專利名稱：Ospa嵌合體及其在疫苗中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及嵌合OspA多肽、編碼所述多肽的核酸、包含這些分子的組合物以及其使用方法。
背景技術(shù)：
萊姆病(Lymedisease)是由廣義伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferisensuIato (s.1.))引起的蜱傳疾病。這種疾病的典型特征在于:在蜱蟲叮咬部位處的擴(kuò)散紅疹的發(fā)展，之后可能是包括腦膜炎、心臟炎或關(guān)節(jié)炎的全身并發(fā)癥。萊姆病的幾乎所有病例都是由三個(gè)同基因型種阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、伽氏疏螺旋體(Borreliagarinii)以及狹義伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.))中的一個(gè)引起的。在歐洲，發(fā)現(xiàn)了感染人類的所有這三種種類。然而，在北美洲僅發(fā)現(xiàn)了單一個(gè)種類:狹義伯氏疏螺旋體。伯氏疏螺旋體是疏螺旋體屬(Borrelia)的螺旋體類的革蘭氏陰性菌的一個(gè)種類。針對萊姆病的抗生素治療通常是有效的，但一些患者發(fā)展成涉及關(guān)節(jié)或神經(jīng)系統(tǒng)的慢性致殘形式的疾病，所述疾病甚至在腸胃外抗生素治療之后都未得到實(shí)質(zhì)性改善，由此凸顯了高危人群 對于疫苗的需要。外膜蛋白A(OspA)是存在于硬蜱屬蜱蟲的中腸中的由廣義伯氏疏螺旋體種類表達(dá)的31kDa抗原。已證實(shí)OspA在預(yù)防北美洲的萊姆病中是有效的(Steere等，N.Engl.J.Med.339:209-15，1998 ；Sigal 等，N.Engl.J.Med.339:216-22，1998 ；N.Engl.J.Med.339:571, 1998中的正誤表)。經(jīng)過完全加工的OspA的氨基末端是用三個(gè)脂肪?；溸M(jìn)行翻譯后修飾的半胱氨酸殘基，這三個(gè)脂肪?；湆⒌鞍族^定到細(xì)菌膜的外表面上(Bouchon 等,Anal.Biochem.246:52-61，1997)。據(jù)報(bào)道 OspA 的脂質(zhì)化可穩(wěn)定分子(Luft,個(gè)人通信)并且在不存在強(qiáng)效的佐劑下對保護(hù)作用來說是至關(guān)重要的(Erdile等，Infect.1mmun.61:81-90, 1993)。缺少氨基末端脂質(zhì)膜錨的可溶重組形式的蛋白被與凝集型小鼠單克隆抗體的Fab片段一起共結(jié)晶以便確定OspA的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被顯示包含后接單一個(gè)α螺旋的 21 個(gè)反平行 β 鏈(Li 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S..Α.94:3584-9，1997)。基于OspA的單價(jià)疫苗(LYMErk )在美國有售，用于預(yù)防萊姆病。然而，在歐洲，橫跨三個(gè)基因種的OspA序列的異質(zhì)性妨礙了基于來自單一菌株的OspA的疫苗的廣泛保護(hù)作用(Gern等，Vaccine 15:1551-7,1997)。在歐洲分離物中已經(jīng)識別出七個(gè)主要的OspA血清型(指定為血清型 I 至 7, Wilske 等,J.Clin.Microbiol.31:340-50，1993)。OspA 血清型與種類相關(guān)聯(lián)；血清型I對應(yīng)于狹義伯氏疏螺旋體，血清型2對應(yīng)于阿氏疏螺旋體并且血清型3至7對應(yīng)于伽氏疏螺旋體。通過用OspA免疫獲得的保護(hù)性免疫是少有的，因?yàn)樗拗鞯拿庖叻磻?yīng)與病原體之間的相互作用不會發(fā)生在宿主體內(nèi)，而是發(fā)生在蜱蟲載體的中腸中。就萊姆病而論，蜱蟲充當(dāng)萊姆病從動(dòng)物傳播到人類的載體(vector或carrier)。在受感染的蝶蟲的進(jìn)食期間獲得的OspA特異性抗體防止廣義伯氏疏螺旋體傳播到被免疫的哺乳動(dòng)物宿主(de Silva等，J.Exp.Med.183:271-5, 1996)。保護(hù)作用是抗體介導(dǎo)的并且主要通過殺菌性抗體而受到影響，盡管阻礙螺旋體附接至蜱蟲腸道上皮組織的內(nèi)層上的受體的抗體也可能是有效的(Pal 等，J.1mmunol.166:7398-403，2001)。有效OspA疫苗的合理開發(fā)要求鑒定保護(hù)性表位，如由保護(hù)性單克隆抗體LA-2限定的表位(Golde等,Infect.1mmun.65:882-9，1997)。X射線晶體學(xué)和NMR分析已被用來鑒定OspA中的在免疫學(xué)上重要的高變域并且已將LA-2表位定位到氨基酸203-257 (Ding等，J.Mol.Biol.302:1153-64,2000; Luft 等，J Infect Dis.185 (增刊 I): S46-51, 2002)。本領(lǐng)域中存在開發(fā)OspA疫苗的需要，所述OspA疫苗能夠提供針對在美國、歐洲以及其它地方存在的疏螺旋體屬的多種種類的廣泛保護(hù)。以下公開描述了這種疫苗的細(xì)節(jié)。發(fā)明概述本發(fā)明解決了本領(lǐng)域中與萊姆病或萊姆疏螺旋體病的預(yù)防和治療相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)需求。本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由SEQ ID N0:l、3以及5中闡述的序列組成的組的核苷酸序列。在一些方面，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其由選自由SEQ ID N0:l、3以及5中闡述的序列組成的組的核苷酸序列組成。在其它方面，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列:(a)與包含SEQID NO: KSEQ ID N0:3或SEQ ID NO :5中闡述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。在其它方面，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列:(a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與包含SEQ IDNO: 2, SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 6中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一'I"生；和(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。在甚至其它方面，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列:(a)編碼包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID N0:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的取代；(b)編碼包含SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的插入；(c)編碼包含SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:4或SEQ IDN0:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的內(nèi)部缺失；(d)編碼包含SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ IDNO:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的C末端和/或N末端截短；(e)編碼包含SEQ IDN0:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的修飾，所述修飾選自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及(f)與(a)至(e)中任何一個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由SEQ ID N0:7、9以及11中闡述的序列組成的組的核苷酸序列。在一些方面，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其由選自由SEQ ID N0:7、9以及11中闡述的序列組成的組的核苷酸序列組成。在其它方面，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列:(a)與包含SEQ IDNO:7, SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 11中闡述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。在其它方面，本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列:(a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與包含SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一'丨生；和(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。在甚至其它方面,本發(fā)明包括一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列:(a)編碼包含SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的取代；(b)編碼包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的插入；(c)編碼包含SEQ ID NO:8, SEQID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的內(nèi)部缺失；(d)編碼包含SEQID NO:8、SEQ IDNO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的C末端和/或N末端截短；(e)編碼包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的修飾，所述修飾選自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及(f)與(a)至(e)中任何一個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明包括載體、宿主細(xì)胞以及通過培養(yǎng)本文論述的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生多肽的方法。在一些方面，本發(fā)明包括包含本文描述的任何核酸分子的載體。在其它方面，本發(fā)明包括包含所述載體的宿主細(xì)胞。在一些方面，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在其它方面，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在各個(gè)方面，產(chǎn)生多肽的方法包括在適于表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)本文描述的宿主細(xì)胞，并且任選地使多肽與培養(yǎng)物分離。在各個(gè)方面，本發(fā)明包括包含這些嵌合核酸分子中的任何嵌合核酸分子或包含所述核酸分子的任何載體和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的組合物。本發(fā)明包括組合物，其包含本文論述的核酸分子中的任一種或本文論述的載體(vector)中的任一種以及藥學(xué)上可接受的載體(carrier)。在一些方面,本發(fā)明包括組合物，其包含本文論述的核酸分子中的至少兩種和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述核酸分子具有不同的核苷酸序列。在具體方面，本發(fā)明包括組合物，其包含SEQ ID N0:l、3以及5中闡述的核苷酸序列的組合。本發(fā)明包括一種分離的多肽，其包含選自由SEQ ID N0:2、4以及6中闡述的序列組成的組的氨基酸序列。在一些方面，本發(fā)明包括一種分離的多肽，其由選自由SEQ IDN0:2、4以及6中闡述的序列組成的組的氨基酸序列組成。在其它方面，本發(fā)明包括一種分離的多肽，其包含具有至少200個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述氨基酸序列與包含SEQID NO: 2,SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在其它方面，本發(fā)明包括一種分離的多肽，其包含選自由SEQ ID N0:8、10以及12中闡述的序列組成的組的氨基酸序列。在甚至其它方面，本發(fā)明包括一種分離的多肽，其由選自由SEQ ID N0:8、10以及12中闡述的序列組成的組的氨基酸序列組成。在一些方面，本發(fā)明包括一種分離的多肽，其包含具有至少200個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述氨基酸序列與包含SEQ ID NO:8, SEQ IDN0:10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
