專利名稱：REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于提高抗癌免疫活性、進(jìn)行癌癥的治療或預(yù)防的藥物組合物。
背景技術(shù)：
作為與細(xì)胞的永生化有關(guān)的基因，已知有REIC/Dkk-3基因，有報(bào)告指出，在癌細(xì)胞中，該基因的表達(dá)受到抑制(參照專利文獻(xiàn)I和非專利文獻(xiàn)I至4)。REIC/Dkk-3基因?yàn)镈kk家族成員，有文獻(xiàn)暗示該基因藉由Wnt受體阻斷Wnt信號傳遞(參照非專利文獻(xiàn)5和6)。據(jù)報(bào)告，Wnt基因在細(xì)胞的成長、分化、癌變等重要的生物學(xué)狀況中發(fā)揮出多樣的作用(參照非專利文獻(xiàn)7)。有報(bào)告指出，對于REIC/ Dkk-3來說，若將全長REIC/Dkk-3蛋白以10 μ g/ml的濃度添加到對外周血單核球細(xì)胞(單核細(xì)胞)進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)液中，則該細(xì)胞會分化為樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞(參照專利文獻(xiàn)2)。一般來說，僅報(bào)道了數(shù)種確認(rèn)到可誘導(dǎo)血液前體細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞(樣)的物質(zhì)，其多數(shù)為已知的細(xì)胞因子。例如，有許多報(bào)告是關(guān)于GM-CSF和IL-4的合用的，通過將它們添加到培養(yǎng)液中來進(jìn)行單核細(xì)胞到樹突狀細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，其被認(rèn)為是樹突狀細(xì)胞分化的金標(biāo)準(zhǔn)。此外，作為可通過單獨(dú)使用或合用來誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的分化的物質(zhì)，據(jù)報(bào)告有 TNF-a、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、HGF Ofepatocyte growth factor,肝細(xì)胞生長因子)、⑶40配體、M-CSF、Fit3配體、TGF-β等。這些蛋白質(zhì)之中，作為如全長REIC/Dkk-3蛋白那樣僅單用一種就可由其前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化樹突(樣)細(xì)胞的物質(zhì)，已知有IL-2、IL-15、HGF、⑶40配體。并且，這些之中，確認(rèn)到體內(nèi)(in vivo)抗癌效果的僅為IL-2。另外，作為GM-CSF未能發(fā)揮出功效的理由，據(jù)認(rèn)為原因在于其不僅活化了抗癌免疫，而且還對骨髓來源免疫抑制性細(xì)胞(MDSC)和免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)所代表的免疫抑制系細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，活化了 “負(fù)免疫體系”(參照非專利文獻(xiàn)8)。專利文獻(xiàn)1:國際公開第W001/038523號小冊子專利文獻(xiàn)2:國際公開第W009/119874號小冊子非專利文獻(xiàn)I:Tsuji, T.et al., Biochem Biophys Res Commun268, 20-4 (2000)非專利文獻(xiàn)2:Tsuji, T.et al., Biochem Biophys Res Commun289, 257-63 (2001)非專利文獻(xiàn)3:Nozaki,1.et al.，Int J Oncol 19, 117-21 (2001)非專利文獻(xiàn)4:Kurose, K.et al., J Urol 171，1314-8 (2004)非專利文獻(xiàn)5:Bafico, A.et al.，Nat Cell Biol3, 683-6 (2001)非專利文獻(xiàn)6:Hoang, B.H.et al.，Cancer Res64, 2734-9 (2004)非專利文獻(xiàn)7:Moon, R.T.et al.，Science296, 1644-6 (2002)非專利文獻(xiàn)8:Parmiani, G.et al., Annals of 0ncologyl8, 226-32 (2007)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供可強(qiáng)力誘導(dǎo)、活化樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞并可通過免疫療法進(jìn)行癌癥的治療或預(yù)防的多肽；以及編碼該多肽的DNA。本發(fā)明人明確了全長REIC/Dkk-3蛋白在生物體內(nèi)的免疫、炎癥現(xiàn)象中的有用性、優(yōu)越性及其在大范圍的領(lǐng)域、疾病中的可利用性(國際公開第W009/119874號小冊子)。本發(fā)明人進(jìn)一步對REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域的活性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在特定的部分區(qū)域存在有很強(qiáng)的誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化樹突狀細(xì)胞樣的生理活性、該生理活性遠(yuǎn)強(qiáng)于全長REIC/Dkk-3蛋白。這顯示出，REIC/Dkk-3蛋白的特定部分區(qū)域進(jìn)行單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，可通過癌免疫活化用于癌癥的治療和預(yù)防。作為這樣的免疫學(xué)癌癥治療劑，據(jù)報(bào)告IL-2蛋白在腎細(xì)胞癌等特殊癌種中具有治療效果。但是，臨床上已知的事實(shí)是，具有該IL-2蛋白給藥適應(yīng)性的癌種及其效果也是有限的。REIC/Dkk-3蛋白被確認(rèn)到在幾乎所有癌種中的表達(dá)、分泌發(fā)生降低，該REIC/Dkk-3蛋白具有可作為在這些各種癌種中具有癌免疫活化作用的癌癥治療劑進(jìn)行使用的可能性，并且其治療效果也可能比IL-2具有優(yōu)越性。如上所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，REIC/Dkk-3蛋白的特定部分區(qū)域具有強(qiáng)于全長REIC/Dkk-3蛋白的“誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞樣的生理活性”，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下。[I] 一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽,其為下述(a) (e)的任意一種:(a) 一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽，其由選自由序列編號3、序列編號5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域；(b) 一種具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，其是由在選自由序列編號3、序列編號5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列中有一個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列構(gòu)成的多肽蛋白質(zhì)，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域；(c) 一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽，其是由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽，其由序列編號17所表示的氨基酸序列構(gòu)成；(d) 一種與Tctex-1蛋白具有結(jié)合活性的多肽，其是由在序列編號17所表示的氨基酸序列中有一個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；以及(e) 一種由REIC/Dkk -3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽，該多妝含有序列編號18所表不的共有序列，由7 22殘基的氣基酸構(gòu)成。[2] 一種編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA，其為下述(f) (I)的任意一種；(f) 一種DNA，其由選自由序列編號4、序列編號6、序列編號8和序列編號10所示的堿基序列、以及由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列組成的組中的堿基序列構(gòu)成，該部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，且所述部分序列的片段含有由序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列；(g) 一種DNA，其與由下述堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，所述堿基序列與選自由序列編號
4、序列編號6、序列編號8和序列編號10所示的堿基序列、以及由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列組成的組中的堿基序列互補(bǔ)，該部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，且所述部分序列的片段含有由序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列；(h) 一種DNA，其由在選自由序列編號4、序列編號6、序列編號8和序列編號10所示的堿基序列、以及由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列組成的組中的堿基序列中有一個或數(shù)個堿基發(fā)生了缺失、取代或添加的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性 的多肽，所述部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，且所述部分序列的片段含有由序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列；(i) 一種DNA，其由編碼下述氨基酸序列的DNA序列構(gòu)成且編碼具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，所述氨基酸序列選自由序列編號3、序列編號
5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域；(j) 一種DNA，其編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽，該DNA由下述堿基序列構(gòu)成，該堿基序列由序列編號8所表示的堿基序列的第4位的g至第69位的g構(gòu)成；(k) 一種DNA，其與由下述堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼與Tctex-1蛋白具有結(jié)合活性的多肽，所述堿基序列與由序列編號8所表示的堿基序列的第4位的g至第69位的g構(gòu)成的堿基序列互補(bǔ)；以及(I) 一種DNA，其由編碼序列編號17所表示的氨基酸序列的DNA序列構(gòu)成、且編碼與Tctex-1蛋白具有結(jié)合活性的多肽，所述氨基酸序列是由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽。[3] 一種載體,其含有[2]所述的DNA。[4]如[3]所述的載體，其中，載體為腺病毒載體。[5] 一種單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其含有[I]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。[6] 一種免疫活化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑,所述免疫活化細(xì)胞選自由樹突狀細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、CTL和NK細(xì)胞組成的組，所述分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑含有[I]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。[7] 一種免疫抑制功能系細(xì)胞的分化誘導(dǎo)抑制劑，所述免疫抑制功能系細(xì)胞為MDSC或Treg，所述分化誘導(dǎo)抑制劑含有[I]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。[8] 一種抗癌劑，其含有[I]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。[9] 一種單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其含有[2]所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的載體作為有效成分。[10] 一種免疫活化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑,所述免疫活化細(xì)胞選自由樹突狀細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、CTL和NK細(xì)胞組成的組，所述分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑含有[2]所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的載體作為有效成分。[11] 一種免疫抑制系細(xì)胞的分化誘導(dǎo)抑制劑，所述免疫抑制系細(xì)胞為MDSC或Treg，所述分化誘導(dǎo)抑制劑含有[2]所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的載體作為有效成分。
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[12] 一種抗癌劑，其含有[2]所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者[3]或[4]所述的載體作為有效成分。[13] 一種誘導(dǎo)CD14陽性單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，該方法包括在體外(in vitro)、在[I]所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的存在下對由動物采集的單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。[14]如[13]所述的方法，其中，單核細(xì)胞為外周血單核細(xì)胞。本說明書中包含作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請2010-150935號和日本特愿2011-014319號的說明書和/或附圖中記載的內(nèi)容。


圖1為示出人REIC/Dkk-3蛋白的全長以及部分區(qū)域I [Argl21_329]和部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]的制備方法的圖。圖2為示出在單獨(dú)(無添加)(圖2A)對PBMC進(jìn)行7天培養(yǎng)、在GM-CSF+IL-4 (圖2B)(分別為2ng/ml)、或者人REIC/Dkk-3蛋白的全長(圖2C)、部分區(qū)域I [Argl21_Ile329](圖2D)或部分區(qū)域2[Glyl84-1le329](圖2E) (10 μ g/ml)的存在下對PBMC進(jìn)行7天培養(yǎng)時PBMC相位差顯微鏡像的照片(低倍放大像)。圖3為示出在單獨(dú)(無添加)(圖3A)對PBMC進(jìn)行7天培養(yǎng)、在GM-CSF+IL-4 (圖3B)(分別為2ng/ml)、或者部分區(qū)域2[Glyl84-1le329] (10 μ g/ml)(圖3C)的存在下對PBMC進(jìn)行7天培養(yǎng)時PBMC相位差顯微鏡像的照片(高倍放大像)。圖4為示出通過單獨(dú)(無添加)、添加GM-CSF+IL-4 (分別為2ng/ml)、或者人REIC/Dkk-3 蛋白的全長、部分區(qū)域 l[Argl21-1le329]或部分區(qū)域 2 [Glyl84_Ile329] (10 μ g/ml)所分化誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的出現(xiàn)頻率的圖。圖5-1為示出REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的制造法和精制法的方案的圖。圖5-2為示出REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3[Serll4_Phe267]的精制中第I次離子交換色譜精制的曲線圖的圖。
