專利名稱：抗vegfr-3抗體組合物的制作方法
抗VEGFR-3抗體組合物本發(fā)明涉及與血管內(nèi)皮生長因子受體-3(VEGFR-3)特異性結(jié)合的抗體，特別地本文中提供了抗VEGFR-3抗體的氨基酸序列和核酸序列、藥物組合物和所述抗體在治療VEGFR-3介導(dǎo)的醫(yī)學(xué)疾病的方法中的用途。認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子和受體主要負(fù)責(zé)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長、分化以及某些細(xì)胞功能。一個廣泛研究的生長因子家族包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。VEGFR-3是在正常成年組織中的表達(dá)主要限于淋巴內(nèi)皮的唯一受體酪氨酸激酶(RTK)。新生兒VEGF-C和VEGF-D與VEGFR-3特異性結(jié)合。這些蛋白質(zhì)的N端和C端區(qū)域的蛋白酶剪切釋放了成熟的VEGF-Can,。和VEGF-Dan,。，它們獲得增加的VEGFR-3親和力。這些配體激活VEGFR-3信號傳導(dǎo)并且引發(fā)淋巴管生成(即新淋巴管從先前存在的淋巴管中形成)。VEGFR-3配體的表達(dá)模式顯不，它們不僅參與正常血管系統(tǒng)的發(fā)育和維持，還參與腫瘤血管生成和淋巴管生成。另外，已經(jīng)在腫瘤內(nèi)部的毛細(xì)血管上檢測到VEGFR-3表達(dá)。因此，抑制VEGF-C和/或VEGF-D與VEGFR-3結(jié)合的單克隆抗體(mAb)具有抑制腫瘤血管生成的潛力。此外，阻斷VEGFR-3活性已經(jīng)顯示抑制VEGF-C增強(qiáng)的腫瘤淋巴管生成。在許多類型的癌癥中，第一轉(zhuǎn)移位點(diǎn)是淋巴結(jié)并且因此阻斷VEGFR-3具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的潛力。Persaud 等人，J.Cell Science 117:2745-56(2004)描述人抗 VEGFR-3 單克隆抗體的某些特性，但是沒有公開任何這類抗體的序列，也沒有公開這類抗體可以結(jié)合的表位。因此仍需要結(jié)合VEGFR-3內(nèi)部的新表位并且能夠阻斷配體結(jié)合和受體活化的高親和力抗VEGFR-3抗體。還需要能夠針對多種腫瘤類型顯示抗腫瘤功效而沒有明顯不利副作用的抗VEGFR-3 抗體。本發(fā)明提供了與人VEGFR-3結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中:a)所述抗體與人VEGFR-3的結(jié)合因人VEGFR-3的Pro-219單突變成Leu減少至少90% ;和b)所述抗體與人VEGFR-3的結(jié)合因人VEGFR-3的Val_175單突變成Ala減少至少50%。優(yōu)選地，通過以下方式測定該抗體或其抗原結(jié)合片段和人或突變VEGFR-3之間的結(jié)合水平:將人或突變VEGFR-3的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域表達(dá)為具有堿性磷酸酶的融合蛋白并且隨后使用堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光測定法確定能夠與抗體結(jié)合的每種融合蛋白的量。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。此外， 本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑并且任選地含有至少一種其他治療成分。本發(fā)明也提供本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分作為藥物使用。本發(fā)明額外地提供本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分用于治療或預(yù)防卵巢癌、人紅白血病、頭頸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動物中卵巢癌、人紅白血病、頭頸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括向需要這類治療的哺乳動物施用有效量的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明額外地提供本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分用于制造藥物的用途，其中所述藥物用于治療選自卵巢癌、人紅白血病、頭頸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌癥。本發(fā)明也提供本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與選自順鉬、5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬和多西紫杉醇的其他抗癌藥組合，用于在治療中同時、分別或依次使用。本發(fā)明額外地提供了治療哺乳動物中選自卵巢癌、人紅白血病、頭頸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分和選自順鉬、5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬和多西紫杉醇的其他抗癌藥的治療有效組合。