在于載體中的T7啟動子的序列(5，-TAATACGACTCACTATAGG-3’)和 T7 終止子的序列(5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’)。
得到的質(zhì)粒用于在商業(yè)化大腸桿菌菌株中過表達(dá)靶融合蛋白，其根據(jù)生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在選擇性培養(yǎng)基(LB瓊脂，卡那霉素50 μ g/ml, 1%葡萄糖)上獲得的菌落用于制備LB液體培養(yǎng)基(補充了 50 μ g/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的過夜培養(yǎng)物。在搖動的溫育箱中生長大約15小時之后，培養(yǎng)物用于接種合適的培養(yǎng)物。融合蛋白的過表達(dá)和純化一一般程序A以過夜培養(yǎng)物接種含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸鋅的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37°C溫育直至600nm下的光密度(OD)達(dá)到O. 60-0. 80。然后加入IPTG至終濃度為O. 25-lmM。在25°C搖動溫育后(3. 5_20h)，將培養(yǎng)物在6，OOOg離心25分鐘。將細(xì)菌沉淀物重懸于含有50mM KH2PO4, O. 5M NaCl，IOmM咪唑，pH7. 4的緩沖液中。將懸浮液在冰上超聲8分鐘(40%振幅，15秒脈沖，10秒間隔)。通過在20，000g、4°C離心40分鐘而使得到的提取物澄清。以用于制備細(xì)菌細(xì)胞提取物的緩沖液平衡預(yù)處理Ni-S印harose樹脂(GE Healthcare)。然后使用離心提取物后獲得的上清液將樹脂在4°C過夜溫育。然后將其載入色譜柱并以15-50倍體積的緩沖液50mM KH2PO4, O. 5M NaCl, 20mM咪唑，pH7. 4洗滌。使用含有O. 5M NaCl pH7. 4的50mM KH2PO4緩沖液中的咪唑梯度從柱洗脫獲得的蛋白。通過SDS-PAGE分析獲得的級份。將合適的級份組合并以50mM Tris緩沖液，ρΗ7· 2，150mM NaCl, 500mM L-精氨酸，O. ImM ZnSO4, O. 01%Tween20 在 4°C過夜透析，同時，以凝血酶切割Histag (1:50)。切割之后，使用Benzamidine Sepharose 樹脂從革巴融合蛋白分離凝血酶。通過SDS-PAGE電泳分析產(chǎn)物的純度(Maniatis et al, MolecularCloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982)。融合蛋白的過表汰和純化一一般稈序B以過夜培養(yǎng)物接種含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸鋅的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37°C溫育直至600nm下的光密度(OD)達(dá)到0. 60-0. 80。然后加入IPTG至終濃度為0. 5-lmM。在25°C搖動溫育20h后，將培養(yǎng)物在6，OOOg離心25分鐘。將過表達(dá)后的細(xì)菌細(xì)胞在弗氏細(xì)胞壓碎器中在含有50mMKH2P04，0. 5M NaCl, IOmM咪唑，5mM β -巰基乙醇，0. 5mM PMSF (苯基甲基磺酰氟)，pH7. 8的緩沖液中破碎。通過在8，OOOg離心50分鐘使得到的提取物澄清。使用獲得的上清液過夜溫育Ni-S^harose樹脂。然后將結(jié)合了蛋白的樹脂載入色譜柱。為了洗掉含有非結(jié)合性蛋白的級份，以15-50倍體積的緩沖液50mM KH2PO4, 0. 5M NaCl, IOmM咪唑，5πιΜβ -巰基乙醇，0. 5mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)，pH7.8洗滌柱。然后，為了洗掉大部分的特異性與床結(jié)合的蛋白，以含有 50mM KH2PO4, 0. 5M NaCl, 500mM 咪唑，10% 甘油，0. 5mM PMSF, pH7. 5 的緩沖液洗滌柱。通過 SDS-PAGE 分析獲得的級份(Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold SpringHarbor, NY, 1982)。將含有靶蛋白的級份組合并以凝血酶切割(lU/4mg蛋白，16°C，8小時)以除掉多聚組氨酸標(biāo)簽。然后將級份以配制緩沖液(500mM L-精氨酸，50mM Tris, 2, 5mMZnSO4, pH7. 4)透析。使用2-D電泳表征融合蛋白為了進(jìn)一步表征獲得的蛋白并精確選擇色譜條件，測定了蛋白質(zhì)的等電點。為此，使用了 2維電泳(2-D)方法，根據(jù)下列程序以2步進(jìn)行。步驟I :在pH梯度和變性條件下進(jìn)行蛋白的等電聚焦通過與含有10%三氯乙酸和0. 07% β -巰基乙醇/丙酮的沉淀溶液按照I: I的比例混合而沉淀濃度為l_2mg/ml的蛋白制劑。將混合物在_20°C溫育30分鐘，然后在15，OOOg,4°C離心25分鐘。除去上清液并以冷的丙酮(含有0.07%β-巰基乙醇)洗滌沉淀物兩次。然后蒸發(fā)殘余的丙酮直至無可檢測的氣味。將蛋白沉淀物懸于250ml的復(fù)水緩沖液SM尿素，1%CHAPS, 15mM DTT, O. 5% 兩性電解質(zhì)(GE Healthcare)，pH 為 pH3_l I 或 6-11，取決于后續(xù)使用的條帶。將蛋白溶液置于陶瓷室中進(jìn)行等電聚焦，然后置于具有合適的PH值(3-11或6-11)的13cm DryStrip (GE Healthcare)中。使用礦物油層覆蓋全部。將室置于EttanIPGphor III裝置中，根據(jù)下列程序(根據(jù)條帶的尺寸和pH值分配)進(jìn)行等電聚焦。在20°C脫水16小時。在固定的pH梯度在電場中聚焦