圖5-3為適合粗REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的精制中第2次離子交換色譜精制的曲線圖的圖。圖6為示出人組織來源培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)人REIC蛋白添加所致的誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞樣的照片，為通過單獨(dú)(無添加)(圖6A)、或者添加REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域 l[Argl21-1le329] (10 μ g/ml)(圖 6B)或部分區(qū)域 3 [Serll4_Phe267] (10 μ g/ml)(圖6C)所分化誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞(第7天)的相位差顯微鏡照片(低倍放大)。圖7為示出人組織來源培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)人REIC蛋白添加所致的誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞樣的照片，為通過單獨(dú)(無添加)(圖7A)、或者添加REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域 l[Argl21-1le329] (10 μ g/ml)(圖 7B)或部分區(qū)域 3 [Serll4_Phe267] (10 μ g/ml)(圖7C)所分化誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞(第7天)的相位差顯微鏡照片(高倍放大)。圖8為示出REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的穩(wěn)定性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的圖。 圖9為不出實(shí)施例3中所用的基因聞表達(dá)質(zhì)粒所包含的表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)的圖。圖10為示出人全長REIC/Dkk-3蛋白以及部分區(qū)域3[Serll4_Phe267]的腹腔內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)方案的圖。圖1lA為示出人全長REIC/Dkk-3蛋白以及部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的腹腔內(nèi)給藥所帶來的腫瘤增殖抑制效果(腫瘤體積的經(jīng)時變化)的圖。圖1lB為示出人全長REIC/Dkk-3蛋白以及部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的腹腔內(nèi)給藥所帶來的腫瘤增殖抑制效果(腫瘤重量)的圖。圖1lC為示出人全長REIC/Dkk-3蛋白以及部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的腹腔內(nèi)給藥所帶來的腫瘤增殖抑制效果的腫瘤照片。圖llC-a示出了給與PBS后的情況的結(jié)果；圖llC-b示出了給與人全長REIC/Dkk-3蛋白后的情況的結(jié)果；圖1lC-C示出了給與部分區(qū)域3的情況的結(jié)果。圖12A為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的骨髓來源免疫抑制性細(xì)胞的陽性率(%)的圖表。圖12B為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞的陽性率(%)的圖表。圖12C為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的活化樹突狀細(xì)胞(CDllc+/CD80+)的陽性率(%)的圖表。圖12D為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的活化樹突狀細(xì)胞(CDllc+/CD86+)的陽性率(%)的圖表。圖12E為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的輔助T細(xì)胞的陽性率(%)的圖表。圖12F為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的免疫抑制性T細(xì)胞的陽性率(%)的圖表。圖12G為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的陽性率(%)的圖表。圖12H為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的活性型細(xì)胞毒性T細(xì)胞的陽性率(%)的圖表。圖121為示出在REIC/Dkk-3蛋白(全長或部分區(qū)域3)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或無處置組或PBS緩沖液給藥組中各外周血中的NK細(xì)胞的陽性率(%)的圖表。圖13為示出人全長REIC/Dkk-3蛋白在原位腎細(xì)胞癌、肺轉(zhuǎn)移模型小鼠中的腹腔內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)方案的圖。圖14A為人全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)在原位腎細(xì)胞癌、肺轉(zhuǎn)移模型小鼠中的腹腔內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)中腎癌原發(fā)灶的腫瘤組織照片。圖14B為示出在全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、IOOyg)治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中腎癌原發(fā)灶的腫瘤重量(g)的平均值的圖表。圖15A為在人全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)的原位腎細(xì)胞癌、肺轉(zhuǎn)移模型小鼠中的腹腔內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)中肺轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織照片。圖15B為示出在全長REIC/Dkk-3蛋白(IOygUOOyg)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中肺轉(zhuǎn)移灶的腫瘤重量(g)的平均值的圖表。圖16A為示出對于從無處置小鼠中采集的骨髓細(xì)胞給與GM-CSF (20ng/ml)(16A-a)或 REIC 蛋白(10ug/ml)與 GM-CSF(20ng/ml)的混合液(16A-C)時 MDSC 細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的細(xì)胞圖。16A-a為對照。圖16B為示出由圖16A所示的細(xì)胞圖推出的MDSC細(xì)胞的陽性率的圖表。圖17A-1為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(IOygUOOyg)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行MDSC(Gr-1+,⑶IIb+)陽性率測定的結(jié)果(細(xì)胞圖)的圖。圖17A_la為使用PBS的情況下的結(jié)果；圖17A-lb為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(IOyg)的情況下的結(jié)果；圖17A_lc為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(IOOyg)的情況下的結(jié)果。圖17A-2為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(IOygUOOyg)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行MDSC(Gr-l+，railb+)陽性率測定的結(jié)果(陽性率的圖表)的圖。圖17B-1為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行樹突狀細(xì)胞(CDllc+，CD80+)陽性率測 定的結(jié)果(細(xì)胞圖)的圖。圖17B-la為使用PBS的情況下的結(jié)果；圖17B-lb為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(IOyg)的情況下的結(jié)果；圖17B_lc為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(IOOyg)的情況下的結(jié)果。
圖17B-2為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行樹突狀細(xì)胞(CDllc+，CD80+)陽性率測定的結(jié)果(陽性率的圖表)的圖。圖17C-1為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(IOygUOOyg)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行Treg(⑶4+，F(xiàn)oxp3+)陽性率測定的結(jié)果(細(xì)胞圖)的圖。圖17C_la為使用PBS的情況下的結(jié)果；圖17C-lb為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(IOyg)的情況下的結(jié)果；圖17C_lc為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(100 μ g)的情況下的結(jié)果。圖17C-2為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(IOygUOOyg)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行Treg(⑶4+，F(xiàn)oxp3+)陽性率測定的結(jié)果(陽性率的圖表)的圖。圖17D-1為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行活性型CTL(⑶8+，⑶69)陽性率測定的結(jié)果(細(xì)胞圖)的圖。圖17D-la為使用PBS的情況下的結(jié)果；圖17D-lb為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(IOyg)的情況下的結(jié)果；圖17D_lc為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(100 μ g)的情況下的結(jié)果。

圖17D-2為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行活性型CTL(CD8+, CD69+)陽性率測定的結(jié)果(陽性率的圖表)的圖。圖17E-1為示出使用全流式細(xì)胞分析對由長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行NK細(xì)胞(⑶3e+，NKl.1+)陽性率測定的結(jié)果(細(xì)胞圖)的圖。圖17E-la為使用PBS的情況下的結(jié)果、圖17E-lb為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(IOyg)的情況下的結(jié)果、圖17E_lc為使用全長REIC/Dkk-3蛋白(100 μ g)的情況下的結(jié)果。圖17E-2為示出使用流式細(xì)胞分析對由全長REIC/Dkk-3蛋白(10 μ g、100 μ g)的治療實(shí)驗(yàn)終止時(即將安樂死之前)或PBS緩沖液給藥組中采集的各外周血進(jìn)行NK細(xì)胞(CD3e+,NKl.1+)陽性率測定的結(jié)果(陽性率的圖表)的圖。圖18A為示出表示REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的相互作用的酵母雙雜交分析結(jié)果的圖。圖中，藍(lán)色菌落表示具有REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的相互作用。圖18B為示出表示REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的相互作用的免疫沉降分析與Western印跡分析結(jié)果的圖。圖19A為示出表示全長REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的相互作用的動物細(xì)胞雙雜交分析結(jié)果的圖。圖19B為示出表示人全長REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域與Tctex-1蛋白的相互作用的動物細(xì)胞雙雜交分析結(jié)果的圖。圖20A為示出REIC/Dkk-3蛋白與動力蛋白中間鏈(DIC)TcTex-1結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列比對的圖。圖20B為示出REIC/Dkk-3蛋白Tctex結(jié)合域與已知結(jié)合蛋白的氨基酸序列比對的圖。
圖21A為示出人全長REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位的照片。圖21A的照片為在人成纖維細(xì)胞0UMS24中進(jìn)行人全長REIC/Dkk-3蛋白(A_b)與作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物的刀豆球蛋白A(A-a)的雙重?zé)晒馊旧?A-c)的共聚焦顯微鏡照片。圖21B為示出人全長REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位的照片。圖21B的照片為在人成纖維細(xì)胞0UMS24中進(jìn)行Tctex-1蛋白(B_b)與作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物的刀豆球蛋白A(B-a)的雙重?zé)晒馊旧?B-c)的共聚焦顯微鏡照片。圖22A為利用熒光顯微鏡通過Hochest染色拍攝表示Ad-REIC的凋亡誘導(dǎo)能力由于Tctex-1表達(dá)減少而減弱、由于其表達(dá)增加而增強(qiáng)的情況的照片。上部照片為使用Ad-LacZ的情況，下部照片為使用Ad-REIC的情況，a、b和c分別表示給與GFP質(zhì)粒、shRNA-Tctex-1、Tctex-1表達(dá)質(zhì)粒的情況的結(jié)果。圖22B為利用凋亡誘導(dǎo)率圖表表示Ad-REIC的凋亡誘導(dǎo)能力由于Tctex-1表達(dá)減少而減弱、由于其表達(dá)增加而增強(qiáng)的情況的圖。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)說明本發(fā)明。REIC/Dkk-3基因(REIC基因)的全長堿基序列和該基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別以序列編號I和序列編號2表示。序列編號2所表示的氨基酸序列中，由第I位至第21位氨基酸構(gòu)成的序列被預(yù)測為信號序列。REIC/Dkk-3基因可基于序列編號I的序列信息由人細(xì)胞、人組織等得到。另外也可以按照國際公開第W001/038523號小冊子的記載來得到。本發(fā)明的由REIC/Dkk-3蛋白(REIC蛋白)的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽包括下述多肽。(I)由包含 下述部分區(qū)域的209個氨基酸構(gòu)成，該部分區(qū)域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信號序列部分以外部分的第121位的Arg至第329位的Ile構(gòu)成。該多肽由序列編號2所示的氨基酸序列的第142位的Arg至第350位的Ile構(gòu)成。有時將本發(fā)明的多肽稱為REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Argl21-1le329]。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Argl21-1le329]的氨基酸序列示于序列編號5中，編碼該氨基酸序列的堿基序列示于序列編號6中。(2)由包含下述部分區(qū)域的146個氨基酸構(gòu)成，該部分區(qū)域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信號序列部分以外部分的第184位的Gly至第329位的Ile構(gòu)成。該多肽由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第350位的Ile構(gòu)成。有時將本發(fā)明的多肽稱為REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Gly 184-1 le329]。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Glyl84-1le329]的氨基酸序列示于序列編號3中，編碼該氨基酸序列的堿基序列示于序列編號4中。(3)由包含下述部分區(qū)域的154個氨基酸構(gòu)成,該部分區(qū)域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信號序列部分以外部分的第114位的Ser至第267位的Phe構(gòu)成。該多肽由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第288位的Phe構(gòu)成。有時將本發(fā)明的多肽稱為REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Serll4-Phe267]。本發(fā)明REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Serll4-Phe267]的氨基酸序列示于序列編號7中，編碼該氨基酸序列的堿基序列示于序列編號8中。