本發(fā)明的抗體結(jié)合哺乳動物VEGFR-3的第二免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域。人VEGFR-3的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于全長受體的殘基138至226。見Pajusola等人，CancerRes.52:5738-5743(1992)。術(shù)語“哺乳動物/人/小鼠VEGFR-3的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域”(及其變種)意在包括天然存在形式的結(jié)構(gòu)域(例如，從正常條件下表達(dá)該結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞純化)以及重組形式，例如，由天然存在或合成性點(diǎn)突變體或其截短形式編碼的重組形式。本發(fā)明的抗體結(jié)合人VEGFR-3的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域中的表位，其中P219是該表位的主要組分，V175是該表位的從屬組分并且L221是該表位的次要組分。(這些殘基的編號與全長人VEGFR-3—致，如上文Pajusola等人和EMBL數(shù)據(jù)庫(登錄號X68203)中所報道)。這個研究結(jié)果部分地基于以下觀察:在人VEGFR-3中包含突變V175A或P219L或L221V (即置換直向同源的鼠VEGFR-3殘基)消除或顯著地減少本發(fā)明抗體與突變體人VEGFR-3的結(jié)合。另外，結(jié)合人VEGFR-3中表位(其中P219是該表位的主要組分，V175是該表位的從屬組分并且L221是該表位的次要組分)的本發(fā)明抗體能夠阻斷配體VEGF-C與VEGFR-3的結(jié)合并且因此抵消該受體的活性。因而，本發(fā)明提供了在人VEGFR-3上的新穎中和表位，其允許產(chǎn)生針對人VEGFR-3的新的中性抗體，所述中性抗體能夠阻斷人VEGF-C與該受體的結(jié)合。本發(fā)明因此提供人VEGFR-3的表位，其中P219是該表位的主要組分，V175是該表位的從屬組分并且L221是該表位的次要組分。本發(fā)明也提供了抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合包含氨基酸殘基P219和V175的人VEGFR-3表位。優(yōu)選地，本發(fā)明也提供了抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合包含氨基酸殘基P219、V175和L221的人VEGFR-3表位。這種表位由本發(fā)明的抗體(例如抗體I)結(jié)合，并且因此，本發(fā)明也提供與人VEGFR-3的相同表位反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，如具有下述輕鏈和重鏈的抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列，所述重鏈包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列。與人VEGFR-3的相同表位反應(yīng)的抗體如本發(fā)明的某些抗體(例如抗體I)將競爭與人VEGFR-3結(jié)合，并且因此，本發(fā)明也提供與具有下述輕鏈和重鏈的抗體競爭結(jié)合至人VEGFR-3的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述輕鏈包含SEQ ID N0:15的氨基酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體也與具有SEQ ID NO:20中所示序列的突變小鼠VEGFR-3 (其包含突變L219P)和具有SEQ ID NO:21中所示序列的突變小鼠VEGFR-3 (其包含突變A175V)結(jié)合，其中與野生型小鼠VEGFR-3(SEQ ID NO:19)的結(jié)合相比較時，與具有SEQ ID NO:20中所示序列的突變小鼠VEGFR-3的結(jié)合增加多于50倍，并且與野生型小鼠VEGFR-3的結(jié)合相比較時，與具有SEQ ID NO:21中所示序列的突變小鼠VEGFR-3的結(jié)合增加多于10倍。優(yōu)選地，通過以下方式測定該抗體或其抗原結(jié)合片段和野生型小鼠或突變小鼠VEGFR-3之間的結(jié)合水平:將野生型小鼠或突變小鼠VEGFR-3的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域表達(dá)為具有堿性磷酸酶的融合蛋白并且隨后使用堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光測定法確定能夠與抗體結(jié)合的每種融合蛋白的量。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分具有針對人VEGFR-3的高親和力。例如，對人VEGFR-3具有1X10_9M和5.6X 10_nM之間的Kd的抗體或其抗原結(jié)合部分，如在BIACORE 2000生物傳感器上在20°C通過表面等離子體共振法測量。更優(yōu)選地，這種抗體或其抗原結(jié)合部分對人VEGFR-3具有ΙΧΙΟ,Μ和5.6 X 10_ηΜ之間的Kd，如在BIACORE 2000生物傳感器上在20°c通過表面等離子體共振測量。