時間電壓I小時500VI小時梯度 500 - 1000V2小時30分鐘梯度 1000 - 8000V30分鐘8000V然后，將含有聚焦的蛋白的條帶在去離子水中洗滌I分鐘，以考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色并存檔為圖像以標(biāo)記蛋白的位置。以下列成分的緩沖液平衡脫色的條帶2次各15分鐘50mM Tris-HCl ρΗ8· 8，6Μ 尿素，1%DTT, 2%SDS, 30% 甘油。步驟2 :通過SDS-PAGE在第二維上分離將條帶置于含有單一的孔/大小標(biāo)準(zhǔn)物中的12. 5%的聚丙烯酰胺凝膠上，然后在200V的電壓下進(jìn)行SDS-PAGE3小時以進(jìn)行分離。以考馬斯亮藍(lán)染色凝膠，然后使用適當(dāng)?shù)谋壤４?。通過基于大小標(biāo)準(zhǔn)物測定蛋白的分子量來鑒定蛋白，基于生產(chǎn)商(GEHealthcare)提供的曲線以6_11的標(biāo)度(pH與從標(biāo)記為陽極的末端條帶的長度的％之比)，或基于通過等電聚焦校正試劑盒(GE Healthcare)通過實驗測定的曲線以3_11的標(biāo)度讀取其IPI。以下描述本發(fā)明的融合蛋白的代表性實例。實施例I :SEQ. NO. I的融合蛋白SEQ. No. I的蛋白是具有194個氨基酸的長度和22. 7kDa的分子量的融合蛋白，其中在TRAIL121-281序列的N末端連接了源自Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的16個氨基酸的肽(SEQ. NO. 30)作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽的16個氨基酸的序列的C末端連接了 7個Arg/R殘基的多聚精氨酸序列。多聚精氨酸序列輔助穿透細(xì)胞膜和將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。在多聚精氨酸序列和TRAIL結(jié)構(gòu)域之間摻入了彼此相鄰的被尿激酶uPA識別的序列(SEQ.NO. 52)和被金屬蛋白酶MMP識別的序列(SEQ. NO. 51)，由此在融合蛋白內(nèi)化之后效應(yīng)子肽將在腫瘤環(huán)境中被切割。融合蛋白的結(jié)構(gòu)示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別是SEQ. NO. I和SEQ. NO. 67，如下所示
25
氨基酸序列SE0 · NO · I
IKKLSECLKRI⑶ELDSRRRRRRRRVVRPLGLAGRVAAHITGTRGRSNTLS
51SPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQ
101TYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEY
151GLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
DNA 序列:SEQ · NO ·67
1 GCCCACCAGA MTGCACCAA AMAGCTGGC TTCATGATCC ATATCMTCAGATGWCATT GGTCACGCTC ACAMMTGC GATCATTTTC TTTCAGTTCA101 MMTGCCAC CCTGATAAAT GCTATACAGG CCATATTCTG CATCTTTGCTCCAACAGCTA TTACGTGCGC TTTTCATCAG CAGAATCGGA TCCGGATAGC201 TGGTATAJTT ATAMTGTAC TGCACCATTT GTTTATCATT TTTGGTAWTTCTTTAATTT CTTCCTGMA GCGMMTAG GTCTGGCTAT ΑΑΑΤΑΤΜΤΛ301 MAGCCTTTT TCATGMTCA CCAGTTCACC ATTACGCAGA TGCAGATTGCTCAGMAGCT ATGACCGCTA CGGCTGCTTT CCCAGCTATT AATTTTGCGA401 CCCAGGGCTT TTTCATTTTT GCTATTCGGG CTGCTCAGGG TATTGCTACGACCACGGGTG CCGGTAATAT GTGCTGCAAC ACGACCTGCC AGACCCAGCfi501 GACGMCAAC ACGACGACGG CGACGACGAC GACGGCTATC CAGTTCATCACCAATACGTT TCAGGCATTC GCTCAGTTTT TT上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列。產(chǎn)生了包含DNA的編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般程序進(jìn)行了融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A，使用大腸桿菌菌株BL21(DE3)和Tuner (DE3)pLysS (二者都來自Novagen)進(jìn)行過表達(dá)。