本發(fā)明包括組合物，其包含本文論述的多肽中的任一種和藥學(xué)上可接受的載體。在一些方面，本發(fā)明包括組合物，其包含本文論述的多肽中的至少兩種和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述多肽具有不同的氨基酸序列。在具體方面，本發(fā)明包括組合物，其包含多肽的組合，所述多肽包含SEQ ID N0:2、4以及6中闡述的氨基酸序列。本發(fā)明包括免疫原性組合物。在一些方面,本發(fā)明的免疫原性組合物包含本文論述的組合物中的任何組合物和藥學(xué)上可接受的載體。在各個(gè)方面，所述免疫原性組合物具有誘導(dǎo)產(chǎn)生特異地結(jié)合外膜蛋白A(OspA)蛋白的抗體的性質(zhì)。在某些方面，所述免疫原性組合物具有誘導(dǎo)產(chǎn)生特異地結(jié)合疏螺旋體屬的抗體的性質(zhì)。在特定方面，所述免疫原性組合物具有誘導(dǎo)產(chǎn)生中和疏螺旋體屬的抗體的性質(zhì)。在某些方面，疏螺旋體屬是廣義伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi sensu lato)。在特定方面，疏螺旋體屬是阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii) >伽氏疏螺旋體(Borrelia garinii)或狹義伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi sensustricto)。在其它方面，疏螺旋體屬是日本疏螺旋體(Borrelia japonica)、安德森疏螺旋體(Borrelia andersonii)、比塞蒂疏螺旋體(Borreliabissettii)、西尼伽疏螺旋體(Borrelia sinica)、土德疏螺旋體(Borreliaturdi)、塔盧基疏螺旋體(Borrelia tanukii)、法雷斯疏螺旋體(Borreliavalaisiana)、盧西塔尼疏螺旋體(Borrelia lusitaniae)、斯柏曼疏螺旋體(Borrelia spielmanii)、宮本疏螺旋體(Borrelia miyamotoi)或孤星疏螺旋體(Borrelialonestar) 0在一些方面，抗體是由動(dòng)物產(chǎn)生。在其它方面，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在甚至其它方面，哺乳動(dòng)物是人類。本發(fā)明包括疫苗組合物。在一些方面,本發(fā)明的疫苗組合物包含本文論述的任何免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的載體。在各個(gè)方面，本發(fā)明包括聯(lián)合疫苗。在某些方面，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗包含本文論述的任何疫苗組合物聯(lián)合至少一種第二疫苗組合物。在一些方面，第二疫苗組合物防御蜱傳疾病。在各個(gè)方面，所述蜱傳疾病是落基山斑疹熱(Rocky Mountain Spotted Fever)、巴貝斯蟲病(Babesiosis)、回歸熱、科羅拉多蝶熱(Colorado tick fever)、人單核細(xì)胞埃立克體病(HME)、人粒細(xì)胞埃立克體病(HGE)、南方蜱叮咬相關(guān)的皮疹疾病(STARI)、兔熱病(Tularemia)、蜱癱瘓、波瓦桑腦炎(Powassanencephalitis)、寇熱病、克里米亞剛果出血熱(Crimean-Congo hemorrhagic fever)、胞裂蟲病(Cytauxzoonosis)、南歐斑疫熱(boutonneuse fever)或蝶傳腦炎。在其它方面，所述第二疫苗組合物是選自由 以下組成的組的疫苗:蜱傳腦炎疫苗、日本腦炎疫苗以及落基山斑疹熱疫苗。在各個(gè)方面，所述第二疫苗組合物具有與針對疏螺旋體屬感染或萊姆病的免疫相容的季節(jié)性免疫程序(seasonal immunization schedule)。本發(fā)明包括用于誘導(dǎo)受試者體內(nèi)的免疫反應(yīng)的方法。在各個(gè)方面，所述方法包括向受試者施用有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的量的本文論述的免疫原性組合物或疫苗組合物中的任一種的步驟。在某些方面，免疫反應(yīng)包括產(chǎn)生抗OspA抗體。本發(fā)明包括特異地結(jié)合本文描述的任何多肽的抗體或其片段。本發(fā)明包括用于預(yù)防或治療受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法。在各個(gè)方面，所述方法包括向受試者施用有效預(yù)防或治療疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的本文論述的疫苗組合物中的任一種或本文論述的聯(lián)合疫苗中的任一種的步驟。在其它方面，所述方法包括向受試者施用有效預(yù)防或治療疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的本文論述的抗體中的任一種的步驟。在其它方面，所述方法包括向受試者施用有效預(yù)防或治療所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的抗體或其片段的步驟，所述抗體或其片段是通過用如權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物使哺乳動(dòng)物免疫來產(chǎn)生。在其它方面，所述抗體或其片段是高免疫血清、高免疫血漿或其純化的免疫球蛋白部分。本發(fā)明包括用于被動(dòng)地預(yù)防受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效預(yù)防所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的抗OspA抗體或其片段，所述抗OspA抗體或其片段是通過用本文論述的疫苗組合物中的任一種使哺乳動(dòng)物免疫來產(chǎn)生，其中所述抗體或其片段是純化的免疫球蛋白制劑或免疫球蛋白片段制劑。本發(fā)明包括用于預(yù)防受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效預(yù)防所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的抗OspA單克隆抗體或其片段，所述抗OspA單克隆抗體或其片段是在用本文論述的疫苗組合物中的任一種使受試者免疫之后產(chǎn)生。在一些方面，所述單克隆抗體或其片段是人源化的。在一個(gè)特定方面，所述單克隆抗體是F237/BK2。本發(fā)明包括本發(fā)明的組合物用于制備藥劑的用途。在本發(fā)明中還提供了其它相關(guān)方面。以上概述不意圖限定本發(fā)明的每個(gè)方面，并且其它方面被描述于其它章節(jié)如以下詳細(xì)描述中。整個(gè)文件意圖被關(guān)聯(lián)成統(tǒng)一公開，并且應(yīng)理解的是，涵蓋本文描述的特點(diǎn)的所有組合，即使這些特點(diǎn)的組合未在本文件的同一句子或段落或章節(jié)中被一起發(fā)現(xiàn)。從以下的詳細(xì)描述中將會明了本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。然而，應(yīng)理解的是，指示本發(fā)明的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例僅是通過說明方式給出的，這是因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員從這一詳細(xì)描述中將會明了在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和變更。附圖簡述

圖1是用于制備脂質(zhì)化OspA嵌合體構(gòu)建體的示意性概述。圖2 是 IipB sOspA 1/2251 的氨基酸序列(SEQ ID NO:2) 圖3示出IipB sOspA 1/2251的核苷酸(SEQ ID NO:1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQID NO:2)。圖4 是 IipB sOspA 6/4 的氨基酸序列(SEQ ID NO:4) 圖5示出IipB sOspA 6/4的核苷酸(SEQ ID NO: 3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)。圖6 是 IipB sOspA 5/3 的氨基酸序列(SEQ ID N0:6)。圖7示出IipB sOspA 5/3的核苷酸(SEQ ID NO: 5)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ IDNO:6)。圖8描繪了優(yōu)化密碼子的使用用于高水平表達(dá)。圖9示出在脂質(zhì)化構(gòu)建體與非脂質(zhì)化構(gòu)建體之間的序列差異。圖10是T7表達(dá)系統(tǒng)的描述。圖11是示出來自誘變培養(yǎng)物和非誘變培養(yǎng)物的新型重組OspA蛋白的表達(dá)的SDS-PAGE。圖12是質(zhì)粒pUC18的圖譜。圖13是質(zhì)粒pET30a的圖譜。圖14示出用于產(chǎn)生IipB sOspA 5/3Kpn 1-Bam HI片段的策略。
圖15是凸顯IipB sOspA 1/2251中的氨基酸變化(SEQ ID NO:39)的比對和用于引入所述變化的 PCR 引物序列(SEQ ID NO:21 和 41) (IipBOspA l/2mod(SEQ ID NO:38)；共有序列(SEQ ID NO:40)) ο圖16 是 Blip OspA BPBP/A1 與被修飾的分子 IipB sOspA 1/2251 的 OspA 序列比對。上部鏈?zhǔn)窃夹蛄?SEQ ID NO:42)并且下部鏈?zhǔn)莾?yōu)化序列(SEQ ID N0:43)。注意:未示出序列起始處的三個(gè)堿基(CAT);這些堿基形成Nde I位點(diǎn)CATATG的一部分。圖17是Blip OspA KT與被修飾的分子IipB sOspA 6/4的OspA序列的比對。上部鏈?zhǔn)窃夹蛄?SEQ ID NO:44)并且下部鏈?zhǔn)莾?yōu)化序列(SEQ ID N0:45)。注意:未示出序列起始處的一個(gè)單一的堿基(C);這些堿基形成Nde I位點(diǎn)CATATG的一部分。圖18是Blip OspA 5/3與被修飾的分子IipB sOspA 5/3的OspA序列的比對。上部鏈?zhǔn)窃夹蛄?SEQ ID NO:46)并且下部鏈?zhǔn)莾?yōu)化序列(SEQ ID NO:47)。圖19示出在用狹義伯氏疏螺旋體B31菌株攻擊之前，在用3ng的OspA 1/2進(jìn)行免疫的受保護(hù)和受感染的動(dòng)物之中的抗體表面結(jié)合和生長抑制測定中的功能性抗OspA反應(yīng)的分布。曼-惠特尼(Mann-Whitney)p值證明了在受保護(hù)與受感染的動(dòng)物之間的功能性抗體含量的高度顯著的差異。圖20示出在用野生蜱蟲攻擊之前，在用3ng的OspA 1/2進(jìn)行免疫的受保護(hù)和受感染的動(dòng)物之中的抗體表面結(jié)合和生長抑制測定中的功能性抗OspA反應(yīng)的分布。曼-惠特尼P值證明了在受保護(hù)與受感染的動(dòng)物之間的功能性抗體含量的高度顯著的差異。圖21示出在用三個(gè)劑量的3-組分嵌合OspA疫苗免疫之后，池集的小鼠血清中的表面結(jié)合(平均熒光強(qiáng)度(MFI))和生長抑制(G1-50效價(jià))。檢測針對所有六種疏螺旋體屬菌株的有效的表面結(jié)合和生長抑制，所述六種疏螺旋體屬菌株表達(dá)與在疫苗中的OspA類型(I至6類型)同源的OspA類型。