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了抗VEGFR-3抗體或其抗原結(jié)合部分，其以2nM和1.3nM之間的IC5tl抑制人VEGF-CaNaC與人VEGFR-3結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了抗VEGFR-3抗體或其抗原結(jié)合部分，其以IOnM和5nM之間的IC5tl抑制VEGF-C,n,。刺激的促有絲分裂反應(yīng)。更優(yōu)選地，這種抗VEGFR-3抗體或其抗原結(jié)合部分在如實施例5中所述的測定法中以8nM和5nM之間、最優(yōu)選地以6nM和5nM之間的IC5tl抑制VEGF-Can^刺激的促有絲分裂反應(yīng)。優(yōu)選地，本發(fā)明 提供結(jié)合人VEGFR-3并且包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述LCVR包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)LCDRl、LCDR2和LCDR3 并且 HCVR 包含 CDRHCDR1、HCDR2 和 HCDR3，其中 LCDRl 包含 SEQ ID NO:1 的氨基序列，LCDR2 包含 SEQ ID NO:2 的多肽，LCDR3 包含 SEQ ID NO:3 的多肽，HCDRl 包含 SEQ IDNO:6的氨基序列，HCDR2包含SEQ ID NO:7的多肽，并且HCDR3包含SEQ ID NO:8的多肽。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人VEGFR-3并且包含SEQID NO:5 的 LCVR 多肽和 SEQ ID NO:10 的 HCVR0更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了結(jié)合人VEGFR-3并且包含以下輕鏈和重鏈的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述重鏈包含SEQ ID N0:16的多肽。仍更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了結(jié)合人VEGFR-3并且包含以下兩條輕鏈和兩條重鏈的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述兩條輕鏈包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述兩條重鏈包含SEQ ID NO:16 的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了與本發(fā)明抗體競爭結(jié)合人VEGFR-3的抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了抗體或其抗原結(jié)合部分，其為人抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了抗體或其抗原結(jié)合部分，其為人工程化抗體。定義
如本文所用的術(shù)語“抗體”意指可以是完全人抗體或人工程化抗體的單克隆抗體，以及其消化片段、指定部分和變體，包括抗體模擬物、模以抗體的結(jié)構(gòu)和/或功能的抗體部分或其指定片段或部分，包括保留與人VEGFR-3的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力的單鏈抗體及其片段。例如，由本發(fā)明包括的能夠特異性結(jié)合人VEGFR-3第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域的抗體片段包括Fab片段(例如，通過木瓜蛋白酶消化)、Facb片段(例如，通過纖溶酶消化)、F(ab' )2片段(例如通過胃蛋白酶消化)和通過分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的二硫鍵穩(wěn)定的可變片段(dsFv)或單鏈可變片段(scFv)?？贵w片段也意在包括，例如，保留與人VEGFR-3第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力的結(jié)構(gòu)域缺失抗體、雙體抗體(diabodies)和三體抗體(triabodies)?？贵w包括了包含4條多肽鏈(由二硫鍵相互連接的兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L))的免疫球蛋白分子。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為HCVR)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)含有3個結(jié)構(gòu)域:CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為LCVR)和輕鏈恒定區(qū)。來自任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可以基于其恒定域的氨基酸序列劃分成兩個明顯獨(dú)特的類型(稱作K和λ)之一。