(4)由包含下述部分區(qū)域的83個氨基酸構(gòu)成,該部分區(qū)域由REIC/Dkk-3蛋白中除去信號序列部分以外部分的第184位的Gly至第267位的Phe構(gòu)成。該多肽是由上述3種多肽的共有序列構(gòu)成的多肽，據(jù)認(rèn)為其是成為生理活性核心的多肽。該多肽由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成。有時將本發(fā)明的多肽稱為REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Glyl84-Phe267]。本發(fā)明REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Glyl84-Phe267]的氨基酸序列示于序列編號9中，編碼該氨基酸序列的堿基序列示于序列編號10中。(5)進(jìn)一步地，本發(fā)明的由REIC/Dkk-3蛋白(REIC蛋白質(zhì))的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽包括由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽，該部分區(qū)域由第114位的Ser至第329位的Ile構(gòu)成，且該片段含有由REIC/Dkk-3蛋白中除去信號序列部分以外部分的第184位的Gly至第267位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域。該多肽由由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile所構(gòu)成的部分區(qū)域的片段構(gòu)成，且該片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域。另外，編碼該多肽的堿基序列由由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t所構(gòu)成的部分序列的片段構(gòu)成，且所述部分序列的片段含有由序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列。 該多肽的氨基酸殘基數(shù)目為83 216個。進(jìn)一步地,REIC/Dkk-3蛋白與 Tctex-1 (t-complex testis expressed-1)蛋白相互作用(締合)來發(fā)揮作用。Tctex-1蛋白為構(gòu)成馬達(dá)動力蛋白復(fù)合體的輕鏈蛋白(dyneinlight chain,動力蛋白輕鏈)，通過與Tctex-1結(jié)合蛋白締合而作為馬達(dá)動力蛋白與膜泡負(fù)載(小胞積荷)間的插入分子發(fā)揮出重要作用。REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-Ι蛋白均靠近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周邊存在，Tctex-Ι蛋白促進(jìn)REIC/Dkk-3蛋白的凋亡誘導(dǎo)能力。REIC/Dkk-3蛋白的由22個氨基酸構(gòu)成的部分區(qū)域(該部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第136位的Val至第157位的Met構(gòu)成)與Tctex-1蛋白相互作用。該部分區(qū)域多肽相當(dāng)于由REIC/Dkk-3蛋白中除去信號序列部分以外部分的第115位的Val至第136位的Met構(gòu)成的部分區(qū)域。該部分區(qū)域的氨基酸序列示于序列編號17中。該部分區(qū)域的氨基酸序列中，EXGRRXH(序列編號18 ;相當(dāng)于由序列編號17的第4 10氨基酸構(gòu)成的序列)(X為任意的天然氨基酸)是涉及與Tctex-1蛋白的結(jié)合的共有序列(共有基序)。本發(fā)明包括REIC/Dkk-3蛋白與上述Tctex-1蛋白相互作用的部分區(qū)域肽和上述
共有基序。因而，本發(fā)明的由REIC/Dkk-3蛋白(REIC蛋白)的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽包含由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽，其是由序列編號17所表示的氨基酸序列構(gòu)成的、由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽。進(jìn)一步包含下述多肽:該多肽含有上述EXGRRXH(序列編號18)所表示的共有基序的序列、由7 22殘基的氨基酸構(gòu)成。該多肽例如為由序列編號17所示的氨基酸序列中連續(xù)的7 22殘基的氨基酸構(gòu)成的多肽，其含有由第4位的Glu至第10位的His的7個氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列。這種情況下，第5位的Glu和第9位的Ser可被其它任意的天然氨基酸取代。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽為具有上述的氨基酸序列或者與該氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列、具有樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)活性的多肽，該上述的氨基酸序列即為序列編號3、序列編號5、序列編號7或序列編號9所示的氨基酸序列；或者由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列，所述部分區(qū)域由REIC/Dkk-3蛋白中第114位的Ser至第329位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由REIC/Dkk-3蛋白中除去信號序列部分以外部分的第184位的Gly至第267位的Phe構(gòu)成。另外，本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽為具有序列編號17表示的氨基酸序列或者與該氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列、與Tctex-1蛋白具有結(jié)合活性的多肽。此處，作為實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列，可以舉出:在該氨基酸序列中有一個或多個或者數(shù)個(I 10個、優(yōu)選為I 5個、進(jìn)一步優(yōu)選為I個或者2個)氨基酸發(fā)生了取代、缺失和/或添加的氨基酸序列；或在使用BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for BiologicalInformation (美國國家生物技術(shù)信息中心堿基局部對準(zhǔn)檢索工具))等(使用例如默認(rèn)即初期設(shè)定參數(shù))進(jìn)行計(jì)算時，與該氨基酸序列具有至少85%以上、優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、特別優(yōu)選為97%以上的同源性的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的活性，進(jìn)一步具有分化誘導(dǎo)CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞、輔助T細(xì)胞等免疫活化細(xì)胞的活性，進(jìn)一步還具有對MDSC細(xì)胞或Treg細(xì)胞進(jìn)行分化抑制的活性。本發(fā)明的多肽由于具有這些細(xì)胞分化誘導(dǎo)活性及抑制活性，因而可對免疫抑制系統(tǒng) 進(jìn)行抑制。因而，本發(fā)明的多肽可作為抗癌免疫活化劑、抗癌齊IJ、抗腫瘤劑、免疫細(xì)胞分化誘導(dǎo)/抑制劑來進(jìn)行利用。編碼本發(fā)明REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA為下述DNA(I)、(II)或(III)等中編碼具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性；CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞、輔助T細(xì)胞等免疫活化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性；MDSC細(xì)胞、Treg細(xì)胞的分化抑制活性的蛋白的DNA,所述DNA (I)與具有下述堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，所述堿基序列與序列編號
4、序列編號6、序列編號8或序列編號10所表示的堿基序列；由序列編號8所示堿基序列的第4位的g至第69位的g構(gòu)成的堿基序列；或者由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列互補(bǔ)，所述部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，所述部分序列的片段含有序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列；所述 DNA(II)在使用 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at theNational Center for Biological Information(美國國家生物技術(shù)信息中心喊基局部對準(zhǔn)檢索工具))等(使用例如默認(rèn)即初期設(shè)定參數(shù))進(jìn)行計(jì)算時與下述堿基序列所表示的堿基序列具有至少85%以上、優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、特別優(yōu)選為97%以上的同源性，所述堿基序列為序列編號4、序列編號6、序列編號8或序列編號10的堿基序列；由序列編號8所示堿基序列的第4位的g至第69位的g構(gòu)成的堿基序列；或者由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列互補(bǔ)，所述部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，所述部分序列的片段含有序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列；所述DNA(III)編碼由下述氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，該氨基酸序列是在由上述DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有一個或復(fù)數(shù)個或者數(shù)個(I 10個、優(yōu)選為I 5個、進(jìn)一步優(yōu)選為I個或者2個)氨基酸發(fā)生了取代、缺失和/或添加的氨基酸序列。此處，“嚴(yán)格條件”例如為“1XSSC、0.1%SDS、37°C”程度的條件，作為更嚴(yán)格的條件為“0.5 X SSC、0.P/oSDS,42°C ”程度的條件，作為進(jìn)一步嚴(yán)格的條件為“0.2XSSC、0.1%SDS、65°C”程度的條件。REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽可基于上述序列信息通過化學(xué)合成來得到。還可通過基因工程方法以重組多肽的形式得到。即，可將編碼本發(fā)明REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)妮d體中，將該載體插入到宿主中，對該宿主進(jìn)行培養(yǎng)，由培養(yǎng)物得到多肽。用于插入本發(fā)明DNA的載體只要可在宿主中復(fù)制就沒有特別限定，可以舉出例如質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等，可以使用公知的載體。此時，作為宿主可使用真核細(xì)胞或原核細(xì)胞系。作為真核細(xì)胞，可以舉出例如所建立的人、嚙齒類等哺乳類細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、絲狀真菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞等動物細(xì)胞等，作為原核細(xì)胞，可以舉出例如大腸桿菌細(xì)胞等細(xì)菌細(xì)胞。通過在體外或體內(nèi)對含有本發(fā)明的編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、利用公知方法對該宿主進(jìn)行培養(yǎng)，可由培養(yǎng)物中得到REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽。此處，所述“培養(yǎng)物”意味著培養(yǎng)上清、或者培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)菌體、或者細(xì)胞或菌體的破碎物中的任意一種。經(jīng)表達(dá)產(chǎn)生的多肽可由上述培養(yǎng)物中進(jìn)行精制。精制使用通常在蛋白質(zhì)中所用的精制方法即可，例如可通過適當(dāng)選擇并組合離子交換色譜、親和色譜、凝膠過濾、超濾、鹽析、透析等來進(jìn)行精制。進(jìn)一步地，本發(fā)明REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽也可按照W001/038523號公報(bào)的記載來得到。本發(fā)明REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽中，特別是REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Glyl84-Phe267]在室溫至37°C左右的高溫下保存也不會受到分解，是穩(wěn)定的。并且對PEG等各種試劑也是穩(wěn)定的。本發(fā)明還包括含有上述編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA的載體。通過將該載體導(dǎo)入至待測體中，REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽可在待測體體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)、可在待測體體內(nèi)發(fā)揮出生理活性。REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。在基因治療中，目的基因(DNA)向待測體中的導(dǎo)入可通過公知方法進(jìn)行。作為將基因?qū)氲酱郎y體中的方 法，有使用病毒載體的方法和使用非病毒載體的方法，各種方法是公知的(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)別冊，基因治療的基礎(chǔ)技術(shù)，羊土社，1996;實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)別冊，基因?qū)?amp;表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)法，羊土社，1997 ;日本基因治療學(xué)會編，基因治療開發(fā)研究手冊，NTS, 1999)。作為用于基因?qū)氲牟《据d體，使用腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體的方法為代表性方法?？梢栽谌ザ灸孓D(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、辛德比斯病毒、仙臺病毒、SV40、人類免疫缺陷病毒(HIV)等DNA病毒或RNA病毒中導(dǎo)入目的基因，使細(xì)胞感染重組病毒，從而向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因。將本發(fā)明的基因用于使用病毒進(jìn)行的基因治療時，優(yōu)選使用腺病毒載體。