圖22示出在表面結(jié)合測定(SBA)中使用來自用rOspA疫苗的組合進(jìn)行免疫的單獨(dú)小鼠的第42天的血清所獲得的平均熒光強(qiáng)度(MFI)效價(jià)。結(jié)果顯示多價(jià)疫苗中要求所有三種rOspA組分(1/2、6/4以及5/3)以便在C3H小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)針對所有六種菌株的高效價(jià)表面結(jié)合IgG抗體。2-組分疫苗無法完全覆蓋兩種缺少的菌株。圖23示出使用來自用rOspA疫苗的組合進(jìn)行免疫的單獨(dú)小鼠(10只為一組)的第42天的血清的疏螺旋體屬的生長抑制。只有多價(jià)疫苗(該疫苗包含所有三種菌株)在大于90%的動(dòng)物(n=10)中給出大于50%的生長抑制。黑色直條(實(shí)心直條)指示與使用的疫苗同源的菌株。圖24示出表達(dá)OspA的型內(nèi)變體的疏螺旋體屬的覆蓋度。表面結(jié)合分類成強(qiáng)式結(jié)合(熒光增加大于10倍)或弱式結(jié)合(熒光增加2至10倍)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供可用作抗原的嵌合OspA分子，所述嵌合OspA分子可以作為免疫原性組合物或疫苗組合物進(jìn)行遞送以用于萊姆病或疏螺旋體屬感染。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的任何實(shí)施方案之前，應(yīng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于在以下描述中闡述或附圖和實(shí)施例中說明的組分的構(gòu)建細(xì)節(jié)和安排細(xì)節(jié)。本文使用的章節(jié)標(biāo)題僅是出于組織性目的并且不應(yīng)視為是限制所描述的標(biāo)的。本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)都被以引用方式明確并入本文中。本發(fā)明包涵其它實(shí)施方案并且以各種方式來實(shí)踐或進(jìn)行。而且，應(yīng)理解的是，本文使用的措辭和術(shù)語是出于描述目的并且不應(yīng)認(rèn)為具有限制性。術(shù)語“包括”、“包含”或“具有”以及其變型意欲涵蓋其后所列的項(xiàng)目和其等效項(xiàng)目以及其它項(xiàng)目。本發(fā)明的實(shí)施方案是在編碼三種相異的脂質(zhì)化OspA分子的三種嵌合OspA編碼序列的設(shè)計(jì)和合成中進(jìn)行例證，所有三種相異的脂質(zhì)化OspA分子共有一些共同的特點(diǎn)。每個(gè)嵌合編碼序列代表兩個(gè)OspA血清型并且所述嵌合編碼序列被設(shè)計(jì)成編碼安全且高度免疫原性的穩(wěn)定的嵌合OspA分子，并且向受試者提供針對廣義伯氏疏螺旋體感染的保護(hù)。在一方面，嵌合OspA分子包含來自一個(gè)OspA血清型的近端部分連同來自另一個(gè)OspA血清型的遠(yuǎn)端部分，同時(shí)保留了兩個(gè)親本多肽的保護(hù)性質(zhì)。嵌合OspA核酸分子被表達(dá)在大腸桿菌(E.coli)中以便提供抗原，該抗原可以被配制成聯(lián)合疫苗以便提供針對與在歐洲的萊姆病或疏螺旋體屬感染相關(guān)聯(lián)的所有六種流行的血清型(血清型I至6)和針對與在北美洲的萊姆病或疏螺旋體屬感染相關(guān)聯(lián)的單一個(gè)OspA血清型的保護(hù)。由于包含血清型I至6的疫苗提供針對阿氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體以及伯氏疏螺旋體的保護(hù)，所以疫苗被設(shè)計(jì)成全球通用。本發(fā)明還包括通過去除編碼產(chǎn)生脂質(zhì)化OspA分子所需要的前導(dǎo)序列的核酸序列來制備第二組嵌合OspA編碼序列，在一方面，該組嵌合OspA編碼序列源自于第一組三種基因。需要對這兩組構(gòu)建體(產(chǎn)生脂質(zhì)化和非脂質(zhì)化多肽)進(jìn)行以下操作:評估所述構(gòu)建體在發(fā)酵罐中產(chǎn)生的難易程度(生物量、穩(wěn)定性、產(chǎn)物產(chǎn)率等)、評定不同類型的抗原可以純化的容易程度以及比較所述構(gòu)建體的生物特征(安全狀況和保護(hù)效力)。本發(fā)明包括包含本發(fā)明的嵌合OspA分子的免疫原性組合物。本發(fā)明同樣包括包含所述OspA分子的疫苗和疫苗試劑盒、用于制作免疫原性組合物和疫苗的方法以及免疫原性組合物和疫苗在人類和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)治療和預(yù)防中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步包括使用本文描述的OspA組合物來進(jìn)行免疫對抗萊姆病或疏螺旋體屬感染的方法和OspA組合物在制造用于預(yù)防萊姆病或疏螺旋體屬感染的藥劑中的用途。定義 除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。以下參考文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了在本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的通用定義:Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND M0LECULARB10L0GY (1994 第二版)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY 0FSCIENCE ANDTECHNOLOGY(1988ffalker 編);THE GLOSSARY 0FGENETICS,第五版，R.Rieger 等(編)，Springer Verlag(1991);以及 Hale&Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY (1991)。貫穿全文使用以下縮寫。AA 氨基酸Amp 安比西林bp堿基對B.afzelii阿弗西尼疏螺旋體B.burdorferi 伯氏疏螺旋體B.gar ini i伽氏疏螺旋體DNA脫氧核糖核酸
dNTPs脫氧核苷酸三磷酸E.coli大腸桿菌GC content 含有鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的序列的百分比hLFA-Ι人類白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1HPLC高效液相色譜法IP知識產(chǎn)權(quán)IPTG異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷Kan卡那霉素kDa千道爾頓LB盧里亞肉湯(Luria Broth)Lip B來自外膜蛋白B的前導(dǎo)序列Mab單克隆抗體 OD光密度OspA外膜蛋白AOspB外膜蛋白BPCR聚合酶鏈反應(yīng)RNA核糖核酸s.1.廣義s.s.狹義SDS十二燒基硫酸納SMK用于大腸桿菌的生長培養(yǎng)基(酮戊二酸山梨醇培養(yǎng)基)tRNA轉(zhuǎn)移核糖核酸WCB工作細(xì)胞庫此處應(yīng)注意，如在本說明書和隨附權(quán)利要求書中所使用，除非上下文另有明確指示，否則單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”以及“該(the) ”包括復(fù)數(shù)引用。如在此所使用，除非另外規(guī)定，否則以下術(shù)語具有賦予給它們的含義。術(shù)語“基因”是指編碼包含一個(gè)或多個(gè)多肽、蛋白或酶中的全部或部分的氨基酸序列的DNA序列，并且可以或可以不包括內(nèi)含子，和調(diào)控DNA序列，如影響例如基因表達(dá)的條件的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列、5’未翻譯區(qū)或3’未翻譯區(qū)。在本公開中，OspA基因是細(xì)菌基因并且因此不存在內(nèi)含子。術(shù)語“編碼序列”是指編碼氨基酸序列但不含有內(nèi)含子或調(diào)控序列的DNA序列。同樣地，在本公開中，OspA編碼序列不含有調(diào)控序列?！昂怂帷被颉昂怂嵝蛄小被颉昂怂岱肿印笔侵竼捂溁螂p鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。該術(shù)語涵蓋了含有已知核苷酸類似物或被修飾的骨架殘基或連接部分的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，它們具有與參考核酸相似的結(jié)合性質(zhì)，并且它們以與參考核苷酸相似的方式進(jìn)行新陳代謝。所述類似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。所述術(shù)語涵蓋了由DNA和RNA的任何已知堿基類似物形成的分子，所述堿基類似物諸如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺嘌呤、吖丙啶基-胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異-戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧唳、5-甲氧胺基-甲基-2-硫尿卩密唳、β -D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5’ -甲氧羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿卩密唳-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿卩密唳、Q核苷、2_硫基胞卩密唳、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫基胞嘧啶以及2，6- 二氨基嘌呤。除非另外指示，否則一個(gè)特定核酸序列也隱含地涵蓋其經(jīng)過保守性修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指示的序列。明確來說，在一些方面，簡并密碼子取代是通過產(chǎn)生序列來實(shí)現(xiàn)，在所述序列中一個(gè)或多個(gè)選擇的(或全部)密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等，Nucleic AcidRes.19:5081(1991);Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。術(shù)語核酸可以與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸以及多核苷酸互換使用。術(shù)語“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文中可互換使用以便指代經(jīng)由肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。所述 術(shù)語應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“蛋白”典型地是指較大多肽。術(shù)語“肽”典型地是指短多肽。合成多肽可以例如使用自動(dòng)化的多肽合成儀來進(jìn)行合成。