如本文中所用，表述LCVR意在包括來自K型輕鏈的可變區(qū)(Vk)和來自λ型輕鏈的可變區(qū)(νλ)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域CL。HCVR和LCVR區(qū)包括序列高變區(qū)，命名為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其間插有更保守的區(qū)域，命名為構(gòu)架區(qū)(FR)。每個HCVR和LCVR由從氨基端至羧基端按以下順序:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列的3個CDR和4個FR組成。出于本發(fā)明的目的，LCVR CDR 縮寫為 LCDRl，LCDR2 和 LCDR3，且 HCVR CDR 縮寫為 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。取決于抗體重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體可以劃分成不同的“類別”。存在5個主要類別的完整抗體:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類別中的幾種可以進(jìn)一步劃分成“亞類”(同種型)，例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。與不同抗體類別相對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、Λ、ε、Y和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。本發(fā)明包括落入前述類別或亞類(同種型)中任意者范圍內(nèi)的抗體。如本文所用，“單克隆抗體”指從基本上同質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，例如，構(gòu)成這個群體的各個抗體是基本上相同的，除了可能存在的可能天然存在的突變或少數(shù)翻譯后變化之外。單克隆抗體是 高度特異的，針對單個抗原位點(diǎn)(也稱作決定簇或表位)，如本文中教導(dǎo)，所述抗原位點(diǎn)包含于哺乳動物VEGFR-3的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域中。另外，與一般包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾語“單克隆的”指示該抗體的特征為從基本上均一的抗體群體獲得，并且不得解釋為通過任何特定方法產(chǎn)生該抗體。如本文中所用，“人抗體”指這樣的抗體，它們具有與人種系免疫球蛋白序列相對應(yīng)的可變區(qū)和恒定區(qū)(如 Kabat 等人,(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (目的免疫蛋白質(zhì)的序列)，第 5 版，U.S.Department of Health and HumanServices, NIH Publication N0.91-3242中所述)。如本文所用，術(shù)語“人抗體”不意在包括其中從另一個哺乳動物物種(如小鼠)的種系衍生的CDR序列已經(jīng)移植到人構(gòu)架序列上的抗體。本發(fā)明的范圍內(nèi)包括對如本文中公開的抗體I的氨基酸序列的修飾，特別地與改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)特性相聯(lián)系的情況下。在本上下文中，如本文所用，術(shù)語“人工程化抗體”指額外的抗體，所述抗體具有與抗體I相似的功能特性(例如在包含P219和V175的表位結(jié)合人VEGFR-3的能力)并且具有基本上是人的或完全是人的衍生自抗體I的在CDR周圍的構(gòu)架區(qū)。在本發(fā)明的情境下，基本上人的構(gòu)架是與抗體I的構(gòu)架區(qū)具有至少80%序列同一性的那些。優(yōu)選地，這類基本上的人構(gòu)架與抗體I的構(gòu)架區(qū)具有至少約85%、約90%、約95%或約99%序列同一性。WO 2007/044411中描述了人種系序列。例如，種系輕鏈構(gòu)架可以選自:A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L15、L6、L8、012、02 和 08 并且種系重鏈構(gòu)架區(qū)可以選自:VH2_5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH1-18、VH1-69、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5-51。衍生自抗體I的人工程化抗體可以包括從抗體I的序列內(nèi)部缺失殘基和/或?qū)埢迦朐撔蛄泻?或置換該序列中的殘基。然而，最終構(gòu)建體必須保留抗體I的所需功能特征(例如，在包含P219和V175的表位結(jié)合人VEGFR-3的能力)?？梢允褂脦追N不同的方法產(chǎn)生與抗體I具有相似功能特性的人工程化抗體，其中每種方法始于抗體I (即，具有分別如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:10中所示LCVR和HCVR序列的抗體)作為模板或親本抗體以產(chǎn)生額外的抗體。在第一方法中，將抗體I的CDR移植入與抗體I構(gòu)架區(qū)具有高度序列同一性的不同人構(gòu)架。