作為腺病毒載體的特征，可以舉出以下幾點(diǎn):(1)能夠在多種細(xì)胞中導(dǎo)入基因；(2)即使對增殖停滯期的細(xì)胞也能夠有效地進(jìn)行基因?qū)耄?3)能夠通過離心進(jìn)行濃縮，得到高滴度(10PFU/ml llPFU/ml以上)病毒；(4)適于向體內(nèi)組織細(xì)胞中直接進(jìn)行基因?qū)?。作為基因治療用的腺病毒，已開發(fā)出E1/E3區(qū)域缺失的第I代腺病毒載體(Miyake, S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，93，1320，1996)、除 E1/E3 區(qū)域外 E2 或 E4 區(qū)域也缺失的第 2 代腺病毒載體(Lieber, A., et al., J.Virol., 70, 8944, 1996 ；Mizuguchi, H.&Kay, M.A., Hum.Gene Ther.，10, 2013, 1999)、腺病毒基因組基本上完全缺失的(⑶TLESS)第3代腺病毒載體(Steinwaerder, D.S.，et al.，J.Virol.，73，9303，1999)，導(dǎo)入本發(fā)明的基因時，可以沒有特別限定地使用任一腺病毒載體。進(jìn)一步地，若利用對AAV染色體賦予了重組的能力的 Adeno-AAV 雜化載體(Recchia, A., et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA., 96, 2615, 1999)或通過使用轉(zhuǎn)座子基因而在染色體中具有重組能力的腺病毒載體等，則也能夠應(yīng)用于長期的基因表達(dá)中。另外，通過插入與腺病毒纖維的Hl環(huán)顯示出組織特異的轉(zhuǎn)移性的肽序列，也能夠?qū)ο俨《据d體賦予組織特異性(Mizuguchi, H.&Hayakawa, T., NipponRinsho, 7，1544，2000)。此外，也可不使用上述病毒而使用重組有質(zhì)粒載體等基因表達(dá)載體的重組表達(dá)載體，將目的基因?qū)氲郊?xì)胞或組織中。例如，可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉法、DEAE-葡聚糖法、使用微小玻璃管的DNA的直接注入法等將基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)。此外，還可通過利用了內(nèi)包型脂質(zhì)體(internal liposome)的基因?qū)敕?、利用了靜電型脂質(zhì)體(electorostatic type liposome)的基因?qū)敕?、HVJ-脂質(zhì)體法、改良型HVJ-脂質(zhì)體法(HVJ-AVE脂質(zhì)體法)、使用了 HVJ-E (envelope，包被)載體的方法、受體介導(dǎo)性基因?qū)敕?、利用粒子槍將載體(金屬顆粒)與DNA分子一同打入到細(xì)胞中的方法、裸DNA的直接導(dǎo)入法、利用各種聚合物的導(dǎo)入法等將重組表達(dá)載體插入到細(xì)胞。作為這種情況下所用的表達(dá)載體，只要是能在生物體內(nèi)表達(dá)目的基因的載體，即可使用任意表達(dá)載體，可以舉出例如pCAGGS (Gene 1 08, 193-200 (1991))、pBK_CMV、pcDNA3、UpZeoSV (Invitrogen 社、Stratagene社)、pVAXl等表達(dá)載體。包含編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA的載體可以適當(dāng)包含用于基因轉(zhuǎn)錄的啟動子或增強(qiáng)子、Poly A信號、用于導(dǎo)入了基因的細(xì)胞的標(biāo)記和/或選擇的標(biāo)記基因等。作為此時的啟動子，可以使用公知的啟動子。為了將包含本發(fā)明的編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA的基因治療用藥物導(dǎo)入到待測體中，可以使用將基因治療用藥物直接導(dǎo)入到體內(nèi)的體內(nèi)(in vivo)法；以及從人中取出某種細(xì)胞、然后在體外向該細(xì)胞中導(dǎo)入基因治療用藥物、再將該細(xì)胞送回體內(nèi)的離體(ex vivo)法等(Nikkei Science, 1994年4月號,20-45頁；月刊藥事(月刊薬事)，36 (I) ,23-48(1994);實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，12 (15)，(1994);日本基因治療學(xué)會編，基因治療開發(fā)研究手冊，NTS, 1999)。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽、編碼該多肽的DNA和含有該DNA的載體可作為藥物或試劑進(jìn)行利用。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽、編碼該多肽的DNA和含有該DNA的載體可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞、提高抗癌免疫活性，可用于癌癥的治療中。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽、編碼該多肽的DNA和含有該DNA的載體可作為單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑、癌免疫活化劑和具有癌免疫活化作用的癌癥治療或預(yù)防用藥物組合物進(jìn)行使用。此處，單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性指的是作用于單核細(xì)胞使之分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的活性。對于是否通過添加REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽而分化誘導(dǎo)了樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞這一點(diǎn)，可通過形態(tài)學(xué)特征和表面抗原進(jìn)行檢測。即，作為該樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的特征，可以舉出:在形態(tài)學(xué)上具有樹狀突起；以及通過基于流式細(xì)胞術(shù)的分析，作為表面抗原的樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物 CD 11 c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR 為陽性。另外，通過將含有編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA的載體導(dǎo)入至待測體中，REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽在待測體體內(nèi)表達(dá)，可通過單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)效果、癌免疫活化效果和癌免疫活化作用發(fā)揮出癌癥的治療或預(yù)防效果。單核細(xì)胞包括外周血來源單核細(xì)胞、骨髓來源單核細(xì)胞、脾臟細(xì)胞來源單核細(xì)胞、臍帶血來源單核細(xì)胞，其中優(yōu)選外周血來源單核細(xì)胞。單核細(xì)胞可以通過以下方式采集:以CD14陽性為特征從生物體采集單核細(xì)胞，在利用REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的情況下，以CD14的存在為指標(biāo)，通過FACS (熒光激活細(xì)胞分類器，F(xiàn)luorescent activated cell sorter)或流式細(xì)胞儀等進(jìn)行采集。對單核細(xì)胞的來源動物種并無限定，可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、田鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、牛、馬、羊、猴、人等哺乳動物。利用FACS分離特定的細(xì)胞群時可通過公知方法進(jìn)行。作為FACS、流式細(xì)胞儀，例如可使用 FACS vantage (Becton Dickinson 社制造)、FACS Calibur (Becton Dickinson 社制造)等°單核細(xì)胞的培養(yǎng)可通過公知的人淋巴系細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來進(jìn)行。作為培養(yǎng)液，可使用例如RPMI1640或DMEM等公知的基本培養(yǎng)基。可向這些基本培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)目股镔|(zhì)或動物血清等來進(jìn)行培養(yǎng)。對培養(yǎng)容器并無限制，可根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模適當(dāng)選擇市售的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶來使用。 本發(fā)明包括在REIC蛋白的存在下在體外對單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的方法。在該方法中，例如可以IO4 IO7細(xì)胞/ml的濃度使用單核細(xì)胞、以I μ g/ml 20 μ g/ml的濃度添加REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽來進(jìn)行培養(yǎng)。在生物體內(nèi)，樹突狀細(xì)胞在癌免疫、炎癥等的機(jī)理中發(fā)揮出極為重要的作用。利用本發(fā)明的方法通過REIC/Dkk-3蛋白分化誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞與經(jīng)IL-4+GM-CSF誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相似，但嚴(yán)格來講是不同的新型的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞。通過REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞具有樹狀形態(tài)。并且，作為樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物的⑶I lc、⑶40、⑶80、⑶86、HLA-DR為陽性。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的新型的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞可分類為樹突狀細(xì)胞。但作為樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物的CDla為陰性、通常在樹突狀細(xì)胞中呈陰性化的⑶14為陽性。在受到REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的刺激而由CD14陽性單核細(xì)胞誘導(dǎo)的情況下，其被稱為“經(jīng)REIC蛋白活化的、分化為樹突狀細(xì)胞樣的細(xì)胞(REIC activatedmonocyte with dendritic cell features,具有樹突狀細(xì)胞形態(tài)的REIC活化單核細(xì)胞)”。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的分化誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的能力大于全長REIC/Dkk-3蛋白。本發(fā)明包括利用REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽由CD14陽性單核細(xì)胞誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞。被REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽誘導(dǎo)而得到的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞可用于癌免疫療法。即，由待測體采集單核細(xì)胞，將該單核細(xì)胞與REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽共同進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞，將所得到的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞送回到待測體內(nèi)，由此可將樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞本身用于癌治療或預(yù)防等中。此時，由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞能夠發(fā)揮出癌種非特異性的作用、發(fā)揮出癌免疫治療效果，但在誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞時，也可添加癌種特異性腫瘤抗原或自體腫瘤裂解物。并且，也可將誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞與特定的腫瘤抗原或自體腫瘤裂解物一同進(jìn)行培養(yǎng)。通過利用癌種特異性腫瘤抗原或自體腫瘤裂解物刺激樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞，能夠腫瘤特異性地對癌細(xì)胞進(jìn)行攻擊。樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞可通過皮內(nèi)給藥、皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥或淋巴結(jié)內(nèi)給藥來進(jìn)行給藥。另外，REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽被認(rèn)為具有從細(xì)胞外作用于細(xì)胞而掌管細(xì)胞分化的細(xì)胞因子樣作用，認(rèn)為其在生物體內(nèi)具有與免疫性、炎癥性相關(guān)的廣泛功能。因而，可將REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的DNA給藥到待測體中，作為體內(nèi)的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑、或者樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞活化劑進(jìn)行使用。REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽在待測體內(nèi)誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞，其結(jié)果，受到樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的作用，在待測體內(nèi)具有抗癌性的淋巴細(xì)胞被全身性活化，發(fā)揮出癌免疫作用。因而，可將REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的DNA作為癌免疫活化劑來使用。進(jìn)一步地，由于經(jīng)REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞具有癌免疫作用，因而能夠?qū)EIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的DNA作為癌癥治療或預(yù)防用的藥物組合物(癌免疫治療劑)來使用。此時，REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的DNA可單獨(dú)進(jìn)行給藥，這種情況下，能夠癌種非特異性地發(fā)揮效果?；蛘咭部蓪⑵渑c特定腫瘤抗原一同進(jìn)行給藥。這種情況下，能夠癌種特異性地發(fā)揮效果。另外，在癌變進(jìn)展的組織內(nèi)，REIC/Dkk-3蛋白的濃度降 低，可認(rèn)為在癌組織內(nèi)難以誘導(dǎo)出抗癌免疫活性，生物體免疫錯過癌(癌細(xì)胞的免疫學(xué)耐受)，使癌增殖、惡化。由此表示，本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽不僅作為癌癥治療劑(抗癌劑、抗腫瘤劑)是有用的，而且作為基于抗癌免疫活化的癌變、致癌預(yù)防劑也是有用的。并且作為癌免疫療法制劑也是有用的。進(jìn)一步地，REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽、編碼該多肽的DNA和含有該DNA的載體具有分化誘導(dǎo)CTL(cytotoxic T lymphocyte ;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)、NK(Naturalkiller ；自然殺傷)細(xì)胞、輔助T細(xì)胞等免疫活化細(xì)胞的活性，還進(jìn)一步具有抑制MDSC(Myeloid derived suppressor cell ;髓源抑制細(xì)胞)及Treg細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的分化的活性。