術(shù)語“Osp A分子”或“嵌合OspA分子”在一方面是指包含SEQ IDNOil (IipBsOspA 1/2251)、SEQ ID N0:3(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID N0:5(lipB sOspA 5/3)、SEQID NO: 7 (sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:9 (s0spA6/4)、SEQ ID NO: 11 (sOspA 5/3)、SEQ IDN0:168(orig sOspA 1/2),SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID N0:172(orig sOspA5/3)的核苷酸序列的“OspA核酸”，或者在另一方面是指包含SEQ ID NO:2 (IipB sOspA1/2251)、SEQ ID N0:4(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO: 6 (IipBsOspA 5/3)、SEQ ID NO:8 (sOspA1/2251)、SEQ ID NO: 10 (sOspA 6/4)、SEQ ID NO: 12 (sOspA 5/3), SEQ ID NO: 169 (orig sOspA1/2) ,SEQ IDN0:171 (orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 173 (orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA多肽”。術(shù)語“l(fā)ipBsOspA 分子”在一方面是指包含 SEQ ID NO:1 (IipBsOspA 1/2251)、SEQID N0:3(lipB sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 5 (IipBsOspA 5/3)的核苷酸序列的“OspA 核酸”，或者在另一方面是指包含 SEQID NO: 2 (lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID N0:4(lipB sOspA 6/4)或 SEQ IDN0:6(lipB sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA 多肽”。SEQ ID N0:7、9 以及 11 的核酸序列缺少編碼IipB前導(dǎo)序列(MRLLIGFALALALIG(SEQID NO: 13)的核酸序列。此外，代替SEQ ID N0:2、4以及6中的IipB前導(dǎo)序列的羧基末端處存在的半胱氨酸殘基，SEQ IDN0:7、9以及11的核酸序列對在SEQ ID N0:8、10以及12的氨基末端處的甲硫氨酸殘基進(jìn)行編碼。術(shù)語“orig sOspA分子”或“原始sOspA分子”在一方面是指包含SEQ IDNO:168(orig sOspA 1/2),SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:172(orig sOspA5/3)的核苷酸序列的“OspA核酸”，或者在另一方面是指包含SEQ ID NO: 169 (orig sOspA1/2)、SEQ ID NO: 171 (orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 173 (orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA多肽”。這些“原始”分子是不具有突變并且不具有密碼子優(yōu)化的嵌合構(gòu)建體。本發(fā)明包括“脂質(zhì)化OspA”和“非脂質(zhì)化OspA”嵌合分子。在各個(gè)方面，脂質(zhì)化將佐劑性質(zhì)賦予OspA。在本發(fā)明的一些方面,脂質(zhì)化OspA分子包含OspB前導(dǎo)序列。在本發(fā)明的一些方面，所述OspB前導(dǎo)序列包含氨基酸MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO: 13)。在其它方面，OspB前導(dǎo)序列包含其它氨基酸。如在本領(lǐng)域中已知的術(shù)語“一致的”或“同一性”百分比是指兩個(gè)或更多個(gè)多肽分子或者兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子的序列之間的如通過比較這些序列來確定的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”也意指核酸分子或多肽之間的序列相關(guān)性的程度，所述程度看情形而定，如通過兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列或者兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的鏈條之間的匹配度來確定。通過特定的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序( 即，“算法”)來解決，“同一性”測量間隙對準(zhǔn)(如果有的話)的兩個(gè)或更多個(gè)較小序列之間的一致匹配的百分比?！按笾峦恍浴笔侵感蛄信c指定序列具有至少約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約 81%、約 82%、約 83%、約 84%、約 85%、約 86%、約 87%、約 88%、約 89%、約 90%、約 91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列同一性。在一些方面，同一性存在于長度至少約為50至100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域中。在其它方面，同一性存在于長度至少約為100至200個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域中。在其它方面，同一性存在于長度至少約為200至500個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域中。在某些方面，序列同一性百分比是使用選自由以下組成的組的計(jì)算機(jī)程序來確定:GAP、BLASTP, BLASTN、FASTA, BLASTA, BLASTX,BestFit 以及 Smith-Waterman 算法。還應(yīng)明確理解的是，本文引用的任何數(shù)值包括從下限值至上限值的所有值，S卩，在本申請中認(rèn)為明確陳述了在已列舉的最低值與最高值之間的數(shù)值的所有可能的組合。例如，如果濃度范圍被陳述為約1%至50%，那么意圖在本申請中明確列舉一些值如2%至40%、10%至30%或1%至3%等。上文列出的值僅是明確意圖的值的實(shí)例。在各個(gè)方面，范圍在本文中被表達(dá)為從“約”或“近似” 一個(gè)特定值和/或至“約”或“近似”另一個(gè)特定值。在通過使用先行詞“約”將值表達(dá)為近似值時(shí)，應(yīng)理解的是，一些變化量被包括在所述范圍內(nèi)。術(shù)語“相似性”是相關(guān)的概念，但與“同一性”相比是指包括一致匹配和保守性取代匹配的相似性的量度。如果兩個(gè)多肽序列例如具有10/20的一致的氨基酸并且剩余部分是所有的非保守性取代，那么同一性百分比和相似性百分比將都是50%。在同一實(shí)施例中，如果存在其中存在保守性取代的多余的五個(gè)位置，那么同一性百分比仍然是50%，但相似性百分比將是75%(15/20)。因此，在存在保守性取代的情況下，兩個(gè)多肽之間的相似性百分比的程度將大于在那兩個(gè)多肽之間的同一性百分比。術(shù)語“分離的核酸分子”是指本發(fā)明的核酸分子，(I)所述核酸分子已從當(dāng)從源細(xì)胞分離總DNA時(shí)，可天然地被一起發(fā)現(xiàn)的蛋白、脂類、碳水化合物或其它材料分離成任何程度；(2)所述核酸分子未連接至所述“分離的核酸分子”天然連接的多核苷酸的全部或一部分；(3)所述核酸分子被操作地連接至它天然并不連接的多核苷酸；或者(4)所述核酸分子并不是天然存在作為較大多核苷酸序列的一部分。如本文使用的大致地不含指示核酸分子不含在它的自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的任何其它污染性核酸分子或其它污染物，所述污染性核酸分子或其它污染物會干擾所述核酸分子在多肽產(chǎn)生中的用途或所述核酸分子的治療、診斷、預(yù)防或研究用途。術(shù)語“分離的多肽”是指本發(fā)明的多肽，⑴所述多肽已從當(dāng)它從源細(xì)胞分離時(shí)，可天然地被一起發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、脂類、碳水化合物或其它材料分離成任何程度；(2)所述多肽未連接(通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用)至所述“分離的多肽”天然連接的多肽的全部或一部分；(3)所述多肽被操作地連接(通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用)至它天然并不連接的多肽；或者(4)所述多肽天然并不存在。在一方面，分離的多肽大致上不含在它的自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的任何其它污染性多肽或其它污染物，所述污染性多肽或其它污染物會干擾所述多肽的治療、診斷、預(yù)防或研究用途。如本文使用的多肽的“片段”是指多肽的小于全長多肽或蛋白表達(dá)產(chǎn)物的任何部分。片段典型地是全長多肽的缺失類似物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已從全長多肽的氨基末端和/或羧基末端去除。因此，“片段”是下文描述的缺失類似物的子集。如本文使用的“類似物”是指在結(jié)構(gòu)上大致相似并且具有相同的生物活性的多肽，盡管在某些情況下在不同程度上，是指天然存在的分子。基于一種或多種突變，與衍生類似物的天然存在的多肽相比，類似物在它們的氨基酸序列的組成上是不同的，所述一種或多種突變包括(i)在多肽(包括如上文描述的片段)的一個(gè)或多個(gè)末端處和/或天然存在的多肽序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部區(qū)域處缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；(ii)在多肽的一個(gè)或多個(gè)末端(典型是“添加”類似物)處和/或天然存在的多肽序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部區(qū)域(典型是“插入”類似物)處插入或添 加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或者(iii)用一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代天然存在的多肽序列中的其它氨基酸。取代基于被替換的氨基酸和替換它的氨基酸的物理化學(xué)相關(guān)性或功能性相關(guān)性是保守性的或非保守性的。“保守性修飾的類似物”應(yīng)用于氨基酸序列與核酸序列。對于特定的核酸序列來說，保守性修飾的核酸是指編碼一致的或基本上一致的氨基酸序列或其中核酸未將氨基酸序列編碼成基本上一致的序列的那些核酸。大量功能上一致的核酸由于遺傳密碼的簡并性而對任何給出的蛋白進(jìn)行編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG以及GCU都對氨基酸丙氨酸進(jìn)行編碼。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每個(gè)位置處，在不改變被編碼的多肽的情況下可以將密碼子改變?yōu)槊枋龅娜魏蜗鄳?yīng)的密碼子。所述核酸變異是“沉默變異”，是保守性修飾的類似物的一個(gè)種類。在本文中編碼多肽的每個(gè)核酸序列也描述了核酸的每個(gè)可能的沉默變異。技術(shù)人員將認(rèn)識到在核酸(除了通常為甲硫氨酸僅有的密碼子的AUG和通常為色氨酸僅有的密碼子的TGG)中的每個(gè)密碼子都可以被修飾以便產(chǎn)生功能上一致的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個(gè)沉默變異均暗含于每個(gè)描述的序列中。至于氨基酸序列，技術(shù)人員將認(rèn)識到在被編碼的序列中改變、添加或缺失單一個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的針對核酸、肽、多肽或蛋白序列的單獨(dú)取代、插入、缺失、添加或截短是“保守性修飾的類似物”，其中改變造成氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表在本領(lǐng)域中是熟知的。除了這類經(jīng)過保守性修飾的變體之外，不排除本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源物以及等位基因。