新構(gòu)架的序列同一性通常將與抗體I中的相應(yīng)構(gòu)架至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一。這種移植可以導(dǎo)致與抗體I相比結(jié)合親 和力降低。如果情況是這樣，可以基于由Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88,2869(1991)發(fā)表的特定標(biāo)準(zhǔn)，將這個構(gòu)架在某些位置回復(fù)突變成抗體I的構(gòu)架?？梢匀缦聦嵤┛紤]用于回復(fù)突變的殘基的鑒定:當(dāng)氨基酸落入以下標(biāo)準(zhǔn)的任一項時，正在使用的人種系序列的構(gòu)架氨基酸(接納體構(gòu)架)由來自抗體I構(gòu)架(供體構(gòu)架)的構(gòu)架氨基酸替換:(a)對于人構(gòu)架在這個位置，接納體構(gòu)架的人構(gòu)架區(qū)中的氨基酸是不常見的，而對于人構(gòu)架在這個位置，抗體I中的相應(yīng)氨基酸是常見的。(b)該氨基酸的位置緊鄰于⑶R之一；或(c)構(gòu)架氨基酸的任一側(cè)鏈原子處于三維免疫球蛋白模型中CDR氨基酸的任一原子的約5-6埃(中心至中心)范圍內(nèi)。當(dāng)接納體構(gòu)架的人構(gòu)架區(qū)中的每一氨基酸和抗體I構(gòu)架中的相應(yīng)氨基酸對于人構(gòu)架在那個位置處均是不常見時，這個氨基酸可以由對于人構(gòu)架在那個位置常見的氨基酸替換。這些回復(fù)突變標(biāo)準(zhǔn)能夠恢復(fù)抗體I的活性。在第二方法中，可以通過突變抗體I的⑶R(隨機(jī)方式或以偏倚方式以避開氨基酸代碼簡并性)，同時保留抗體I的構(gòu)架區(qū)而產(chǎn)生衍生自抗體I的保留抗體I的功能特性(例如在包含P219和V175的表位結(jié)合人VEGFR-3的能力)的人工程化抗體。優(yōu)選地，與抗體I的CDR序列相比較時，在衍生自抗體I的人工程化抗體CDR的氨基酸序列中的突變(缺失、插入和/或置換)限于人工程化抗體的CDR序列中最多3個突變、更優(yōu)選地2個突變或最優(yōu)選地單個突變。在多于一個突變存在的情況下，突變可以按多種不同方式在CDR序列分布。例如，全部突變可以在單個CDR序列(例如LCDR1)中出現(xiàn)，每個突變可以處于不同的CDR序列中或兩個突變可以存在于一個CDR序列中并且第三突變存在于另一個CDR序列中。這導(dǎo)致產(chǎn)生人工程化抗體的組合文庫,其中CDR序列在如上文所述的一個或多個位置突變，同時保留抗體I的構(gòu)架區(qū)?？梢詫υ撐膸旌Y選與抗體I相比具有相似或改進(jìn)功能特性的額外變體。又一種產(chǎn)生衍生自抗體I (并且保留抗體I的功能特性，例如，在包含P219和V175的表位結(jié)合人VEGFR-3的能力)的人工程化抗體的方法是組合上文描述的兩種方法并且在構(gòu)架和⑶R 二者中產(chǎn)生變化。換而言之，將抗體I的⑶R移植入不同構(gòu)架后，除了在⑶R中產(chǎn)生變化之外，還可以將特定構(gòu)架殘基回復(fù)突變。在Wu等人.(1999)，J.Mol.Biol.294:151-162中描述這種方法學(xué)的一般原理。氨基酸變化也可以改變?nèi)斯こ袒贵w的翻譯后過程，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置?？梢酝ㄟ^置換抗體I的一個或多個高變區(qū)殘基產(chǎn)生置換變體。這樣一種用于產(chǎn)生此類置換性變體的方法已知為使用噬菌體展示的親和力成熟法。將幾個高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個位點(diǎn))突變以便在每個位點(diǎn)產(chǎn)生全部可能的氨基酸置換。將如此產(chǎn)生的抗體變體以單價形式從絲狀噬菌體粒子中展示為與每個粒子內(nèi)部包裝的M13的基因III產(chǎn)物的融合物。隨后如本文中所公開那樣，對噬菌體展示的變體篩選它們的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。本文中公開的測定法可以用來篩選衍生自抗體I的人工程化抗體以鑒定那些具有如本文中公開的具有體外和體內(nèi)功能的抗體。本發(fā)明的抗體可以是分離的抗體。分離的抗體基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化
^ 口 PFt ο如本文所用，術(shù)語“表位 ”指抗原表面上的特定分子區(qū)域，所述分子區(qū)域能夠引發(fā)免疫反應(yīng)并且與這種反應(yīng)產(chǎn)生的特異性抗體結(jié)合。表位可以是線性表位(即由均含于單一短序列段內(nèi)部的連續(xù)氨基酸殘基組成)或它可以是構(gòu)象表位(即由這樣的氨基酸殘基組成，所述氨基酸殘基處于抗原的線性序列的不同部分中，但是一旦抗原采取其適宜的二級和三級結(jié)構(gòu)時被聚攏以形成抗體結(jié)合位點(diǎn))。通常，表位由少數(shù)(例如2至5個)關(guān)鍵氨基酸殘基構(gòu)成，并且這些殘基的破壞(例如通過突變成不同的氨基酸殘基)導(dǎo)致抗原和該表位之間的結(jié)合明顯減少或甚至完全消除。與本文中公開的分子“競爭”的抗體或其抗原結(jié)合片段是在與本發(fā)明分子結(jié)合的位點(diǎn)相同或重疊的位點(diǎn)結(jié)合人VEGFR-3的那些抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢岳缤ㄟ^抗體競爭測定法鑒定競爭性人工程化抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，純化或部分純化的人VEGFR-3的樣品與固相支持物結(jié)合。