本發(fā)明的多肽能夠提高抗癌免疫活性、用于癌癥的治療中，能夠?qū)Π┌Y局部灶和轉(zhuǎn)移灶發(fā)揮出抗癌效果。具體地說，能夠通過促進(jìn)以樹突狀細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、CTL、NK細(xì)胞為代表的免疫活化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)來作為抗癌劑、抗腫瘤劑、抗癌免疫活化劑、全身免疫活化劑、免疫活化細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑、以及以MDSC、Treg為代表的免疫抑制系細(xì)胞的分化誘導(dǎo)抑制劑來進(jìn)行使用。對于作為本發(fā)明藥物的治療或預(yù)防對象的癌，可以舉出腦/神經(jīng)腫瘤、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴癌/白血病、結(jié)腸癌、胰腺癌、肛門/直腸癌、食道癌、子宮癌、乳腺癌、腎上腺癌、腎癌、腎盂輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、陰莖癌、睪丸癌、骨瘤/骨肉瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、間皮瘤等。特別優(yōu)選乳腺癌、膀胱癌。本發(fā)明的藥物含有編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA、含有該DNA的載體或該DNA所編碼的多肽；以及藥理學(xué)可容許的載體、稀釋劑或賦形劑。該用于癌癥的治療或預(yù)防的藥物可以以各種劑型進(jìn)行給藥，可以舉出利用片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等的口服給藥；或者利用注射劑(皮下注、靜注、肌注、腹腔內(nèi)注等)、點(diǎn)滴劑、栓劑、噴霧劑、滴眼劑、經(jīng)鼻給藥劑、經(jīng)皮給藥劑、經(jīng)粘膜給藥劑、經(jīng)肺給藥劑、粘附制劑等的非口服給藥。本發(fā)明的藥物可通過注射等進(jìn)行全身給藥，并且也可進(jìn)行局部給藥。例如，通過注射給藥到癌部位，可發(fā)揮出其效果。特別是在將含有編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA的載體進(jìn)行局部給藥的情況下，能夠在癌部位通過載體長期產(chǎn)生肽，從而發(fā)揮出效果O優(yōu)選對癌病變局部進(jìn)行I次或多次直接注入以使得該藥物遍及癌病變整體。本發(fā)明的藥物含有制劑領(lǐng)域中通常應(yīng)用的載體、稀釋劑、賦形劑。例如，對于片劑用載體，使用乳糖、硬脂酸鎂等作為賦形劑。作為注射用水性液，使用生理鹽水、含有葡萄糖或其它輔助藥的等滲液等，也可與適當(dāng)?shù)闹軇?例如醇、丙二醇等多元醇；非離子表面活性劑等)合用。作為油性液，使用芝麻油、大豆油等，作為助溶劑可合用苯甲酸芐酯、苯甲醇
坐寸O其給藥量根據(jù)癥狀、年齡、體重等不同而不同，可以隔數(shù)日或數(shù)周或數(shù)月給藥I次，每次通過皮下注射、肌肉注射、或者靜脈注射給藥0.0Olmg lOOmg。另外，在使用含有編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的DNA的載體的情況下，例如可以以載體給藥IO7 109pfu (plaque forming unit ;空斑形成單位)。對于罹患癌癥的癌患者中具有經(jīng)確認(rèn)對于抗癌劑治療等現(xiàn)有的各種治療具有抗性的癌病變的患者，本發(fā)明的藥物也是有效的。本發(fā)明的藥物經(jīng)單藥給藥也確認(rèn)到了癌細(xì)胞死亡、腫瘤縮小的效果。進(jìn)一步地，通過將本藥物與抗癌劑合用，抗癌作用經(jīng)雙重誘導(dǎo)，可期待較強(qiáng)的腫瘤縮小效果。進(jìn)一步地，由于 本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽、編碼該多肽的DNA和含有該DNA的載體具有抗癌免疫活性，因而其不僅對給藥后的癌局部、而且對癌轉(zhuǎn)移灶也具有治療效果，并且還可用于癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防。另外，通過將現(xiàn)有的各種癌抗原蛋白與本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽、編碼該多肽的DNA和含有該DNA的載體同時給藥，還能夠經(jīng)由樹突狀(樣)細(xì)胞等的分化誘導(dǎo)來系統(tǒng)地活化抗癌免疫，對致癌本身進(jìn)行預(yù)防。通過下述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。實(shí)施例1人REIC/Dkk-3蛋白的全長、以及部分區(qū)域I [Argl21_329]和部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]的制備將編碼成熟體REIC/Dkk-3蛋白的全長[Alal-1le329](樣品I)(序列編號2的第22位的Ala至第350位的lie)、以及編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域REIC[Argl21-1le329](樣品II)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(T7Express株=NEB社)中，將約10個左右的新鮮菌落在1.6升培養(yǎng)液中大量培養(yǎng)，向?qū)?shù)增殖期的培養(yǎng)液(A600 0.7)中添加0.5mM IPTG來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。表達(dá)誘導(dǎo)條件下在37°C進(jìn)行3小時培養(yǎng)，通過離心分離回收菌體。使用超聲波破碎等對該表達(dá)菌體進(jìn)行溶菌后，進(jìn)行離心分離，在不溶性級分中回收表達(dá)蛋白質(zhì)。為盡力除去混入到不溶性級分中的菌體來源的核酸，向分散在含有20mM Tris-HCl、pH8.0與5mM MgCl2的緩沖液中的不溶性級分中添加10unit/mL的Benzonase ( —種核酸酶，Novagen社)，在25°C溫育30分鐘,促進(jìn)核酸的分解。其后再次進(jìn)行離心分離，從而得到含有高純度REIC/Dkk-3蛋白的不溶性級分。接下來，將該沉淀充分懸浮、溶解在含有6M鹽酸胍的Tris-HCl緩沖液(pH8)中，添加IOOmM的2-巰基乙醇在37°C進(jìn)行I小時溫育，從而將蛋白質(zhì)完全還原。在此時，通過Bradford法對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行蛋白定量，利用重折疊緩沖液進(jìn)行稀釋，以使蛋白質(zhì)濃度的最終濃度為0.2mg/mL，在25°C進(jìn)行24小時溫育。重折疊時的緩沖液含有20mM Tris_HCl、pH8.0、0.4M鹽酸胍、30%甘油，預(yù)先對其進(jìn)行制備以使其組成中含有2-巰基乙醇(其包含在還原蛋白質(zhì)溶液中并摻入到重折疊緩沖液中)的1/4摩爾量的氧化型谷胱甘肽(Nacalai Tesque，INC.)。使用該組成，利用攪拌器充分?jǐn)嚢璧耐瑫r對還原的蛋白質(zhì)溶液立即進(jìn)行稀釋。在該氧化還原條件下進(jìn)行重折疊之后，使用填充有陰離子交換樹脂(DEAE-TOyOpearl650M、東曹)的柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的吸附，之后在20mM Tris-HCl、pH8.0緩沖液中利用氯化鈉的線性濃度梯度(O 0.8M)進(jìn)行洗脫，從而在氯化鈉濃度為0.5M左右的條件下回收REIC蛋白的峰級分。在該時刻，全長REIC[Alal-1le329](樣品I)以在分子間形成有二硫(SS)鍵的低聚物形式得到回收，因而進(jìn)一步添加30mM的二硫蘇糖醇(DTT)，在37°C溫育I小時，從而制成僅限制性還原分子間SS鍵的單體。在該限制性還原反應(yīng)后，立即利用調(diào)節(jié)至pH6.0的磷酸緩沖液或MES緩沖液進(jìn)行平衡化。使用S印hadex G25M柱色譜(GE HEALTHCARE社)進(jìn)行DTT的去除以及向PH6.0緩沖液的置換，從而將可在4°C穩(wěn)定保存數(shù)周的樣品回收。該階段得到的樣品為樣品I，可根據(jù)需要使用僅可透過分子量為IOkDa以下物質(zhì)的超濾過濾器進(jìn)行濃縮。通過上述步驟，利用陰離子交換色譜法將部分區(qū)域REIC[Argl21-1le329](樣品II)以穩(wěn)定單體的形式進(jìn)行分·離。為了進(jìn)一步進(jìn)行高純度精制，通過使用Resource-Q柱(GEHEALTHCARE社)等的陰離子交換HPLC利用氯化鈉的線性濃度梯度進(jìn)行洗脫，從而精制出高純度的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域REIC[Argl21-1le329]。將其利用經(jīng)pH7.4PBS平衡化的S印hadex G25M柱色譜進(jìn)行緩沖液置換，得到樣品II，根據(jù)需要使用僅可透過分子量為IOkDa以下物質(zhì)的超濾過濾器進(jìn)行濃縮。對于編碼REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域[Glyl84_Ile329](樣品III)的蛋白質(zhì)的制備，將表達(dá)用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Shuffle T7Express株:NEB社)中，將約10個左右的新鮮菌落在0.8升培養(yǎng)液中大量培養(yǎng)，向?qū)?shù)增殖期的培養(yǎng)液(A600 0.7)中添加0.5mM IPTG，從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。表達(dá)誘導(dǎo)條件下在30°C進(jìn)行16小時培養(yǎng)，通過離心分離回收菌體。使用超聲波破碎等對該表達(dá)菌體進(jìn)行溶菌后，進(jìn)行離心分離，在可溶性級分中回收表達(dá)蛋白質(zhì)。本實(shí)施例中所用的REIC蛋白[Glyl84-1le329]中，在N末端側(cè)添加有His標(biāo)簽序列，因而使用TALON金屬親和樹脂(Clontech社)進(jìn)行親和精制。為進(jìn)一步對其進(jìn)行高純度精制，通過使用Resource-Q柱(GE HEALTHCARE社)等的陰離子交換HPLC進(jìn)行精制，利用經(jīng)pH7.4PBS平衡化的S印hadex G25M柱色譜進(jìn)行緩沖液置換，得到樣品III。由氨基酸序列推測的分子量分別為:全長REIC/Dkk-3蛋白為37.5kDa、REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域I [Argl21-1le329]為26.9kDa、REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]為19.7kDa，利用基于SDS-PAGE的分析確認(rèn)到，其以單條帶的形式泳動到大致符合推測的分子量處。全長REIC/Dkk-3蛋白的氨基酸序列示于序列編號2中、REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域l[Argl21-1le329]的氨基酸序列示于序列編號5中、REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]的氨基酸序列示于序列編號3中。進(jìn)一步地，含有添加到它們中的His標(biāo)簽的序列示于序列編號11中。需要說明的是，REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域
I[Argl21-1le329]的氨基酸序列相當(dāng)于序列編號2所示的氨基酸序列的第142位至第350位氨基酸。圖1中示出了人REIC/Dkk-3蛋白的全長以及部分區(qū)域I [Argl21_329]和部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]的制備方法的概括圖。實(shí)施例2由外周血單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)人單核細(xì)胞的制備利用使用了 Ficoll-Paque離心分離的標(biāo)準(zhǔn)方法從健康供體的血液中進(jìn)行人PBMC(外周血單核細(xì)胞)的制備。利用臺盼藍(lán)排除法測定細(xì)胞的回收率，確認(rèn)到生存率為99%以上。為了制備單核細(xì)胞，將PBMC再懸浮于LGM-3培養(yǎng)基(淋巴細(xì)胞增殖培養(yǎng)基_3，不含血清，Lonza)中，將附著在塑料皿上的細(xì)胞(2小時，37°C，利用IOcm皿進(jìn)行溫育)作為單核細(xì)胞使用。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用⑶14+磁力活化細(xì)胞分選微珠(MACS ；MiltenyiBiotec)分離CD14+單核細(xì)胞。將精制后的CD14+單核細(xì)胞再懸浮于LGM-3培養(yǎng)基中。利用流式細(xì)胞儀，純度總是高于95%。人單核細(xì)胞的處理在單獨(dú)(無添加)、GM-CSF(R&D Systems) +IL-4 (R&D Systems)(分別為 2ng/ml)的存在下、或者實(shí)施例1中制備的人REIC/Dkk-3蛋白的全長的存在下、部分區(qū)域l[Argl21-1le329]的存在下或部分區(qū)域2 [Glyl84_Ile329] (10 μ g/ml)的存在下進(jìn)行PBMC的培養(yǎng)。細(xì)胞利用相位差顯微鏡進(jìn)行觀察。圖2 中示出了在單獨(dú)(無添加)、GM-CSF(R&D Systems)+IL-4 (R&D Systems)(分別為2ng/ml)的存在下、或者實(shí)施例1中制備的人REIC/Dkk-3蛋白的全長的存在下、部分區(qū)域l[Argl21-1le329]的存在下或者部分區(qū)域2 [Glyl84_Ile329] (10 μ g/ml)的存在下培養(yǎng)出的PBMC中在培養(yǎng)第7天時樹突狀細(xì)胞樣分化誘導(dǎo)的結(jié)果。圖2A表示無添加的結(jié)果，圖2B表示添加了 GM-CS F+IL-4的情況下的結(jié)果，圖2C表示添加了全長REIC/Dkk-3蛋白的情況下的結(jié)果，圖2D表示添加了 REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域I [Argl21_Ile329]的情況下的結(jié)果，圖2E表示添加了 REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]的情況下的結(jié)果。圖2示出了相位差顯微鏡像的低倍放大像。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，在REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2[Glyl84_Ile329]中確認(rèn)到了最強(qiáng)的由外周血單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性。圖3中示出了單獨(dú)(無添加)、添加有GM-CSF+IL-4的情況下、以及添加有REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]的情況下的分化誘導(dǎo)比較。圖3A示出了無添加的結(jié)果、圖3B示出了添加有GM-CSF+IL-4的情況下的結(jié)果、圖3C示出了添加有REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]的情況下的結(jié)果。圖3示出了相位差顯微鏡像的高倍放大像。REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2中，由外周血單核細(xì)胞分化誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上小于經(jīng)IL-4+GM-CSF誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞。另一方面，全長REIC/Dkk-3蛋白和REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域l[Argl21-1le329]所誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞與REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2所誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞之間未確認(rèn)到形態(tài)學(xué)上的差