以下八個(gè)組各自含有互為彼此的保守性取代的氨基酸:I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見,例如 Creighton, Proteins (1984))。如本文使用的“變體”是指包含至少一個(gè)氨基酸取代、缺失、插入或修飾的多肽、蛋白或其類似物，前提是所述變體保留了天然多肽的生物活性。如本文使用的“等位基因變體”是指占據(jù)同一基因座的基因的兩個(gè)或更多個(gè)多態(tài)形式中的任何一種。等位基因變異通過突變而天然出現(xiàn)，并且在一些方面導(dǎo)致群體中的表型多態(tài)。在某些方面，基因突變是沉默的(經(jīng)過編碼的多肽中無變化)或者在其它方面，對具有改變的氨基酸序列的多肽進(jìn)行編碼?！暗任换蜃凅w”也是指源自于遺傳等位基因變體的mRNA轉(zhuǎn)錄本的cDNA以及由cDNA編碼的蛋白。術(shù)語“衍生物”是指通過偶聯(lián)到治療劑或診斷劑、標(biāo)記(例如，用放射性核素或各種酶)、共價(jià)聚合物附接如PEG化(用聚乙二醇衍生化)以及通過非天然氨基酸的化學(xué)合成而進(jìn)行的插入或取代來進(jìn)行共價(jià)修飾的多肽。在一些方面，衍生物被修飾以便包含正常情況下不是分子的一部分的其它化學(xué)部分。在各個(gè)方面，所述部分調(diào)節(jié)分子的溶解性、吸收和/或生物半衰期。在其它各個(gè)方面，所述部分可選地降低了分子的毒性并且消除或弱化分子的任何不合意的副作用等。雷明頓藥物科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(1980)中公開了能夠介導(dǎo)所述作用的部分。將所述部分連接至分子的程序在本領(lǐng)域中是熟知的。例如，在一些方面，OspA衍生物是具有賦予所述蛋白較長體內(nèi)半衰期的化學(xué)修飾的OspA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是通過添加本領(lǐng)域中已知的水溶性聚合物來進(jìn)行修飾。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，多肽是通過糖基化、PEG化和/或多唾液酸化來進(jìn)行修飾。在參考例如細(xì)胞或核酸、蛋白或載體來一起使用時(shí)，術(shù)語“重組”指示細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過引入異源核酸或蛋白或者改變天然核酸或蛋白來進(jìn)行修飾，或者指示細(xì)胞源自于經(jīng)過如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞的天然(非重組)形式中未發(fā)現(xiàn)的基因或者表達(dá)以其它形式異常表達(dá)、表達(dá)不充分或完全未表達(dá)的天然基因。如本文使用的“可選標(biāo)記”是指編碼賦予細(xì)胞或有機(jī)體的酶或其它蛋白的基因，在所述細(xì)胞或有機(jī)體中，所述基因表達(dá)為可鑒定的表型變化如對藥物、抗生素或其它試劑的抗性，這樣使得標(biāo)記的表達(dá)或活性被選擇用于(例如但不限于陽性標(biāo)記如neo基因)或?qū)?例如并且不限于陰性標(biāo)記如白喉基因)?！爱愒纯蛇x標(biāo)記”是指已被插入動(dòng)物的基因組的可選標(biāo)記基因，在所述動(dòng)物中通常無法發(fā)現(xiàn)所述可選標(biāo)記基因?？蛇x標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于抗生素抗性基因如新霉素(neo)、嘌呤霉素(Puro)、白喉毒素、磷酸轉(zhuǎn)移酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核酸基轉(zhuǎn)移酶、第一型單純皰疹病毒胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶以及次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthinephosphoribosy I transferase)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解本領(lǐng)域已知的任何可選標(biāo)記都可用于本文描述的方法中。在參考核酸部分一起使用時(shí)，術(shù)語“異源”指示核酸包含彼此在性質(zhì)上未找出相同關(guān)系的兩個(gè)或更多個(gè)子序列。例如，核酸典型地是進(jìn)行重組來產(chǎn)生，從而使來自不相關(guān)基因的兩個(gè)或更多個(gè)序列被安排，以便制作新的功能性核酸，例如，來自一個(gè)來源的啟動(dòng)子和來自另一個(gè)來源的編碼區(qū)。相似地，異源蛋白指示蛋白包含彼此在性質(zhì)上未找出相同關(guān)系的兩個(gè)或更多個(gè)子序列(例如，融合蛋白)。如本文使用的術(shù)語“同源”是指擁有“共同的進(jìn)化起源”的蛋白之間的關(guān)系，所述蛋白包括來自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白和來自不同物種(例如，肌球蛋白輕鏈等)的同源蛋白(Reeck等，Cell50:667，1987)。所述蛋白(和它們的編碼基因)具有如通過它們的序列相似性來反映的序列同源性，所述序列相似性是就在相似性百分比而論，或是就在保守位置處特定殘基或基元的存在而論。進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對，最佳比對是例如但不限于通過Smith等，Adv.Appl.Math.2:482，1981 的局部同源性算法；通過 Needleman 等，J.Mol.Biol.48:443，1970的同源性比對算法；通過Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444, 1988的相似性搜索方法；通過這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(威斯康星洲麥迪遜(Madison, WI)的575ScienceDr.的 Genetics Computer Group 的 Wisconsin 遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)或者通過目測檢查(通常參見上文的Ausubel等)。適于確定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的另一個(gè)實(shí)例是BLAST算法，該算法被描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410, 1990中。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information)公開獲得。除計(jì)算出序列同一'I"生百分比之外，BLAST算法還進(jìn)行在兩個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)分析(參見，例如Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787， 1993)。術(shù)語“載體”用于指用來將編碼信息轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的任何分子(例如，核酸、質(zhì)?；虿《??！翱寺≥d體”是其中可以插入外來DNA片段的一小片DNA。將片段插入克隆載體是通過用同一限制酶來處理運(yùn)載物和外來DNA，然后將片段連接在一起來進(jìn)行。存在許多類型的克隆載體并且所有類型的 克隆載體都用于本發(fā)明中。遺傳工程改造的質(zhì)粒和細(xì)菌噬菌體(如，噬菌體λ)可能最常用于這一目的。其它類型的克隆載體包括細(xì)菌人工染色體(BAC)和酵母菌人工染色體(YAC)?！氨磉_(dá)載體”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體具有允許特定的核酸在宿主細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的一系列指定的核酸元件。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。在某些方面，表達(dá)載體包括待被轉(zhuǎn)錄操作地連接至啟動(dòng)子的核酸。術(shù)語“編碼序列”在本文中被定義為轉(zhuǎn)錄成mRNA的核酸序列，所述mRNA在處于適當(dāng)?shù)目刂菩蛄械目刂葡聲r(shí)被翻譯成多肽。編碼序列的邊界總體上是由通常為mRNA的5'末端處的開放讀碼框的起點(diǎn)的ATG起始密碼子和恰好位于mRNA的3'末端處的開放讀碼框的下游的轉(zhuǎn)錄終止序列來確定。編碼序列可以包括但不限于基因組DNA序列，cDNA序列，半合成序列、合成序列以及重組的核酸序列。在一方面，啟動(dòng)子DNA序列被定義為位于與其相關(guān)的編碼序列的上游的DNA序列并且能夠控制這一編碼序列的表達(dá)?！皢?dòng)子”被定義為指引核酸轉(zhuǎn)錄的一系列核酸控制序列。如本文使用的啟動(dòng)子包括在轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)附近的必要的核酸序列，如在聚合酶II類型啟動(dòng)子情況下的TATA元件。啟動(dòng)子還任選地包括可以位于距離轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)多達(dá)數(shù)千堿基對處的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻遏元件?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下呈活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)情況下呈活性的啟動(dòng)子。術(shù)語“操作地連接”是指在核酸表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子或一系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))與第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列指引對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是用于指通常通過噬菌體將核酸從一種細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)”還指通過逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得并且轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞序列。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是用于指通過細(xì)胞攝取外來或外源DNA，并且細(xì)胞在外源DNA已被引入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)已經(jīng)被“轉(zhuǎn)染”。本領(lǐng)域中熟知并且在本文中公開了許多轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如 Graham 等，Virology,52:456 (1973) ;Sambrook 等，Molecular Cloning, a LaboratoryManual, ColdSpring Harbor Laboratories, New York, (1989) ;Davis 等，Basic MethodsinMolecular Biology, Elsevier, (1986);以及 Chu 等，Gene, 13:197 (1981)。所述技術(shù)可以用來將一個(gè)或多個(gè)外源DNA部分引入適合的宿主細(xì)胞。如在此使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指細(xì)胞遺傳特征的改變，并且細(xì)胞在經(jīng)過修飾而含有新的DNA時(shí)已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。