隨后添加本發(fā)明的抗體和測試單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中測試抗體或本發(fā)明的抗體是經(jīng)標(biāo)記的。如果標(biāo)記的抗體和未標(biāo)記的抗體與VEGFR-3上獨(dú)立和分開的位點(diǎn)結(jié)合，則標(biāo)記的抗體將以相同的水平結(jié)合，不論疑似的競爭抗體是否存在。然而，如果相互作用位點(diǎn)是相同或重疊的，則未標(biāo)記的抗體將競爭并且與抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體的量將減少。如果未標(biāo)記的抗體過量存在，則標(biāo)記的抗體將不結(jié)合。出于本發(fā)明的目的，競爭性人工程化抗體或其抗原結(jié)合片段是減少本發(fā)明抗體的結(jié)合約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%的那些。用于實施這類競爭測定法的方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域熟知的并且可以在例如Harlow和Lane (1988) Antibodies:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, NewYork，第567-569頁，ISBN 0-87969-314-2中找到。此類測定法可以通過使用純化的抗體定量地進(jìn)行。通過針對自身滴定一種抗體建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即，將相同的抗體用作標(biāo)記物和競爭物。滴定未標(biāo)記的競爭性單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段抑制標(biāo)記分子與平板結(jié)合的能力。將結(jié)果作圖并且比較為實現(xiàn)所需結(jié)合抑制程度而必需的濃度。人VEGFR-3以兩種形式存在，這由長度不同的mRNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生。與較短轉(zhuǎn)錄物編碼的蛋白質(zhì)相比較時，較長的轉(zhuǎn)錄物編碼在C末端含有65個額外氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，而較長的蛋白質(zhì)是組織中檢測到的主要形式。這兩種變體在它們的N端胞外結(jié)構(gòu)域是相同的。除非另外聲明，否則術(shù)語“人VEGFR-3”指衍生自備選mRNA轉(zhuǎn)錄物的野生型人VEGFR-3的兩種變體(即 SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18)?？贵wI的LCVR區(qū)的核酸和相應(yīng)的氨基酸序列分別命名為SEQ ID NOS:4和5。抗體I的HCVR區(qū)的核酸和相應(yīng)的氨基酸序列在本文中分別命名為SEQ ID NOS:9和10?？贵wI的輕鏈的核酸和相應(yīng)的氨基酸序列在本文中分別命名為SEQ ID NOS:11和
12。SEQ ID NO: 12的氨基酸殘基1-19構(gòu)成從多種哺乳動物宿主細(xì)胞系中表達(dá)和提取輕鏈?zhǔn)怯杏玫?，但在成熟抗體中不存在的分泌序列?？贵wI的成熟輕鏈的氨基酸序列在本文中命名為 SEQ ID NO:15o抗體I的重鏈的核酸和相應(yīng)的氨基酸序列分別命名為SEQ ID NOS:13和14。如輕鏈的序列那樣，SEQ ID NO:14的氨基酸殘基1-19構(gòu)成從多種哺乳動物宿主細(xì)胞系中表達(dá)和提取重鏈?zhǔn)怯杏玫?，但在成熟抗體中不存在的分泌序列?？贵wI的成熟重鏈的氨基酸序列在本文中命名為SEQ ID NO:16ο可以基于親和力和/或親合力確定抗體的特異性。親和力，由抗原與抗體的解離平衡常數(shù)(Kd)代表，度量抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合強(qiáng)度。親合力是抗體與其抗原之間結(jié)合作用強(qiáng)度的度量。親合力與表位和抗體上其抗原結(jié)合位點(diǎn)之間的親和力及抗體的價態(tài)有關(guān)，其 中所述的價態(tài)指特定表位的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目。Kd的值越小，抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合強(qiáng)度越強(qiáng)。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明抗體的重鏈的多核苷酸(例如抗體1-SEQ ID NO:13)或包含本發(fā)明抗體(例如抗體I)的任一個VH區(qū)或其部分或任一個VH CDR(包括其任何變體)的多核苷酸。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明抗體的輕鏈的多核苷酸(例如抗體1-SEQ IDNO:11)或包含本發(fā)明抗體(例如抗體I)的任一個VL區(qū)或其部分或任一個VH⑶R(包括其任何變體)的多核苷酸。