巳圖4 示出了在單獨(dú)(無添加)、添加有 GM-CSF (R&D Systems)+IL-4 (R&D Systems)(分別為2ng/ml)、或者添加有人REIC/Dkk-3蛋白的全長、部分區(qū)域I [Argl21_Ile329]或部分區(qū)域2[Glyl84-1le329] (lOyg/ml)的情況下樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。在第7天，在手動攪拌3分鐘后，利用低倍放大照片的倍數(shù)隨機(jī)統(tǒng)計(jì)每一視野中的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)目，進(jìn)行圖表化(n=5視野)。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，在REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域2[Glyl84-1le329]中確認(rèn)到最強(qiáng)的由外周血單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性，與添加有全長REIC/Dkk-3蛋白的情況和添加有部分區(qū)域I [Argl21-1le329]的情況相t匕，確認(rèn)到了非常強(qiáng)的活性；進(jìn)一步地，與添加有GM-CSF+IL-4的情況相比，也確認(rèn)到了強(qiáng)活性。實(shí)施例3人REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的制備作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)用宿主細(xì)胞，使用處于對數(shù)增殖期的人腎臟來源細(xì)胞FreeStyle293-F 細(xì)胞(invitrogen 社)，將該細(xì)胞以 5 6X 105cells/mL 的濃度在 5OOmL燒瓶中播種180mL，準(zhǔn)備5個該燒瓶，在37°C、8%C02存在下，使用Freestyle293表達(dá)培養(yǎng)基(invitrogen社)進(jìn)行一夜振蕩培養(yǎng)(125rpm)。翌日調(diào)整成I X 106cells/mL的濃度,將編碼全長REIC [Alal-1le329]的基因高表達(dá)質(zhì)粒(下述)各180 μ g與293Fectin (invitrogen社)混合，對于在500mL燒瓶中播種了 180mL的293-F細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4天，在37°C、8%C02存在下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清。對于所回收的培養(yǎng)上清通過超濾進(jìn)行濃縮，使用S印hadex G25M柱色譜(GEHEALTHCARE社)將溶劑置換為20 mM Hepes緩沖液(pH7.2)，回收含有REIC蛋白的級分。其后使用陰離子交換柱色譜(DEAE-TOyOpearl650M，東曹)對蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附后，在20mMHepes緩沖液(pH7.2)中利用氯化鈉的線性濃度梯度(O 0.7M)進(jìn)行洗脫，在氯化鈉濃度為0.35M左右的條件下確認(rèn)到REIC蛋白的峰級分。由相比于該峰級分更多且更高純度地含有REIC蛋白的級分進(jìn)行REIC蛋白的回收。使用經(jīng)pH7.4PBS平衡化的Sephadex G25M柱色譜將該全長REIC[Alal_Ile329]蛋白的緩沖液置換為PBS之后，在37°C或者室溫下溫育5天，從而限制性分解為編碼REIC部分區(qū)域[Serll4-Phe267]的蛋白質(zhì)。使用Sephadex G25M柱色譜(GE HEALTHCARE社)將含有該REIC部分區(qū)域[Serll4-Phe267]的蛋白質(zhì)溶液中的溶劑置換為20mM Hepes緩沖液(pH7.2)，回收含有REIC蛋白的級分。其后使用陰離子交換柱色譜(DEAE-TOyOpearl650M，東曹)進(jìn)行蛋白質(zhì)的吸附后，在20mM !fepes緩沖液(pH7.2)中利用氯化鈉的線性濃度梯度(O 0.6M)進(jìn)行洗脫，在氯化鈉濃度為0.3M左右的條件下，確認(rèn)到REIC部分區(qū)域[Serll4-Phe267]蛋白的峰級分。由該峰級分回收的REIC部分區(qū)域[Serll4_Phe267]蛋白為樣品IV，根據(jù)需要使用僅透過分子量為IOkDa以下物質(zhì)的超濾過濾器進(jìn)行濃縮。圖5-1中示出了制備方案。并且，圖5-2中示出了第I次陰離子交換色譜的精制曲線圖(圖5-1的(3)陰離子交換色譜)，圖5-3中示出了第2次陰離子交換色譜(圖5-1的(4)陰離子交換色譜)的精制曲線圖。本實(shí)施例中所用的基因聞表達(dá)質(zhì)粒為含有具有特定結(jié)構(gòu)的表達(dá)盒的質(zhì)粒，通過可經(jīng)基因表達(dá)進(jìn)行表達(dá)的目的蛋白的超高表達(dá)可進(jìn)行大量生產(chǎn)。該表達(dá)用盒具有下述結(jié)構(gòu):至少在第I啟動子的下游具有含有所要表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因(所要表達(dá)的基因)和Poly A附加序列的DNA構(gòu)建體，進(jìn)一步在該構(gòu)建體的下游連接并含有增強(qiáng)子或第2啟動子。在表達(dá)用盒的最下游存在上述的增強(qiáng)子或第2啟動子，在其下游不具有其它基因表達(dá)用結(jié)構(gòu)。SP，本發(fā)明的表達(dá)用盒至少具有在I個第I啟動子與至少I個增強(qiáng)子之間夾著要表達(dá)的基因的結(jié)構(gòu)、或者在I個第I啟動子與I個第2啟動子之間夾著要表達(dá)的基因的結(jié)構(gòu)。此處，其它基因表達(dá)用結(jié)構(gòu)指的是用于表達(dá)上述要表達(dá)的基因以外的基因的結(jié)構(gòu)。作為啟動子，可以使用CMV i啟動子、SV40啟動子、hTERT啟動子、β肌動蛋白啟動子或CAG啟動子；作為增強(qiáng)子，可以使用CMV增強(qiáng)子、SV40增強(qiáng)子或hTERT增強(qiáng)子。并且，在啟動子的下游含有編碼所要表達(dá)的蛋白質(zhì)的DNA和Poly A附加序列的DNA構(gòu)建體的上游也可以連接I 4個CMV增強(qiáng)子。進(jìn)一步地，也可以含有:(i)連接在緊靠著編碼外來蛋白質(zhì)的DNA的上游的RU5’、( )連接在緊靠著增強(qiáng)子和/或啟動子的上游的UAS、或者(iii)連接在表達(dá)用盒的最上游的SV40-ori。所用質(zhì)粒中所含有的表達(dá)盒的構(gòu)造見圖9。實(shí)施例4基于人REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3 [Seri 14_Phe267]的由外周血單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)在實(shí)施例2所記載的方法中，制備人PBMC (外周血單核細(xì)胞)，在單獨(dú)(無添加)、實(shí)施例1中制備的人REIC/Dkk-3蛋白的全長和部分區(qū)域l[Argl21-1le329]、以及實(shí)施例3中制備的部分區(qū)域3[Serll4-Phe267] (lOyg/ml)的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞利用相位差顯微鏡進(jìn)行觀察。圖6中示出了單獨(dú)(無添加)、在實(shí)施例1中制備的人REIC/Dkk-3蛋白的全長的存在下以及實(shí)施例3中制備的部分區(qū)域3[Serll4-Phe267] (10yg/ml)的存在下培養(yǎng)出的PBMC中在培養(yǎng)第7天時樹突狀細(xì)胞樣分化誘導(dǎo)的結(jié)果。圖6A示出了無添加的情況下的結(jié)果，圖6B示出了添加有全長REIC/Dkk-3蛋白的情況下的結(jié)果，圖6C示出了添加有REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3[Serll4-Phe267]的情況下的結(jié)果。圖6示出了相位差顯微鏡像的低倍放大像。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，REIC/Dkk-3部分區(qū)域3確認(rèn)到了與全長、部分區(qū)域I相比為同等或其以上的誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性。圖7中示出了高倍放大像。如圖7所示，REIC/Dkk-3部分區(qū)域3中的由外周血單核細(xì)胞分化誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞與部分區(qū)域I中分化誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞未確認(rèn)到形態(tài)學(xué)上的差異。實(shí)施例5REIC/Dk k_3部分區(qū)域3的穩(wěn)定性使用SDS-PAGE對18 μ L的在37°C或室溫(約20 V )溫育5天后的樣品進(jìn)行分離，通過CBB染色檢測出分子量約17kDa的編碼REIC/Dkk-3的部分區(qū)域3的蛋白質(zhì)。此時，在室溫(約20°C )或37°C放置5天，進(jìn)一步實(shí)施SDS-PAGE，確認(rèn)降解模式。SDS-PAGE的結(jié)果見圖8。盡管作為蛋白質(zhì)的保存條件為高溫，部分區(qū)域3也可以在SDS-PAGE分離后通過CBB染色檢測出約17kDa的條帶。另外可知，對于部分區(qū)域3的蛋白質(zhì)溶液，在投入、混合各種PEG、硫化銨-硫化鋰等鹽、2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)-乙醇-2-丙醇等醇類時，也未顯示出聚集、沉淀等反應(yīng)。從而判斷出部分區(qū)域3的穩(wěn)定性足夠高。實(shí)施例6基于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域3 [Serll4_Phe267]的腫瘤抑制效果測定將RENCa細(xì)胞(I X IO6)注射到小鼠(BALB/c，雌性，n=5)的皮下。在注入后第3、
5、7、10、12和14天(將注入后第3天作為全長REIC蛋白和部分區(qū)域3的給藥起始)向小鼠腹腔注入全長REIC蛋白(IOOygdOOy I))或部分區(qū)域3(100μ gdOOy I))或作為對照的PBSdOOy I)。在第17天確認(rèn)皮下腫瘤中的治療效果，進(jìn)行抗癌免疫活性的測定(實(shí)施例7)，對小鼠處以安樂死。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方案如圖10所示。腫瘤體積按照0.52X (最小直徑)2X(最大直徑)來求得。圖1lA中示出了治療后腫瘤體積的經(jīng)時變化。對于進(jìn)行了全長REIC蛋白、部分區(qū)域3給藥的治療組的腫瘤體積與作為對照的PBS給藥組的腫瘤體積進(jìn)行比較可知，其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減小(以*表示)。圖1lB中示出了由小鼠中取出的腫瘤的重量。對于進(jìn)行了全長REIC蛋白、部分區(qū)域3給藥的治療組的腫瘤重量與PBS給藥組的腫瘤重量進(jìn)行比較可知，其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減小(以*表示)。圖1lC中示出了由小鼠中取出的腫瘤的照片。如圖1lA 圖1lC所示，通過全長REIC蛋白和部分區(qū)域3的給藥，抑制了腫瘤增殖。實(shí)施例7實(shí)施例6的小鼠靜脈血中的免疫活性細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)通過流式細(xì)胞術(shù)對于實(shí)施例6中得到的小鼠靜脈血中存在的免疫活性細(xì)胞的變化進(jìn)行分析。由下腔靜脈采血，向所采集的小鼠血液750 μ I中加入0.2%EDTA溶液30 μ I進(jìn)行抗凝處理。向30 μ I血液中加入由eBioscience社購入的進(jìn)行了不同熒光標(biāo)記的下述各抗體I μ I并進(jìn)行攪拌，在4°C進(jìn)行60分鐘溫育，從而進(jìn)行下述所示免疫活性細(xì)胞的染色。骨髓來源免疫抑制細(xì)胞(抗GR-1抗體，抗⑶I Ib抗體)
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樹突狀細(xì)胞(抗⑶11抗體)活性型樹突狀細(xì)胞(⑶IIc+/⑶80+)(抗⑶IIc抗體，抗⑶80抗體)活性型樹突狀細(xì)胞(⑶IIc+/⑶86+)(抗⑶IIc抗體，抗⑶86抗體)輔助T細(xì)胞(抗⑶4抗體)免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(抗⑶4抗體、抗Foxp3抗體)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(抗⑶8抗體)活性型細(xì)胞毒性T細(xì)胞(抗⑶69抗體、抗⑶8抗體)NK細(xì)胞(抗CD3e抗體，抗NKl.1抗體)其后，利用紅細(xì)胞裂解緩沖液對紅細(xì)胞進(jìn)行溶解處理，利用PBS對細(xì)胞進(jìn)行2次清洗，再懸浮于PBS200y I中，制成分析用細(xì)胞液。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson),米集 3X IO4 個細(xì)胞,利用 CellQuest 軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行分析。基于這些細(xì)胞的特征性前向角散射圖案設(shè)定適當(dāng)?shù)臇艠O，僅對柵極內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果，對于全長REIC蛋白和部分區(qū)域3，幾乎在全部的免疫活化細(xì)胞中確認(rèn)到了分化誘導(dǎo)活性(圖12B、C、D、E、G、H、I)。還觀察到了免疫抑制系細(xì)胞的分化誘導(dǎo)抑制(圖12A、F)。特別觀察到部分區(qū)域3對于細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的分化誘導(dǎo)優(yōu)異(圖12G、H)、并且觀察到對免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的強(qiáng)大的分化抑制(圖12F)。由以上結(jié)果可判斷出，含有部分區(qū)域3的蛋白質(zhì)可作為抗癌免疫活化劑、抗癌劑、抗腫瘤劑、免疫細(xì)胞分化誘導(dǎo)/抑制劑進(jìn)行應(yīng)用，含有部分區(qū)域3的全長REIC蛋白也可同樣地進(jìn)行應(yīng)用。實(shí)施例8使用腎細(xì)胞癌模型小鼠的全長REIC蛋白的抗腫瘤效果實(shí)驗(yàn)通過使Luciferase基因在RENCA細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá)來進(jìn)行制作小鼠腎細(xì)胞癌細(xì)胞RENCA-Luc細(xì)胞株。為了通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對于REIC蛋白的腫瘤抑制效果進(jìn)行研究，使用該RENCA-Luc細(xì)胞株制作腎細(xì)胞癌模型小鼠。為了制作原位腫瘤，利用耐波他(Nembutal)對雄性BALB/C小鼠進(jìn)行麻醉后，向左腎局部注入RENCA-Luc細(xì)胞(IO3ceIls)。其后立即由尾靜脈注入IO4ceIls,制成具有肺轉(zhuǎn)移灶的腎細(xì)胞癌小鼠模型(DayO)。對于對照組、治療組進(jìn)行下述處置。