例如，在細(xì)胞從它的天然狀態(tài)進(jìn)行遺傳修飾時(shí)，所述細(xì)胞已被轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，轉(zhuǎn)化DNA可以通過物理地并入細(xì)胞的染色體來與細(xì)胞的DNA重組。在一些情況下，DNA被短暫地維持為游離元件而不被復(fù)制，或者它獨(dú)立地復(fù)制為質(zhì)粒。在DNA隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制時(shí)，認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。術(shù)語“內(nèi)源的”是指在宿主有機(jī)體內(nèi)天然地表達(dá)或起源于細(xì)胞、組織或有機(jī)體內(nèi)的多肽或多核苷酸或其它化合物?！巴庠吹摹笔侵钙鹪从诩?xì)胞、組織或有機(jī)體之外的多肽、多核苷酸或其它化合物。術(shù)語“試劑”或“化合物”描述具有影響本發(fā)明中的生物學(xué)參數(shù)的能力的任何分子，例如，蛋白或藥物。如本文使用的“對照”可以是指活性、陽性、陰性或媒介物對照。如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，對照是用來建立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性并且為測試條件提供比較。在提及萊姆或萊姆病的癥狀時(shí)，術(shù)語“降低嚴(yán)重程度”意指癥狀具有延遲的發(fā)作，降低的嚴(yán)重程度或?qū)κ茉囌弋a(chǎn)生較小損害。通常來說，將癥狀的嚴(yán)重程度與例如未接受活性預(yù)防性或治療性組合物的對照相比較。在所述情況下，與癥狀的對照水平相比，如果所述癥狀被降低了 10%、25%、30%、50%、80%或100%(即，實(shí)質(zhì)上消除)，那么則說組合物可以降低萊姆癥狀的嚴(yán)重程度。術(shù)語“抗原”是指能夠由選擇性結(jié)合劑如抗體來結(jié)合并且另外能夠用于受試者以便產(chǎn)生能夠接合到每個(gè)抗原的表位的抗體的分子或分子的一部分。在各個(gè)方面，抗原具有一個(gè)或多個(gè)表位。術(shù)語“抗體”是指具有針對OspA多肽的特異性的一個(gè)或多個(gè)分子。如在此使用的術(shù)語“特異的”、“特異性”以及“特異地結(jié)合”是指抗體接合到OspA多肽和不結(jié)合到非OspA多肽的能力。在某些方面，抗體是“中和抗體”，其中抗體與感染劑發(fā)生反應(yīng)并且破壞或抑制它的感染性或毒力。本發(fā)明包 括包含“中和”疏螺旋體屬的抗體的免疫原性組合物。如在此使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”或“生理學(xué)上可接受的載體”是指適于實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)作為藥用組合物的OspA多肽、OspA核酸分子或OspA抗體的遞送的一種或多種配制材料。術(shù)語“穩(wěn)定劑”是指保護(hù)疫苗的免疫原性組合物不受不利條件(如在加熱或冷凍期間產(chǎn)生的那些條件)的影響和/或延長免疫原性組合物在穩(wěn)定和免疫原性的條件或狀態(tài)下的穩(wěn)定性或保質(zhì)期的物質(zhì)或疫苗賦形劑。穩(wěn)定劑的實(shí)例包括但不限于糖類，如蔗糖、乳糖以及甘露糖；糖醇如甘露醇(manitol);氨基酸如甘氨酸或谷氨酸；以及蛋白如人血清清蛋白，或明膠。術(shù)語“抗菌性防腐劑”是指被添加至免疫原性組合物或疫苗的任何物質(zhì)，所述物質(zhì)抑制在反復(fù)刺穿多劑量小瓶(如果使用所述容器)時(shí)可能引入的微生物的生長。抗菌性防腐劑的實(shí)例包括但不限于如硫柳汞、2-苯氧基乙醇、芐索氯銨以及苯酚的物質(zhì)。術(shù)語“免疫原性組合物”是指包含抗原(產(chǎn)生針對它的抗原特異性抗體)(例如，嵌合OspA分子)、刺激受試者宿主的免疫反應(yīng)的佐劑以及適合的免疫惰性的藥學(xué)上可接受的載體的組合物。任選地，免疫原性組合物包含一種或多種穩(wěn)定劑。任選地，免疫原性組合物包含一種或多種抗菌性防腐劑。術(shù)語“疫苗”或“疫苗組合物”是指改善對特定疾病(例如，萊姆病或疏螺旋體屬感染)的免疫性的生物制劑。疫苗典型地含有與引起疾病的微生物類似的試劑(例如，疏螺旋體屬的嵌合OspA分子(抗原))。所述試劑刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)來將所述試劑識別為外來物，破壞所述試劑并且“記住”所述試劑，這樣使得免疫系統(tǒng)可以更容易地識別并且破壞它后來碰到的這些微生物中的任何微生物。在各個(gè)方面，疫苗是預(yù)防性的(預(yù)防或改變通過任何天然或“野生”病原體引起的未來感染的作用)或治療性的(針對本感染的疫苗)。如上文所闡述,所述疫苗組合物包括包含藥學(xué)上可接受的載體的制劑。任選地,疫苗還包含一種或多種穩(wěn)定劑和/或一種或多種抗菌性防腐劑。術(shù)語“有效量”和“治療有效量”各自是指用于支持如本文所闡述的OspA多肽的一種或多種生物活性的可觀察水平的核酸分子、多肽、組合物或抗體的量。例如，在本發(fā)明的一些方面，有效量將是預(yù)防、中和或降低疏螺旋體屬感染所必要的量。術(shù)語“組合”是指本發(fā)明的兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子或本發(fā)明的兩個(gè)或更多個(gè)多肽。在一些方面，施用本發(fā)明的分子的組合來提供免疫力或抵抗來自本文描述的疏螺旋體屬的六種血清型(I至6)中的至少四種血清型的感染。在各個(gè)方面，使用了本發(fā)明的兩個(gè)或三個(gè)分子或多肽的組合。在某些方面，向受試者施用本發(fā)明的分子的組合來提供針對來自本文描述的疏螺旋體屬的所有六種血清型(I至6)的免疫性。后一種組合已顯示出提供針對表達(dá)核酸分子或多肽的組合中不存在的OspA類型的疏螺旋體屬的異源菌株的免疫性。術(shù)語“聯(lián)合疫苗”是指含有針對一種或多種疾病的一種以上疫苗組合物或一種以上保護(hù)性抗原的疫苗制劑。除了針對一種或多種其它疾病的抗原之外，本發(fā)明還包括包含針對萊姆病或疏螺旋體屬的OspA嵌合抗原的聯(lián)合疫苗。在各個(gè)方面,一種或多種其它疾病是蜱傳疾病。在某些方面，其 它蜱傳疾病是落基山斑疹熱、巴貝斯蟲病、回歸熱、科羅拉多蜱熱、人單核細(xì)胞埃立克體病(HME)、人粒細(xì)胞埃立克體病(HGE)、南方蜱叮咬相關(guān)的皮疹疾病(STARI)、兔熱病、蜱癱瘓、波瓦桑腦炎、寇熱病、克里米亞剛果出血熱、胞裂蟲病、南歐斑疹熱或蜱傳腦炎。在特定方面，本發(fā)明包括包含一種或多種疫苗的聯(lián)合疫苗，所述一種或多種疫苗包括蜱傳腦炎疫苗、日本腦炎疫苗以及落基山斑疹熱疫苗。在一些方面，聯(lián)合疫苗包含具有與針對疏螺旋體屬感染或萊姆病的免疫相容的季節(jié)性免疫程序的疫苗組合物。在更特定的方面，聯(lián)合疫苗可用于預(yù)防多種疾病，用于這些疾病流行的地理位置。術(shù)語“疏螺旋體屬”是指疏螺旋體屬的螺旋體類的革蘭氏陰性細(xì)菌的一個(gè)種類。在一個(gè)方面，“廣義伯氏疏螺旋體”是指較寬意義上的伯氏疏螺旋體。萊姆病或疏螺旋體病的幾乎所有病例都是由三個(gè)同基因型種阿氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體以及狹義伯氏疏螺旋體(其是指狹義上的伯氏疏螺旋體)中的一個(gè)引起的。疏螺旋體屬的OspA血清型與種類相關(guān)聯(lián)；血清型I對應(yīng)于狹義伯氏疏螺旋體，血清型2對應(yīng)于阿氏疏螺旋體并且血清型3至7對應(yīng)于伽氏疏螺旋體。在各個(gè)方面，本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物還提供了針對其它種類的疏螺旋體屬的保護(hù)作用，所述其它種類的疏螺旋體屬包括但不限于日本疏螺旋體、安德森疏螺旋體、比塞蒂疏螺旋體、西尼伽疏螺旋體、土德疏螺旋體、塔盧基疏螺旋體、法雷斯疏螺旋體、盧西塔尼疏螺旋體、斯柏曼疏螺旋體、宮本疏螺旋體或孤星疏螺旋體?！笆茉囌摺北唤o予了非植物、非原生生物的生物的常規(guī)含義。在大多數(shù)方面，受試者是動(dòng)物。在特定方面，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在更特定方面，哺乳動(dòng)物是人類。在其它方面，哺乳動(dòng)物是寵物或伴侶動(dòng)物、馴養(yǎng)家畜或動(dòng)物園動(dòng)物。在某些方面，哺乳動(dòng)物是貓、狗、馬或牛。在其它各個(gè)方面，哺乳動(dòng)物是鹿、小鼠、花栗鼠、松鼠、負(fù)鼠或浣熊。萊姆病(疏螺旋體病或萊姆疏螺旋體病)在一些方面，本發(fā)明包括嵌合OspA分子和包含這些分子的組合物以預(yù)防萊姆病或疏螺旋體屬感染。萊姆病在本領(lǐng)域中又稱為疏螺旋體病或萊姆疏螺旋體病，因此，所有這些術(shù)語都包括在本發(fā)明內(nèi)。同樣地，本發(fā)明包括預(yù)防或治療萊姆病的方法，所述方法包括施用本文描述的嵌合OspA分子。萊姆病或疏螺旋體病是由屬于疏螺旋體屬的至少三種革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染性疾病。存在已發(fā)現(xiàn)的至少13種疏螺旋體屬種類，已知其中三種是與萊姆病相關(guān)的。引起萊姆病的疏螺旋體屬種類被統(tǒng)稱為廣義伯氏疏螺旋體，并且顯示大量基因多樣性。廣義伯氏疏螺 旋體組是由可能造成絕大多數(shù)的病例的三個(gè)緊密相關(guān)的種類構(gòu)成。狹義伯氏疏螺旋體是美國萊姆病(但所述萊姆病還存在于歐洲)的主要病因，而阿氏疏螺旋體和伽氏疏螺旋體引起了歐洲的大多數(shù)病例。一些研究還提出疏螺旋體屬種類(例如，比塞蒂疏螺旋體、斯柏曼疏螺旋體、盧西塔尼疏螺旋體以及法雷斯疏螺旋體)有時(shí)可能會感染人類。雖然這些種類看起來似乎不是疾病的重要病因，但針對這些種類的免疫保護(hù)也被包括在本發(fā)明內(nèi)。萊姆病是北半球最常見的蝶傳疾病。所述疾病是以康乃狄格州(Connecticut)的村莊萊姆來命名的，在1975年在所述村莊中鑒定出許多病例。疏螺旋體屬通過屬于硬蜱屬(“硬蜱”)的一些種類的受感染的蜱蟲的叮咬傳播到人類。在一些情況下，早期癥狀包括發(fā)熱、頭痛、疲勞、抑郁以及稱為游走性紅斑的特征性圓形皮膚紅疹。如果不治療，那么稍后的癥狀經(jīng)?？梢陨婕瓣P(guān)節(jié)、心臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在大多數(shù)情況下，感染和其癥狀可通過抗生素(尤其是疾患早期治療時(shí))來消除。然而，過晚、延遲或不充分的治療可以導(dǎo)致更嚴(yán)重的癥狀，所述癥狀可能致殘并且難以治療。癥狀如在感染之后持續(xù)的關(guān)節(jié)炎有時(shí)通過抗生素來消除。一些團(tuán)體辯稱，“慢性”萊姆病造成在識別出的晚期萊姆病的癥狀之外的一系列醫(yī)學(xué)上無法解釋的癥狀，并且需要另外的長期抗生素治療。然而，長期治療是備受爭議的并且關(guān)于所述治療的爭論已產(chǎn)生了針對治療指南的立法行動(dòng)。