本發(fā)明也包括表達(dá)載體，其包含本文所述的任一多核苷酸。示例性載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、病毒和噬菌體核酸或能夠在原核或真核宿主如細(xì)胞(例如，哺乳動物細(xì)胞)中復(fù)制的其他核酸分子。常見的表達(dá)載體含有用于調(diào)節(jié)本發(fā)明核酸分子的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子。載體可以也含有遺傳表達(dá)盒，所述遺傳表達(dá)盒含有獨(dú)立的終止子序列、允許載體在真核生物和原核生物二者中的復(fù)制的序列(即，穿梭載體)和用于原核和真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。載體一般含有標(biāo)記物以提供用于選擇轉(zhuǎn)化宿主的表型性狀，如賦予抗生素(如氨芐青霉素或新霉素)耐藥性。合適的啟動子包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。代表性表達(dá)控制序列/啟動子包括Iac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、tac系統(tǒng)、trc系統(tǒng)、噬菌體λ的主要操縱基因和啟動子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、酵母糖酵解啟動子，例如，3-磷酸甘油酸激酶啟動子、酵母酸性磷酸酶啟動子(例如，Pho5)、酵母α交配因子的啟動子、源自人巨細(xì)胞病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺瘤病毒啟動子、羅斯肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和猿猴病毒的啟動子(例如，SV40早期和晚期啟動子)。本發(fā)明也包括含有本發(fā)明多核苷酸或載體的非人宿主如細(xì)胞?！八拗鳌币庵阜侨祟惗嗉?xì)胞生物或“宿主細(xì)胞”，其指向其中導(dǎo)入本發(fā)明多核苷酸或載體的細(xì)胞或細(xì)胞群體。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或細(xì)胞系，如植物、動物、脊椎動物、哺乳動物、嚙齒類、小鼠、靈長類或人細(xì)胞或細(xì)胞系。合適的真核細(xì)胞包括酵母和其他真菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、人細(xì)胞和動物細(xì)胞，包括哺乳動物細(xì)胞，如雜交瘤系、COS細(xì)胞、NSO細(xì)胞和CHO細(xì)胞。“宿主細(xì)胞群”意指可以將本發(fā)明多核苷酸或載體向其中導(dǎo)入并表達(dá)的培養(yǎng)的細(xì)胞群落。構(gòu)想了將支持從本發(fā)明多核苷酸或載體中表達(dá)的任何宿主細(xì)胞。本發(fā)明的宿主也可以是原核的。合適的原核宿主包括例如大腸桿菌(E.coli)，如大腸桿菌SG-936、大腸桿菌HB101、大腸桿菌W3110、大腸桿菌X1776、大腸桿菌X2282、大腸桿菌DHI和大腸桿菌MRC1、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus),如枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。本發(fā)明也包括產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法，所述方法需要培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞表達(dá)編碼本發(fā)明抗體的一個或多個多核苷酸，并且從培養(yǎng)基中回收抗體?？梢允褂帽景l(fā)明的抗體作為人類醫(yī)學(xué)中的藥物，通過多種途徑施用。最優(yōu)選地，包含本發(fā)明抗體的藥物組合物用于腸胃外施用。這類藥物組合物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備(見，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版(1995),A.Gennaro等人,Mack Publishing C0.)并且包含如本文中公開的抗體和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。如本文所用，就本發(fā)明抗體的生物活性而言，術(shù)語“抑制”或“中和”意指基本上拮抗、禁止、防止、阻止、減慢、破壞、消除、停止、減少或逆轉(zhuǎn)人VEGFR-3的生物活性(包括但不限于如本文實施例4或5中所度量的人VEGFR-3生物活性)的能力。 如本文所用，術(shù)語“治療”或“療法”指治療性治療，其中目的是防止或減緩(減輕)與疾病或病癥相關(guān)的不想要的生理學(xué)變化。有益或所需的臨床結(jié)果包括癥狀減輕、疾病或病癥的程度減弱、疾病或病癥的穩(wěn)定(即，其中疾病或病癥沒有加重)、延遲或減緩疾病或病癥的進(jìn)展、疾病或病癥的改善或緩和、疾病或病癥的消退(無論是局部或總體消退)，無論是可檢測的或不可檢測的。“治療”也可以意指與如果沒有接受治療的預(yù)期存活相比，延長存活。