A:連日(13天)進(jìn)行計(jì)13次的PBS (100 μ I)腹腔內(nèi)給藥B:連日(13天)進(jìn)行計(jì)13次的REIC蛋白(10 μ g/100 μ I PBS)腹腔內(nèi)給藥C:連日(13天)進(jìn)行計(jì)13次的REIC蛋白(100 μ g/100 μ I PBS)腹腔內(nèi)給藥給藥開始后第14天(Dayl4)對小鼠施以安樂死，分析所摘出腫瘤的腫瘤尺寸、重量。如圖14A所示,相對于無處置和緩沖液給藥組,確認(rèn)到REIC蛋白給藥組的腫瘤縮小。暗示出該腫瘤縮小效果隨著REIC蛋白的給藥量而變得顯著(圖14B)。并且對于肺轉(zhuǎn)移灶也同樣確認(rèn)到腫瘤的縮小(圖15A、B)。實(shí)施例9使用小鼠骨髓細(xì)胞的分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)由無處置的正常小鼠采集骨髓，利用吸液管進(jìn)行懸浮，采用平底6孔培養(yǎng)板進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)。翌日利用PBS進(jìn)行2次清洗，將附著的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過GM-CSF (20ng/ml,由R&D Systems社購入)單獨(dú)添加、或進(jìn)而添加全長REIC蛋白(10 μ g/ml)來分析REIC蛋白對于骨髓來源免疫抑制細(xì)胞(MDSC)分化誘導(dǎo)的抑制效果。在小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)開始后第6天，通過胰島素處理回收細(xì)胞，使用抗MDSC的表面抗原標(biāo)記物GR-l，Q)llb的抗體進(jìn)行細(xì)胞染色。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)對3 X IO4個細(xì)胞進(jìn)行分析。在無處置的情況下，MDSC的比例為2.56%，與此相對，在GM-CSF給藥的情況下，MDSC的比例增加至53.04%(圖16A、B)。這意味著，GM-CSF促進(jìn)了 MDSC的分化誘導(dǎo)、抑制了免疫活性能力。將GM-CSF與全長REIC蛋白這兩者混合的情況下，與GM-CSF單獨(dú)的情況相比，MDSC的分化誘導(dǎo)為低程度(34.71%)。該結(jié)果意味著，REIC蛋白對于MDSC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)具有抑制性作用，發(fā)揮出了免疫活化能力。實(shí)施例10實(shí)施例8的小鼠靜脈血中的免疫活性細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)通過流式細(xì)胞術(shù)對于實(shí)施例8中得到的小鼠靜脈血中的免疫活性細(xì)胞比例進(jìn)行分析。與實(shí)施例7同樣地由下腔靜脈采血，向所采集的小鼠外周血750 μ I中加入0.2%EDTA溶液30 μ I進(jìn)行抗凝處理。向30 μ I血液中加入由eBioscience社購入的進(jìn)行了不同突光標(biāo)記的下述各抗體I μ I并進(jìn)行攪拌，在4°C進(jìn)行60分鐘溫育，從而進(jìn)行下述所示各免疫活性細(xì)胞的染色。骨髓來源免疫抑制細(xì)胞(抗GR-1抗體，抗⑶I Ib抗體)活性型樹突狀細(xì)胞(⑶IIc+/⑶80+)(抗⑶IIc抗體，抗⑶80抗體)免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(抗⑶4抗體、抗Foxp3抗體)活性型細(xì)胞毒性T細(xì)胞(抗⑶69抗體、抗⑶8抗體)NK細(xì)胞(抗CD3抗體，抗NKl.1抗體)其后，利用紅細(xì)胞裂解緩沖液對紅細(xì)胞進(jìn)行溶解處理，利用PBS對細(xì)胞進(jìn)行2次清洗，再懸浮于PBS200y I中，制成分析用細(xì)胞液。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson),米集 3X IO4 個細(xì)胞,利用 CellQuest 軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行分析?；谶@些細(xì)胞的特征性前向角散射圖案設(shè)定適當(dāng)?shù)臇艠O，僅對柵極內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果示于圖17A E。對于樹突狀細(xì)胞(圖17B-1和B-2)、活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL、圖17D-1和D-2)、NK細(xì)胞(圖17E-1和E-2)，可知陽性率隨著REIC蛋白的給藥量而提高。這些免疫活性細(xì)胞均對免疫活性發(fā)揮出促進(jìn)功能。進(jìn)一步可知，在對免疫系發(fā)揮出抑制性作用的MDSC (圖17A-1和A-2)、Tre g (圖17C-1和C-2)中，陽性率隨著REIC蛋白的給藥量而降低。根據(jù)上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)REIC蛋白具有通過減弱免疫抑制系統(tǒng)來活化免疫系統(tǒng)的功能。已知生物體微環(huán)境中的免疫功能的降低可促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生、增殖，免疫抑制系統(tǒng)細(xì)胞的產(chǎn)生和誘導(dǎo)是免疫功能降低的主要原因。因而，REIC蛋白和表達(dá)該蛋白質(zhì)的DNA載體可作為免疫抑制的抑制劑以抗癌劑、抗腫瘤劑、抗癌免疫活化劑、免疫活性細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的形式進(jìn)行應(yīng)用。實(shí)施例11基于酵母雙雜交法(Y2H:Yeast2hybrid法)的REIC蛋白與Tctex-Ι相互作用分析酵母雙雜交法中，使用ProQuest雙雜交系統(tǒng)(Invitrogen, Carlsbad, CA)。人REIC/Dkk-3的全長cDNA利用下述所示的2條引物DNA進(jìn)行擴(kuò)增。正向:5’-ACGCGTCGACCATGCAGCGGCTTGGGGCCAC-3’(序列編號 12)反向:5’-TTCCTTTTTTGCGGCCGCTAAATCTCTTCCCCTCCCA-3’(序列編號 13)將擴(kuò)增的cDNA插入到誘餌載體pDBLeu的SalI與NotI酶切位點(diǎn)之間，導(dǎo)入到酵母MaV203株中。接著分離出REIC/Dkk-3表達(dá)克隆體，轉(zhuǎn)化到克隆在pPC86 (Invitrogen)中的人心臟cDNA文庫中?；?qū)氤晒Φ目寺◇w利用添加有半乳糖苷酶底物的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行回收?；?qū)搿①|(zhì)粒分離、DNA構(gòu)造體的確認(rèn)以及、酵母裂解液的制備參考Invitrogen的操作指南。為了鑒定REIC/Dkk-3的相互作用配對物，以REIC/Dkk-3蛋白為誘餌，通過酵母雙雜交法實(shí)施篩選。由于REIC/Dkk-3的表達(dá)在小鼠或人的心臟組織中增強(qiáng)，因而篩選以正常心組織的人cDNA文庫為對象。在活化報(bào)告基因的克隆體之中，有4個克隆體培養(yǎng)成功。通過質(zhì)粒拯救法由這些克隆體分離、回收插入基因，再次進(jìn)行基因?qū)?，利用?bào)告基因選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果如圖18A所示。在圖18A中，在含有Tctex-1的右部區(qū)域中觀察到了藍(lán)色菌落。藍(lán)色菌落表明了 REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的相互作用(締合)。該結(jié)果暗示出，Tctex-1為REIC/Dkk-3的相互作用配對物(圖18A)。實(shí)施例12基于免疫沉降、Western印跡的REIC-Tctex-l相互作用分析為了通過免疫沉降法進(jìn)行結(jié)合配對物的確認(rèn)，將REIC/Dkk-3或Tctex-1的人全長cDNA 插入到 pcDNA3.1/Myc-His (-)A 或 pcDNA3.2/V5/GW/D-T0P0 質(zhì)粒(Invitrogen)中，進(jìn)行克隆。為進(jìn)行瞬時基因的表達(dá)，使用Lipofectamine2000將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入到293T細(xì)胞中。向293T細(xì)胞中同時導(dǎo)入添加Myc-tag的REIC/Dkk-3或添加V5標(biāo)簽的Tctex-1，在基因?qū)牒?48 小時將 293T 細(xì)胞裂解，加入緩沖液(20mM Tris - HCl, ρΗ7.5，l%Triton X-100, 150mMNaCl, 5mM EDTA,以及 Complete 蛋白酶抑制劑混合物(Roche, Basel, Switzerland))。向細(xì)胞裂解液中添加小鼠來源非特異性IgG抗體(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA) Img進(jìn)行溫育,添加蛋白G瓊脂糖凝膠(Invitrogen) 1ml、或者抗Myc小鼠來源單克隆抗體(Invitrogen，Cat.N0.R95025)。在4°C溫育12小時后，清洗沉降物，利用溶解有SDS的緩沖液煮沸。針對沉淀物使用小鼠來源V5單克隆抗體(Invitrogen，Cat.N0.R96025)進(jìn)行Western印跡法。為了確認(rèn)REIC/Dkk-3與Tctex-1的相互作用，通過免疫沉降法實(shí)施體外下拉實(shí)驗(yàn)分析(pull down assay)。使用表達(dá)Myc_REIC/Dkk_3融合蛋白的293T細(xì)胞裂解液實(shí)施V5-Tctex-1融合蛋白的結(jié)合分析。與 Tctex-1的結(jié)合通過使用V5抗體的Western印跡法進(jìn)行檢測。對于Tctex-1與REIC/Dkk3-蛋白的結(jié)合，向同時導(dǎo)入了 REIC/Dkk-3與Tctex-1的細(xì)胞裂解液中加入Myc抗體，由所得到的免疫沉降樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖18B所示。實(shí)施例11和12的結(jié)果示出了，通過酵母雙雜交與免疫沉降法這兩者證明、再現(xiàn)了 REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白的相互作用。實(shí)施例13利用哺乳動物雙雜交法(M2H)進(jìn)行REIC蛋白的Tctec-1結(jié)合區(qū)域分析為了實(shí)施哺乳類細(xì)胞雙雜交分析，將編碼各種氨基酸長度的REIC/Dkk-3的cDNA導(dǎo)入到pM GAL4DNA結(jié)合域的克隆用質(zhì)粒中，進(jìn)一步將編碼全長Tctex-1的cDNA導(dǎo)入到pVP16轉(zhuǎn)錄活性域的克隆質(zhì)粒(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)中。各氨基酸長度的人REIC/Dkk-3的模板通過使用適當(dāng)引物對的PCR法進(jìn)行了生成、擴(kuò)增。Tctex-1全長cDNA利用如下所示引物進(jìn)行擴(kuò)增。正向5’ -CCGGAATTCATGGAAGACTACCAGGCTGC-3’(序列編號 14)反向5’ -GGGAAGCTTTCAAATAGACAGTCCGAAGG-3’(序列編號 15) 向約2X105 個 293T 細(xì)胞中同時進(jìn)行 400ng pVP16、400ng pM、250ng pFR-Luc 螢火蟲來源熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(Promega，Madison, WI)、IOng phRL-TK海腎來源熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(Promega)的基因?qū)搿M(jìn)行了導(dǎo)入的該細(xì)胞進(jìn)行48小時培養(yǎng)，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(Promega)對熒光素酶活性進(jìn)行測定。對于導(dǎo)入效率的差異所致的誤差，測定phRL-ΤΚ基因?qū)胨碌暮Ｎ瀬碓礋晒馑孛富钚詠磉M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了探索在與Tctex-1的相互作用中為重要的REIC/Dkk_3的部分區(qū)域，利用哺乳類細(xì)胞雙雜交法對于REIC/Dkk-3與Tctex-1的相互作用進(jìn)行分析。對于同時導(dǎo)入了 GAL4質(zhì)粒(導(dǎo)入有各氨基酸長度的REIC/Dkk-3的cDNA)與VP16質(zhì)粒(導(dǎo)入有全長Tctex-1的cDNA)的293T細(xì)胞的裂解液進(jìn)行熒光素酶活性測定，在確認(rèn)到活性的情況下，判斷REIC/Dkk-3的各部分區(qū)域與Tctex-1結(jié)合。結(jié)果可知，由20 146氨基酸殘基構(gòu)成的REIC/Dkk-3的部分區(qū)域作為與Tctex-1結(jié)合的區(qū)域是重要的。另外可知，具有其以上的氨基酸長度的REIC/Dkk-3部分區(qū)域與Tctex-1的結(jié)合活性低(圖19A)。為了進(jìn)一步挑出REIC/Dkk-3與Tctex-1結(jié)合的區(qū)域，階梯性縮短REIC/Dkk-3的部分區(qū)域。在具有20-146氨基酸的REIC/Dkk-3與20-157氨基酸殘基的部分區(qū)域檢測出了顯示與Tctex-1結(jié)合的熒光素酶活性。由20-135氨基酸殘基構(gòu)成的部分區(qū)域僅確認(rèn)到微弱的活性。這些結(jié)果暗示出，REIC/Dkk-3與Tctex-1的相互作用與由136-157氨基酸殘基構(gòu)成的REIC/Dkk-3的部分區(qū)域相關(guān)(圖19B)。圖20A中示出了 REIC蛋白與動力蛋白中間鏈(DIC)的TcTex-1結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列比對。其他研究小組報(bào)告了屬于動力蛋白輕鏈蛋白的Tctex-1與動力蛋白中間鏈(DIC)的部分區(qū)域[12°SDSELGRRLHKLGVSKVTQVDFL142](序列編號 16)的結(jié)合。REIC/Dkk-3 的Tctex-ι 結(jié)合區(qū)域?yàn)閇136Vgdeegrrsheciidedcgpsm157](序列編號 17)。通過與Dic的Tctex-1結(jié)合區(qū)域的序列比較，可知其共有序列為[-E-X-G-R-R-X-H-] (X表示任意的天然氨基酸)(序列編號18)。圖20B中示出了 REIC蛋白的Tctex-1結(jié)合域與已知Tctex-Ι結(jié)合蛋白的氨基酸序列比對。Tctex-1結(jié)合蛋白的氨基酸序列基序[-R/K-R/K-X-X-R/K-] (X表示任意的天然氨基酸)(序列編號20)。REIC/Dkk-3的結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列中，僅含有[-RR-]的基序是一致的，與Tctex-1的其它結(jié)合配對物的基序相比，其是具有特征性的。實(shí)施例14REIC/Dkk_3蛋白與Tctex-1的細(xì)胞內(nèi)定位模式的分析通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共染色進(jìn)行0UMS24細(xì)胞中的REIC/Dkk-3與Tctex-1的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。在24孔板上，在30 40%匯合的條件對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)一步利用4%多聚甲醛、IOOmM磷酸鹽緩沖液對細(xì)胞進(jìn)行固定，利用生理鹽水與3%BSA進(jìn)行封閉處理。對于細(xì)胞添加兔子來源抗REIC/Dkk-3多克隆抗體(利用生理鹽水200倍稀釋)、或者兔子來源抗Tctex-1多克隆抗體(100稀釋,Santa Cruz Biotechnology, sc-28537),在室溫下溫育2小時,進(jìn)一步加入添加有Alexa488綠色突光色素的兔子來源2次抗體,溫育I小時。為了檢測出在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分布，向細(xì)胞中添加帶有Alexa546紅色突光色素的刀豆球蛋白A(MolecularProbes),在室溫下溫育15分鐘。根據(jù)在各種分析系統(tǒng)中揭示的REIC/Dkk-3與Tctex-1的相互作用，對于這2種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的共定位進(jìn)行分析。據(jù)報(bào)告，REIC/Dkk-3不僅定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，而且還定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而我們最近的研究證明，在REIC/Dkk-3蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中，REIC/Dkk-3蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。因此，為了確認(rèn)REIC/Dkk-3蛋白與Tctex-1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位，使用添加有熒光色素的刀豆球蛋白A(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位標(biāo)記蛋白)實(shí)施雙重免疫熒光染色法。圖21A為人成纖維細(xì)胞0UMS24中的人全長REIC蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物刀豆球蛋白A雙重?zé)晒馊旧墓簿劢癸@微鏡照片。紅(圖21A-a的明亮部分)表示刀豆球蛋白A、綠(圖21A-b的明亮部分)表示全長REIC蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與全長REIC蛋白的重疊區(qū)域以黃色(圖21A-C的明亮部分)表示(重疊像)。圖21B為人成纖維細(xì)胞0UMS24中的Tctex-1蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物刀豆球蛋白A雙重?zé)晒馊旧墓簿劢癸@微鏡照片。紅(圖21B-a的明亮部分)表示刀豆球蛋白A、綠(圖21B_b的明亮部分)表示Tctex-1蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與Tctex-1蛋白的重疊區(qū)域以黃色(圖21A-C的明亮 部分)表示(重疊像)。圖21A和圖21B的重疊像中，大部分被黃色染色。即，如所期待那樣，REIC/Dkk-3 (圖21A)與Tctex-1 (圖21B)均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中定位、這些蛋白質(zhì)在正常成纖維細(xì)胞0UMS24的細(xì)胞內(nèi)的定位模式是一致的。