萊姆病被分類成動(dòng)物傳染病，這是因?yàn)槿R姆病是通過蜱蟲從包括嚙齒動(dòng)物和鳥類的天然儲存宿主傳播到人類，而所述蜱蟲是以嚙齒動(dòng)物和鳥類這兩組宿主為生。硬蜱屬的硬體蜱蟲是萊姆病的主要載體。大多數(shù)的人類感染是由處于幼蟲階段的蜱蟲引起的，這是因?yàn)轵缦x幼蟲十分之小并且可能進(jìn)食很長一段時(shí)間，而不被檢測到。蜱蟲叮咬因處于幼蟲階段的蜱蟲的較小體型以及防止宿主感覺到因叮咬而產(chǎn)生的任何瘙癢或疼痛的蜱蟲分泌物而經(jīng)常不被察覺。萊姆病基于癥狀、客觀身體上的發(fā)現(xiàn)(如游走性紅斑、面神經(jīng)麻痹或關(guān)節(jié)炎)、可能暴露于受感染的蜱蟲的經(jīng)歷以及血清學(xué)血液測試而進(jìn)行臨床診斷。接近一半的萊姆病患者將發(fā)展成特征性靶心狀紅疹，但許多患者可能都不會聯(lián)想到蜱蟲叮咬。對于沒有萊姆病癥狀的人來說，不推薦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室測試。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室中很難培養(yǎng)疏螺旋體屬細(xì)菌，所以萊姆病的診斷典型地是基于臨床檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)果和暴露于地方性萊姆區(qū)的經(jīng)歷。認(rèn)為僅出現(xiàn)在所有病例的約50%中的游走性紅斑(EM)紅疹就足以確立萊姆病的診斷，即便是在血清學(xué)血液測試是陰性的情況下。血清學(xué)測試可以用于支持臨床上疑似的病例但其自身并沒有診斷性。晚期萊姆病的診斷經(jīng)常因可能模仿許多其它疾病的癥狀的多方面表現(xiàn)而變得困難。為此原因，評論家將萊姆稱為新的“偉大模仿者”。在一些情況下，萊姆病被誤診為多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、慢性疲乏綜合征(CFS)、狼瘡或其它自體免疫和神經(jīng)變性疾病。因此，本領(lǐng)域中對預(yù)防或治療萊姆病的疫苗存在很大的需求。疏螺旋體屬的外膜蛋白A (OspA)在各個(gè)方面，本發(fā)明包括疏螺旋體屬的嵌合OspA分子和包含這些分子的組合物以預(yù)防和治療萊姆病或疏螺旋體屬感染。在過去十年中已鑒定了數(shù)種疏螺旋體屬外膜蛋白，所述外膜蛋白在這種螺旋體被從蜱蟲傳播到哺乳動(dòng)物時(shí)通過體溫和/或哺乳動(dòng)物的宿主特異性信號來進(jìn)行上調(diào)。伯氏疏螺旋體的 主要外膜蛋白OspA因它作為疫苗候選物潛力而成為特別受關(guān)注的脂蛋白。來自疏螺旋體屬的歐洲和北美洲菌株的OspA的血清型和基因分析已證明了抗原異質(zhì)性和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。OspA被描述于已公布的PCT專利申請WO 92/14488、Jiang等(Clin.Diagn.Lab.1mmunol.1:406-12，1994)中并且在本領(lǐng)域中是已知的。在小鼠、倉鼠以及狗的攻擊研究中已顯示Osp A誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。人類的臨床試驗(yàn)已顯示OspA的制劑在人體中是安全的并且具有免疫原性(Keller等，JAMA (1994) 271:17641768)。雖然OspA表達(dá)在來自北美洲的伯氏疏螺旋體的絕大多數(shù)臨床分離物中，但從歐洲的臨床疏螺旋體屬分離物的檢查中出現(xiàn)了不同的景象。在歐洲，萊姆病主要是由疏螺旋體屬的三種同基因型種，即伯氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體以及阿氏疏螺旋體引起的。本發(fā)明涉及提供針對疏螺旋體屬的所有同基因型種的保護(hù)性免疫的嵌合OspA分子。本發(fā)明描述了編碼共有共同特點(diǎn)的三種相異的脂質(zhì)化OspA分子的三種嵌合OspA基因的設(shè)計(jì)和合成。每個(gè)基因代表兩個(gè)OspA血清型并且這些基因被設(shè)計(jì)成編碼安全且高度免疫原性，并且向受試者提供針對廣義伯氏疏螺旋體感染的保護(hù)的穩(wěn)定的OspA分子。本發(fā)明還描述了不具有突變和不具有密碼子優(yōu)化的三種原始嵌合OspA基因，所述基因編碼共有共同特點(diǎn)的三種相異的脂質(zhì)化OspA分子。每個(gè)基因代表兩個(gè)OspA血清型并且編碼向受試者提供針對廣義伯氏疏螺旋體感染的保護(hù)的分子。
已識別出歐洲分離物之中的七個(gè)主要的OspA血清型(指示為血清型I至7，Wilske 等,J.Clin.Microbiol.31:340-50，1993)。OspA 血清型與種類相關(guān)聯(lián)；血清型 I 對應(yīng)于狹義伯氏疏螺旋體，血清型2對應(yīng)于阿氏疏螺旋體并且血清型3至7對應(yīng)于伽氏疏螺旋體。歐洲疏螺旋體屬分離物的流行病學(xué)研究指示基于OspA類型1、2、3、4、5以及6的疫苗在歐洲將提供98.1%的萊姆病的理論覆蓋率并且覆蓋96.7%的侵襲性疾病分離物。本發(fā)明提供可以提供針對所有六種血清型I至6的保護(hù)性免疫的六種嵌合OspA核酸分子(SEQ IDN0:l、3以及5和SEQ IDN0:168、170以及172)和六種嵌合OspA多肽分子(SEQ ID N0:2、4以及6和SEQ ID N0:169、171以及173)。六種合成OspA基因被設(shè)計(jì)成編碼OspA分子，所述OspA分子具有來自以下的保護(hù)性表位:0spA血清型I和2 (lipB sOspA 1/2251 (SEQID NO:1 (核酸)和 2(氨基酸))和 orig sOspA 1/2 (SEQ ID NO: 168 (核酸)和 169 (氨基酸)));0spA 血清型 6 和 4(lipB sOspA 6/4(SEQ ID NO:3 (核酸)和 4(氨基酸))和 origs0spA6/4 (SEQ ID NO: 170 (核酸)和 171 (氨基酸)));以及 OspA 血清型 5 和 3 (lipB sOspA5/3 (SEQ ID NO: 5 (核酸)和 6(氨基酸))和 orig sOspA 5/3 (SEQ ID NO: 172 (核酸)和173(氨基酸)))。嵌合OspA基因是使用合成的重疊寡核苷酸來制作的。在某些方面，以高產(chǎn)率和純度產(chǎn)生這些重組蛋白，并且在各個(gè)方面，可操縱所述重組蛋白來最大化合意的活性并最小化不合意的活性。嵌合OspA核 酸分子和多肽分子在各個(gè)方面，本發(fā)明包括疏螺旋體屬的嵌合OspA核酸和多肽分子。本發(fā)明的OspA核酸包括核酸分子，所述核酸分子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成JnSEQ IDNO:1 (lipB sOspA 1/2251)、SEQID N0:3(lipB sOspA 6/4) ,SEQ ID N0:5(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO: 7 (sOspA 1/2251)、SEQ ID NO: 9 (sOspA 6/4)、SEQ ID NO: 11 (s0spA5/3)、SEQID NO:168(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO:172 (origsOspA 5/3)中闡述的核苷酸序列或如 SEQ IDN0:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID N0:4(lipBsOspA 6/4)、SEQ ID N0:6(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO: 8 (sOspA 1/2251)、SEQ IDN0:10(s0spA6/4)、SEQ ID NO: 12 (sOspA 5/3)、SEQ ID NO: 169 (orig sOspA 1/2)、SEQ IDNO: 171 (orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO: 173 (orig sOspA 5/3)中闡述的編碼多肽的核苷酸序列。SEQ ID N0:7、9以及11的核酸序列缺少編碼IipB前導(dǎo)序列(MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO: 13)的核酸序列。此外，代替在SEQID N0:2、4以及6中的IipB前導(dǎo)序列的羧基末端處存在的半胱氨酸殘基，SEQ ID N0:7、9以及11的核酸序列對在SEQ ID N0:8、10以及12的氨基末端處的甲硫氨酸殘基進(jìn)行編碼。SEQ ID N0:l、3以及5是IipB sOspA多核苷酸，并且SEQ ID NO:2、4以及6是IipB sOspA多肽。在一些方面，本發(fā)明包括不具有突變并且不具有密碼子優(yōu)化的疏螺旋體屬的原始(“orig”)嵌合OspA核酸分子和多肽分子。因此，本發(fā)明的OspA核酸包括核酸分子，所述核酸分子包含以下，基本上由以下組成或由以下組成:如SEQ ID NO: 168 (orig sOspA1/2)、SEQ ID NO: 170 (orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 172 (orig sOspA 5/3)中闡述的核苷酸序列或如 SEQ ID NO: 169 (orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO: 171 (origsOspA 6/4)或 SEQID NO: 173 (orig sOspA 5/3)中闡述的編碼多肽的核苷酸序列。下表I中陳述了用于嵌合OspA分子的DNA和氨基酸序列的序列鑒定編號。
表1.嵌合OspA DNA和氨基酸序列
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其包含選自由SEQ ID NO: 1、3以及5中闡述的序列組成的組的核苷酸序列。
2.一種分離的核酸分子，其由選自由SEQ ID NO: 1、3以及5中闡述的序列組成的組的核苷酸序列組成。
3.一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列: (a)與包含SEQID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5中闡述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和 (b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。
4.一種分離的 核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列: (a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與包含SEQID NO:2,SEQID N0:4或SEQ ID NO:6中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一 I"生；和 (b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。
5.一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列: (a)編碼包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的取代； (b)編碼包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的插入； (c)編碼包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的內(nèi)部缺失； (d)編碼包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的C末端和/或N末端截短； (e)編碼包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的修飾，所述修飾選自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及 (f)與(a)至(e)中任何一個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列。
6.一種分離的核酸分子，其包含選自由SEQ ID NO:7、9以及11中闡述的序列組成的組的核苷酸序列。
7.一種分離的核酸分子，其由選自由SEQ ID NO:7、9以及11中闡述的序列組成的組的核苷酸序列組成。
8.一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列: (a)與包含SEQID NO: 7,SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 11中闡述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和 (b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。
9.一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列: (a)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與包含SEQ ID NO:8, SEQID N0:10或SEQ IDNO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性；和 (b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列。