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白質(zhì)。實施例2 SEQ. NO. 2的融合蛋白SEQ. No. 2的融合蛋白是具有193個氨基酸的長度和22. 5kDa的分子量的蛋白，其中在121-281TRAIL序列的N末端連接了源自Bid蛋白的16個氨基酸的肽(SEQ. NO. 31)作為效應(yīng)子肽。另外，在效應(yīng)子肽的C末端連接了由7個Arg殘基組成的多聚精氨酸序列。多聚精氨酸序列輔助穿透細(xì)胞膜和將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。在多聚精氨酸序列和TRAIL序列之間摻入了彼此相鄰的被金屬蛋白酶MMP識別的序列(SEQ.N0. 51)和被尿激酶uPA識別的序列(SEQ. NO. 52)，由此在融合蛋白內(nèi)化之后效應(yīng)子肽將在腫瘤環(huán)境中被切割。融合蛋白的結(jié)構(gòu)示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別是SEQ. NO. 2和SEQ. NO. 68，如下所示
氣基酸序列SEQ. NO. 2
I RNIARHLAQV ⑶SMDRRRRR RRRVVRPLGL AGRVAAHITG TRGRSNTLSS51 PNSKNEKALG RKINSffESSR SGHSFLSNLH LRNGELVIHE KGFYYIYSQT101 YFRFQEEIKE NTKNDKQMVQYIYKYTSYPD PILLMKSARN SCffSKDAEYG151 LYSIYQGGIF ELKENDRIFV SVTNEHLIDM DHEASFFGAF LVGDNA 序列SEQ. NO. 68
2權(quán)利要求
1.融合蛋白，其包含結(jié)構(gòu)域(a)，其為可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或與其具有至少70%同源性的序列；和結(jié)構(gòu)域(b)，其為促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽的序列，其通過內(nèi)部細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮其促細(xì)胞調(diào)亡作用，其中結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端。
2.權(quán)利要求I的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(a)是可溶性hTRAIL蛋白序列的片段，該片段始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端點，終于氨基酸hTRAIL281。
3.權(quán)利要求I或2的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(a)選自hTRAIL114-281(SEQ. No.27)， hTRAIL119-281 (SEQ. No. 28)，hTRAIL121_281 (SEQ. No. 29)， hTRAILl16-281和hTRAIL120-281o
4.權(quán)利要求I的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(a)是序列hTRAIL95-281。
5.權(quán)利要求1-4任一項的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(b)選自SEQ.NO.30的Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域的片段；SEQ.NO.31的Bid蛋白的片段；SEQ.NO.32的核糖核酸酶A ;SEQ.NO.33的細(xì)胞色素C ；SEQ.NO.34的粒酶B ；SEQ.NO.35的Nur77蛋白的片段；SEQ.NO.36的Bak蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域；SEQ.NO.37的PUMA/BBC3蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域；SEQ.NO.38的 PUMA/BBC3 蛋白；SEQ.NO.39的SMAC/Diablo蛋白的片段；SEQ.NO.40的 buforin A ；SEQ.NO.41的豹蛙酶；SEQ.NO.42的Mdm2蛋白的片段；SEQ.NO.43的與Mdm2結(jié)合的肽；SEQ.NO.44的Iunasin的片段；SEQ.NO.45的Bik蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域；SEQ.NO.46的蛋白酶體的肽抑制劑；SEQ.NO.47的包含蛋白酶體結(jié)合性UIM基序的結(jié)構(gòu)域；SEQ.NO.151的azurin衍生的肽；SEQ.NO.152的全長azurine肽；SEQ.NO.153的從aPP蛋白和Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域設(shè)計的肽SEQ.NO.154的從aPP蛋白和Bax蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域設(shè)計的肽SEQ.NO.155 的 Reticulon RTNl-C 衍生的肽；SEQ.NO.156 的全長人 Reticulon 3 ；SEQ.NO.157的修飾的組成型活性胱天蛋白酶-3 ；SEQ.NO.158的來自Par-4蛋白的SAC結(jié)構(gòu)域；SEQ.NO.159的Noxa蛋白；SEQ.NO.160的Noxa蛋白的MTD/CKP片段； SEQ.NO.161的短的雜合肽Antp-TPR ；SEQ.NO.162的Stat3蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域的肽抑制劑SEQ.NO.163的Bak蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域衍生的肽；SEQ.NO.164的Bad蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域衍生的肽；和SEQ.NO.165的來自Bfll蛋白的肽ATAP。
6.權(quán)利要求1-5任一項的融合蛋白，其在結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)之間包含結(jié)構(gòu)域(C)，所述結(jié)構(gòu)域(C)包含被存在于腫瘤細(xì)胞環(huán)境中的蛋白酶識別的蛋白酶切割位點，其選自金屬蛋白酶MMP識別的序列，尿激酶uPA識別的序列，弗林蛋白酶識別的序列，及其組合。
7.權(quán)利要求6的融合蛋白，其中金屬蛋白酶MMP識別的序列是SEQ.No. 51，SEQ. No.171或SEQ. No. 173，尿激酶uPA識別的序列是SEQ. No. 52，弗林蛋白酶識別的序列是SEQ. No. 53 或 Seq. No. 172。
8.權(quán)利要求6或7的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(c)是彼此相鄰的金屬蛋白酶MMP識別的序列與尿激酶uPA識別的序列的組合。
9.權(quán)利要求6或7的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(c)是弗林蛋白酶識別的序列。
10.前述權(quán)利要求任一項的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(b)另外與轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)相連，所述轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)選自(dl)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列；(d2)穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的多聚精氨酸序列，其包含6、7、8或9個Arg殘基；(d3)選自SEQ. NO. 54或SEQ. NO. 176的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；(d4)膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域；(d5)細(xì)胞核定位結(jié)構(gòu)域；和(d6)線粒體祀向結(jié)構(gòu)域；及其組合。
11.權(quán)利要求10的融合蛋白，其中靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列(dl)是KEDL(SEQ. No. 55)或KDEL (SEQ. No. 56)。
12.權(quán)利要求10或11的融合蛋白，其中靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列(dl)位于融合蛋白的C末端。
13.權(quán)利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸序列(d2)位于融合蛋白的C末端。
14.權(quán)利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸(d2)位于結(jié)構(gòu)域(b)和(c)之間。
15.權(quán)利要求10的融合蛋白，其中銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(d3)位于位于結(jié)構(gòu)域(a)和(c)之間。
16.前述權(quán)利要求任一項的融合蛋白，其在結(jié)構(gòu)域(a)，(b),(c)和/或(d)之間另外包含甘氨酸-絲氨酸柔性空間連接子的結(jié)構(gòu)域(e)。
17.權(quán)利要求16的融合蛋白，其中所述甘氨酸-絲氨酸連接子選自GGSG(SEQ. No.57)， GGGS (SEQ. No. 58)， GGGGS (SEQ. No. 59)，GGSGG (SEQ. No. 60)， GGGSGG (SEQ.No. 61)，GGGSGGG (SEQ.No. 62)，GGGSGGGS (SEQ. No. 63)，GGGSGGGGS (SEQ. No.64)，ASGG (SEQ. No. 65)，GGGSASGG (SEQ. No. 66)，GGSHG (SEQ. No. 182)，SGCGS(SEQ. No. 169)，GGGGSGGGG (SEQ. No. 180), SGGCGGS (SEQ. No. 183)和 AACAA (SEQ.No. 184)。