即，可判斷出，REIC/Dkk-3與Tctex-1均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周邊、并且REIC/Dkk-3的相互作用配對物為Tctex-10實(shí)施例15Tctex-l作為REIC凋亡誘導(dǎo)能力促進(jìn)因子的功能的分析腺病毒REIC/Dkk-3 (Ad-REIC)的制作如下實(shí)施。將REIC/Dkk-3的全長cDNA插入到粘粒載體PAxCAwt中，進(jìn)一步通過COS-TPC法(Takara Bio,滋賀，日本)進(jìn)行腺病毒載體導(dǎo)入。導(dǎo)入有LacZ基因的腺病毒載體(Ad-LacZ)作為比較對象使用。凋亡分析法如下述所示。為了驗(yàn)證各處理后的體外凋亡誘導(dǎo)率，將PC3前列腺癌細(xì)胞利用6孔平底培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時。對于培養(yǎng)后的PC3細(xì)胞添加GFP表達(dá)質(zhì)粒(Clonetech)、Tctex-1 表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.2/V5/GW/D-T0P0)、或者 Tctex-1-sh-RNA 質(zhì)粒(sc-43319-SH, Santa Cruz Biotechnology),在6小時后進(jìn)行培養(yǎng)基交換?；?qū)胫惺褂肍uGENE HD (Roche)。GFP質(zhì)粒的基因?qū)胄试谫|(zhì)粒添加后48小時為60%以上。在GFP表達(dá)質(zhì)?；?qū)?24 小時后，添加 Ad_LacZ、Ad-REIC50M0I (multiplicity of infection,感染復(fù)數(shù))，利用無血清培養(yǎng)基反應(yīng)2小時后，進(jìn)行培養(yǎng)基交換。進(jìn)一步進(jìn)行48小時培養(yǎng)后，向培養(yǎng)基中添加2 μ g/ml的Hoechst33342溶液，在暗室中靜置10分鐘。Hoechst33342為用于總?cè)旧|(zhì)含量評價與染色質(zhì)凝聚檢測的嵌合劑。通過熒光顯微鏡觀測高度凝聚或斷裂的細(xì)胞核，鑒定出凋亡誘導(dǎo)所產(chǎn)生的死細(xì)胞。在5點(diǎn)不同的顯微鏡像中計(jì)測凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)目。每I點(diǎn)顯微鏡像中對100個細(xì)胞進(jìn)行判定。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測如下實(shí)施。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。2組間使用Student’ s不成對T檢驗(yàn)進(jìn)行檢測，在P值低于0.05的情況下，判斷兩者的差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。為了驗(yàn)證Tctex-1對于REIC/Dkk-3的凋亡誘導(dǎo)能力的功能，使用本發(fā)明人通過以往的研究確立的基于REIC/Dkk-3的過表達(dá)的凋亡誘導(dǎo)模型，該模型使用了人前列腺癌細(xì)胞PC3與Ad-REIC。根據(jù)Western印跡分析的結(jié)果，PC3表達(dá)內(nèi)源性Tctex-1蛋白，另一方面，其不表達(dá)REIC/Dkk-3蛋白。圖22A中示出了基于Hoechst33342的凋亡分析結(jié)果。在該分析結(jié)果中，在給與了 Ad-REIC的PC3中產(chǎn)生了凋亡，但在Ad-LacZ中未產(chǎn)生(圖22A、箭頭)。圖22A表示Ad-REIC的凋亡誘導(dǎo)能力隨著Tctex-1的表達(dá)減少而減弱、隨其表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng)。Ad-REIC給藥組中的凋亡誘導(dǎo)率在GFP質(zhì)粒、shRNA-Tctex-l、Tctex-l表達(dá)質(zhì)粒各給藥組中分別為30%、15%、75%(圖22B)。即暗示出，Ad-REIC的凋亡誘導(dǎo)能力隨著Tctex-1的表達(dá)減少而減弱、隨其表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng)?？芍c給與了 Ad-REIC的GFP質(zhì)粒處置組相比，shRNA-Tctex-Ι處置組中的凋亡誘導(dǎo)率降低。另外可知，Tctex-1表達(dá)質(zhì)粒促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)。該結(jié)果暗示出，Tctex-1的表達(dá)水平與使用Ad-REIC的REIC/Dkk-3的過表達(dá)所致的凋亡誘導(dǎo)呈正相關(guān)。即，可得出Tctex-1促進(jìn)REIC/Dkk-3的凋亡誘導(dǎo)的結(jié)論。工業(yè)實(shí)用性與IL-2、以往已知的多種具有免疫活性作用的細(xì)胞因子組、以及全長REIC/Dkk-3蛋白相比，本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽具有下述效果:(I)即使單藥使用，也具有基于抗癌免疫活化的抗腫瘤效果；(2)由于REIC/Dkk-3基因表達(dá)在多種癌種中有缺失、降低這一REIC/Dkk-3蛋白本身的特性，REIC/Dkk-3蛋白制劑對于廣泛的癌種是有效的；(3)通過基于REIC/Dkk-3蛋白的抗癌免疫活化，能夠期待其不僅對經(jīng)給藥的癌局部、而且對癌轉(zhuǎn)移灶也有改善、預(yù)防的作用；以及(4)通過將 現(xiàn)有的各種癌抗原蛋白與本制劑同時給藥，能夠經(jīng)由樹突狀(樣)細(xì)胞等的分化誘導(dǎo)來系統(tǒng)地活化抗癌免疫、可對致癌本身進(jìn)行預(yù)防。進(jìn)一步地，本發(fā)明REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域多肽的尺寸也較小，因而也容易生產(chǎn)，且可低成本地進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明的REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域可作為癌免疫療法制劑使用，對于癌癥的預(yù)防、治療是有用的。序列表的自由內(nèi)容序列編號11合成序列編號12 15弓丨物序列編號16 28合成本說明書中引用的全部出版物、專利和專利申請直接作為參考并入到本說明書中。
權(quán)利要求
1.一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽,其為下述(a) (e)的任意一種: (a)一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽，其由選自由序列編號3、序列編號5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域； (b)一種具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，其是由在選自由序列編號3、序列編號5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列中有一個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列構(gòu)成的多肽蛋白質(zhì)，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域； (c)一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽，其是由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽，其由序列編號17所表示的氨基酸序列構(gòu)成； (d)一種與Tctex-1蛋白具有結(jié)合活性的多肽，其是由在序列編號17所表示的氨基酸序列中有一個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列構(gòu)成的多肽；以及 (e)一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽，該多妝含有序列編號18所表不的共有序列，由7 22殘基的氣基酸構(gòu)成。
2.一種編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA，其為下述(f) (I)的任意一種； (f)一種DNA，其由選自由序列編號4、序列編號6、序列編號8和序列編號10所示的堿基序列、以及由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列組成的組中的堿基序列構(gòu)成，該部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，且所述部分序列的片段含有由序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列； (g)一種DNA，其與由下述堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，所述堿基序列與選自由序列編號4、序列編號6、序列編號8和序列編號10所示的堿基序列、以及由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列組成的組中的堿基序列互補(bǔ)，該部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，且所述部分序列的片段含有由序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列； (h)—種DNA，其由在選自由序列編號4、序列編號6、序列編號8和序列編號10所示的堿基序列、以及由下述的部分序列的片段構(gòu)成的堿基序列組成的組中的堿基序列中有一個或數(shù)個堿基發(fā)生了缺失、取代或添加的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，所述部分序列由序列編號I所示的堿基序列的第403位的t至第1050位的t構(gòu)成，且所述部分序列的片段含有由序列編號I所示的堿基序列的第613位的g至第864位的c構(gòu)成的部分序列； (i)一種DNA，其由編碼下述氨基酸序列的DNA序列構(gòu)成且編碼具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，所述氨基酸序列選自由序列編號3、序列編號5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域； (j) 一種DNA，其編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽，該DNA由下述堿基序列構(gòu)成，該堿基序列由序列編號8所表示的堿基序列的第4位的g至第69位的g構(gòu)成； (k) 一種DNA，其與由下述堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼與Tctex-1蛋白具有結(jié)合活性的多肽，所述堿基序列與由序列編號8所表示的堿基序列的第4位的g至第69位的g構(gòu)成的堿基序列互補(bǔ)；以及 (I)一種DNA，其由編碼序列編號17所表示的氨基酸序列的DNA序列構(gòu)成、且編碼與Tctex-1蛋白具有結(jié)合活性的多肽，所述氨基酸序列是由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的、能夠與Tctex-1蛋白結(jié)合的多肽。
3.一種載體,其含有權(quán)利要求2所述的DNA。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其中，載體為腺病毒載體。
5.一種單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其含有權(quán)利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。
6.一種免疫活化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑，所述免疫活化細(xì)胞選自由樹突狀細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、CTL和NK細(xì)胞組成的組，所述分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑含有權(quán)利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。
7.一種免疫抑制功 能系細(xì)胞的分化誘導(dǎo)抑制劑，所述免疫抑制功能系細(xì)胞為MDSC或Treg，所述分化誘導(dǎo)抑制劑含有權(quán)利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。
8.一種抗癌劑，其含有權(quán)利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽作為有效成分。
9.一種單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑，其含有權(quán)利要求2所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者權(quán)利要求3或4所述的載體作為有效成分。
10.一種免疫活化細(xì)胞的分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑，所述免疫活化細(xì)胞選自由樹突狀細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、CTL和NK細(xì)胞組成的組，所述分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑含有權(quán)利要求2所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者權(quán)利要求3或4所述的載體作為有效成分。
11.一種免疫抑制系細(xì)胞的分化誘導(dǎo)抑制劑，所述免疫抑制系細(xì)胞為MDSC或Treg，所述分化誘導(dǎo)抑制劑含有權(quán)利要求2所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者權(quán)利要求3或4所述的載體作為有效成分。
12.一種抗癌劑，其含有權(quán)利要求2所述的編碼由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的DNA或者權(quán)利要求3或4所述的載體作為有效成分。
13.一種誘導(dǎo)CD14陽性單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，該方法包括在體夕卜、在權(quán)利要求1所述的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽的存在下對由動物采集的單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
14.如權(quán)利要求13 所 述的方法，其中，單核細(xì)胞為外周血單核細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供可強(qiáng)力誘導(dǎo)、活化樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞并可通過免疫療法進(jìn)行癌癥的治療或預(yù)防的多肽；以及編碼該多肽的DNA，所述多肽為下述(a)或(b)的由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽(a)一種由REIC/Dkk-3蛋白的部分區(qū)域構(gòu)成的多肽，其由選自由序列編號3、序列編號5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域；(b)一種具有單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)活性的多肽，其是由在選自由序列編號3、序列編號5、序列編號7和序列編號9所示的氨基酸序列、以及由下述部分區(qū)域的片段構(gòu)成的多肽的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列中有一個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了取代、缺失或者添加的氨基酸序列構(gòu)成的多肽蛋白質(zhì)，所述部分區(qū)域由序列編號2所示的氨基酸序列的第135位的Ser至第350位的Ile構(gòu)成，所述部分區(qū)域的片段含有由序列編號2所示的氨基酸序列的第205位的Gly至第288位的Phe構(gòu)成的部分區(qū)域。
文檔編號C07K14/47GK103080309SQ20118004160
公開日2013年5月1日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月1日
發(fā)明者公文裕巳, 渡部昌實(shí), 二見淳一郎, 藤井康之, 植木英雄, 落合和彥 申請人:國立大學(xué)法人岡山大學(xué), 桃太郎源株式會社