10.一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列: (a)編碼包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的取代； (b)編碼包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的插入； (c)編碼包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)保守氨基酸的內(nèi)部缺失； (d)編碼包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的C末端和/或N末端截短； (e)編碼包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25個(gè)氨基酸的修飾，所述修飾選自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及 (f)與(a)至(e)中任何一個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列。
11.一種載體，其包含如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
12.—種宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求11所述的載體。
13.如權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。`
14.如權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其是原核細(xì)胞。
15.—種產(chǎn)生多肽的方法,其包括在適于表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，并且任選地使所述多肽與培養(yǎng)物分離。
16.一種組合物，其包含如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的核酸分子或如權(quán)利要求11所述的載體(vector)以及藥學(xué)上可接受的載體(carrier)。
17.—種組合物，其包含如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的核酸分子中的至少兩種和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述核酸分子具有不同的核苷酸序列。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述組合物包含SEQIDN0:1、3以及5中闡述的核苷酸序列的組合。
19.一種分離的多肽，其包含選自由SEQ ID NO:2、4以及6中闡述的序列組成的組的氨基酸序列。
20.一種分離的多肽，其由選自由SEQ ID N0:2、4以及6中闡述的序列組成的組的氨基酸序列組成。
21.一種分離的多肽，其包含具有至少200個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述氨基酸序列與包含SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQID N0:6中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
22.—種分離的多肽，其包含選自由SEQ ID N0:8、10以及12中闡述的序列組成的組的氨基酸序列。
23.一種分離的多肽，其由選自由SEQ ID N0:8、10以及12中闡述的序列組成的組的氨基酸序列組成。
24.一種分離的多肽，其包含具有至少200個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述氨基酸序列與包含SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10或SEQID NO: 12中闡述的氨基酸序列的多肽具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
25.一種組合物，其包含如權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)所述的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
26.一種組合物，其包含如權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)所述的多肽中的至少兩種和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述多肽具有不同的序列。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述組合物包含多肽的組合，所述多肽包含SEQID NO:2、4以及6中闡述的氨基酸序列。
28.一種免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求16至18和25至27中任一項(xiàng)所述的組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
29.一種免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求16至18和25至27中任一項(xiàng)所述的組合物和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述組合物誘導(dǎo)特異地結(jié)合外膜蛋白(Osp)A蛋白的抗體的產(chǎn)生。
30.一種免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求16至18和25至27中任一項(xiàng)所述的組合物和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述組合物誘導(dǎo)特異地結(jié)合疏螺旋體屬的抗體的產(chǎn)生。
31.一種免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求16至18和25至27中任一項(xiàng)所述的組合物和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述組合物誘導(dǎo)中和疏螺旋體屬的抗體的產(chǎn)生。
32.如權(quán)利要求30或31所述的組合物，其中疏螺旋體屬是廣義伯氏疏螺旋體。
33.如權(quán)利要求30或31所述的組合物，其中疏螺旋體屬是阿氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體或狹義伯氏疏螺旋體。
34.如權(quán)利要求30或31所述的組合物，其中疏螺旋體屬是日本疏螺旋體、安德森疏螺旋體、比塞蒂疏螺旋體、西尼伽疏螺旋體、土德疏螺旋體、塔盧基疏螺旋體、法雷斯疏螺旋體、盧西塔尼疏螺旋體、斯柏曼疏螺旋體、宮本疏螺旋體或孤星疏螺旋體。
35.一種疫苗組合物，其包含如權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
36.一種聯(lián)合疫苗，其包含如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物聯(lián)合至少一種第二疫苗組合物。
37.如權(quán)利要求36所述的聯(lián)合疫苗，其中所述第二疫苗組合物防御蜱傳疾病。
38.如權(quán)利要求37所述的聯(lián)合疫苗，其中所述蜱傳疾病是落基山斑疹熱、巴貝斯蟲病、回歸熱、科羅拉多蜱熱、人單核細(xì)胞埃立克體病(HME)、人粒細(xì)胞埃立克體病(HGE)、南方蜱叮咬相關(guān)的皮疹疾病(STARI)、兔熱病、蜱癱瘓、波瓦桑腦炎、寇熱病、克里米亞剛果出血熱、胞裂蟲病、南歐斑疹熱或蜱傳腦炎。
39.如權(quán)利要求37所述的聯(lián)合疫苗，其中所述第二疫苗組合物是選自由以下組成的組的疫苗:蜱傳腦炎疫苗、日本腦炎疫苗以及落基山斑疹熱疫苗。
40.如權(quán)利要求36所述的聯(lián)合疫苗，其中所述第二疫苗組合物具有與針對疏螺旋體屬感染或萊姆病的免疫相容的季節(jié)性免疫程序。
41.一種用于誘導(dǎo)受試者體內(nèi)的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的量的如權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所述的組合物。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述免疫反應(yīng)包括產(chǎn)生抗OspA抗體。
43.一種用于預(yù)防或治療受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效預(yù)防或治療所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的如權(quán)利要求35或36所述的疫苗組合物。
44.一種抗體或其片段，其特異地結(jié)合如權(quán)利要求19至24中任一項(xiàng)所述的多肽。
45.一種用于預(yù)防或治療受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效預(yù)防或治療所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的如權(quán)利要求44所述的抗體或其片段。
46.一種用于預(yù)防或治療受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效預(yù)防或治療所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的抗體或其片段，所述抗體或 其片段是通過用如權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物使哺乳動(dòng)物免疫來產(chǎn)生。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述抗體或其片段是高免疫血清、高免疫血漿或其純化的免疫球蛋白部分。
48.一種用于被動(dòng)地預(yù)防受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效預(yù)防所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的抗OspA抗體或其片段，所述抗OspA抗體或其片段是通過用如權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物使哺乳動(dòng)物免疫來產(chǎn)生，其中所述抗體或其片段是純化的免疫球蛋白制劑或免疫球蛋白片段制劑。
49.一種用于預(yù)防受試者體內(nèi)的疏螺旋體屬感染或萊姆病的方法，所述方法包括以下步驟:向所述受試者施用有效預(yù)防所述疏螺旋體屬感染或萊姆病的量的抗OspA單克隆抗體或其片段，所述抗OspA單克隆抗體或其片段是在用如權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物使受試者免疫之后產(chǎn)生。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述單克隆抗體或其片段是人源化的。
51.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述單克隆抗體是F237/BK2。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于萊姆病或疏螺旋體病疫苗中的嵌合OspA分子的開發(fā)。更明確來說，所述嵌合OspA分子包含來自一個(gè)OspA血清型的近端部分連同來自另一個(gè)OspA血清型的遠(yuǎn)端部分，同時(shí)保留了這兩個(gè)親本多肽的抗原性質(zhì)。所述嵌合OspA分子被單獨(dú)或以組合形式遞送以便提供針對多種疏螺旋體屬同基因型種的保護(hù)。
文檔編號C07K14/20GK103118701SQ201180033682
公開日2013年5月22日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者布萊恩·A·克洛維, 伊安·利維, 馬里亞·歐洛爾科, 邁克爾·施文丁格, 約翰·J·杜恩, 本杰明·J·拉夫特 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司, 紐約州立大學(xué)研究基金會, 布魯克海文科學(xué)聯(lián)合有限責(zé)任公司