18.權(quán)利要求I的融合蛋白，其具有選自下列的氨基酸序列SEQ.No. I; SEQ. No. 2SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 7; SEQ. No. 8 ; SEQNo. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11; SEQ. No. 12; SEQ. No. 13; SEQ. No. 14; SEQ. No15; SEQ. No. 16; SEQ. No. 17; SEQ. No. 18; SEQ. No. 19; SEQ. No. 20; SEQ. No21; SEQ. No. 22) ; SEQ. No. 23; SEQ. No. 24; SEQ. No. 25，SEQ. No. 26，SEQ. No93，SEQ. No. 94，SEQ. No. 95，SEQ. No. 96，SEQ.，No. 97，SEQ. No. 98，SEQ. No99，SEQ. No. 100，SEQ. No. 101，SEQ. No. 102，SEQ. No. 103，SEQ. No. 104，SEQ,No. 105，SEQ. No. 106，SEQ. No. 107，SEQ. No. 108，SEQ. No. 109，SEQ. No. 110，SEQ. No. Ill, SEQ. No. 112, SEQ. No. 113，SEQ. No. 114，SEQ. No 115，SEQ. No.116，SEQ. No. 117, SEQ. No. 118，SEQ. No. 119，SEQ. No. 120 和 SEQ. No. 121。
19.前述權(quán)利要求任一項的融合蛋白，其是重組蛋白。
20.前述權(quán)利要求任一項的融合蛋白，其另外包含序列hTRAIL95-121作為其C末端部分，在該序列之前是蛋白酶切割位點的序列，從而允許其從構(gòu)建體上被切割下來。
21.編碼權(quán)利要求1-20任一項中定義的融合蛋白的多核苷酸序列。
22.權(quán)利要求21的多核苷酸序列，針對在大腸桿菌中的遺傳表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。
23.權(quán)利要求22的多核苷酸序列，選自SEQ.No. 67; SEQ. No. 68; SEQ. No.SEQ. No. 70; SEQ. No. 71; SEQ. No. 72; SEQ. No. 73; SEQ. No. 74 ; SEQ. NoSEQ. No. 76; SEQ. No. 77; SEQ. No. 78; SEQ. No. 79; SEQ. No. 80SEQ. No. 82 ; SEQ. No. 83; SEQ. No. 84; SEQ. No. 85; SEQ. No.87; SEQ. No. 88) ; SEQ. No. 89; SEQ. No. 122; SEQ. No. 123; SEQ.No. 125; SEQ. No. 126; SEQ. No. 127; SEQ. No. 128; SEQ. No. 129SEQ. No. 131; SEQ. No. 132; SEQ. No. 133; SEQ. No. 134; SEQ. No.136; SEQ. No. 137; SEQ. No. 138; SEQ. No. 139; SEQ. No. 140; SEQ.No. 142; SEQ. No. 143; SEQ. No. 144; SEQ. No. 145; SEQ. No. 146;SEQ. No. 148; SEQ; No. 149;和 SEQ. No. 150。
24.表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求21-23任一項的多核苷酸序列。
25.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求24的表達(dá)載體。
26.權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌細(xì)胞。
27.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-19任一項的融合蛋白作為活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體組合。
28.權(quán)利要求1-19任一項的融合蛋白用于治療哺乳動物包括人中的癌癥疾病的用途。
29.治療哺乳動物包括人中的癌癥疾病的方法，包括向有此需要的受試者施用抗癌有效量的權(quán)利要求1-19任一項的融合蛋白或權(quán)利要求27的藥物組合物。
全文摘要
融合蛋白，尤其是重組的融合蛋白，其包含結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)，結(jié)構(gòu)域(a)是可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或與其具有至少70%序列同源性的序列；結(jié)構(gòu)域(b)是促細(xì)胞凋亡效應(yīng)子肽的序列，結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端。所述融合蛋白具有抗癌活性。編碼所述融合蛋白的核苷酸序列，用于制備所述融合蛋白的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，以及所述融合蛋白用于治療癌癥疾病的用途。
文檔編號C07K14/435GK102958940SQ201180031414
公開日2013年3月6日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者J·S·皮耶奇克蘭, S·D·帕夫拉克, B·M·澤雷克, K·K·萊姆克 申請人:阿達(dá)梅德公司