那些需要治療的患者包括已經(jīng)患有這種疾病或病癥的那些以及易于患有這種疾病或病癥的那些患者。本發(fā)明的組合物可以包含“治療有效量”的本發(fā)明抗體?！爸委熡行Я俊敝敢孕枰膭┝亢蜁r間段有效實現(xiàn)所需治療結(jié)果的量?？贵w的治療有效量可以根據(jù)多種因素如疾病狀態(tài)、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中引發(fā)所需反應(yīng)的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量，其中抗體或抗體部分的任何有毒或有害作用被治療有益作用超過。療法可以是“一線的”，即，作為未曾接受過先前抗癌治療的患者中的初始治療，其單獨(dú)或與其他治療組合；或“二線的”，作為已經(jīng)接受過先前抗癌治療方案的患者中的治療，其單獨(dú)或與其他治療組合；或 作為“三線”、“四線”治療等，其單獨(dú)或與其他治療組合。療法可以給予已經(jīng)接受過先前治療的患者，所述治療已經(jīng)部分獲得成功，但是對于這個特定治療是不耐受的。療法可以也作為輔助治療給予，即，以防止癌癥在當(dāng)前未檢測到疾病或在手術(shù)摘除腫瘤后的患者中復(fù)發(fā)。由本發(fā)明治療的癌包括原發(fā)腫瘤和已經(jīng)通過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤(包括從肺、乳腺或前列腺轉(zhuǎn)移的那些)?？梢灾委煹陌┌ㄎ囱芑蚧旧衔囱芑哪[瘤，以及血管化的腫瘤。癌可以包含非實體瘤(如白血病和淋巴瘤)或可以是實體瘤。待用本發(fā)明抗體治療的癌癥的類型包括卵巢癌、人紅白血病、頭頸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌和結(jié)腸癌。另外，鑒于VEGF-C/VEGFR-3途徑在促進(jìn)淋巴管生成中的作用并且鑒于對大部分類型的癌癥而言，第一轉(zhuǎn)移部位是淋巴結(jié)，故阻斷VEGF-C/VEGFR-3途徑預(yù)期將抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，例如從乳腺癌、胰腺癌、胃癌或結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移(Roberts等人，Cancer Res.，66(5)，2650-2657(2006))。抗體可以單獨(dú)施用(單藥療法)或與一種或多種治療有效的藥物或療法組合(聯(lián)合療法)。其他治療有效的藥物可以與抗體綴合、并入與抗體相同的組合物或可以作為分別的組合物施用。其他治療有效的藥物或療法可以在施用抗體之前、在其期間和/或在其后施用?？梢允┯闷渌委煛び行У乃幬镆栽鲞M(jìn)抗體的治療作用或以減弱抗體的不利副作用。本文中所述的治·療方法可以用來治療任一合適的哺乳動物，包括靈長類如猴和人、馬、奶牛、貓、犬、兔和嚙齒類如大鼠和小鼠。在一個實施方案中，待治療的哺乳動物是人。通過參考以下實施例將看到，抗體I結(jié)合人VEGFR-3上的表位，所述表位包含P219作為表位的主要組分，包含V175作為表位的從屬組分并且包含L221作為表位的次要組分。另外，可以見到，抗體2 (針對鼠VEGFR-3產(chǎn)生的參比大鼠單克隆抗體)結(jié)合鼠VEGFR-3上包含殘基L219和V221的表位。此外，這些實施例也顯示抗體I對人VEGFR-3具有高親和力(56pM)，能夠阻斷配體VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合，能夠阻斷VEGF-C刺激的促有絲分裂反應(yīng)并且在卵巢癌和HEL的體內(nèi)異種移植模型中有效。最后，也可以見到，抗體2在頭頸癌、乳腺癌、肺癌、RCC、胰腺癌和結(jié)腸癌的異種移植模型中有效。實施例1可以使用本領(lǐng)域熟知的多種合適的方法產(chǎn)生并純化本發(fā)明的抗體。例如，將適宜的宿主細(xì)胞(如HEK 293EBNA或CH0)用分泌抗體的使用最佳的預(yù)定輕鏈對重鏈載體比率的表達(dá)系統(tǒng)或編碼輕鏈(例如對于抗體I，SEQ ID NO: 12)和重鏈(對于抗體I，SEQ ID NO:14)的單一載體系統(tǒng)瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。使用許多常見技術(shù)中的任一技術(shù)純化其中已經(jīng)分泌有抗體的澄清培養(yǎng)基。例如，可以將培養(yǎng)基便利地施加至蛋白A或G瓊脂糖凝膠FF柱，所述柱已經(jīng)用相容性緩沖液(如磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4))平衡。洗滌所述柱以除去非特異性結(jié)合組分。洗脫結(jié)合的抗體，例如，借助PH梯度(如0.1M磷酸鈉緩沖液pH6.8至0.1M檸檬酸鈉緩沖液pH 2.5)進(jìn)行。檢測抗體級分，如通過SDS-PAGE，并且隨后合并抗體級分。取決于預(yù)期用途，進(jìn)一步純化是任選的?？梢允褂贸Ｒ娂夹g(shù)，將抗體濃縮和/或無菌過濾?？梢酝ㄟ^常見技術(shù)，包括大小排阻、疏水相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析有效地移除可溶性聚集物和多聚體。經(jīng)這些層析步驟后，抗體的純度大于99%?？梢詫a(chǎn)物立即在_70°C冷凍或可以凍干。下文提供抗體I的CDR和可變區(qū)氨基酸序列(使用Kabat方法測定)。表1.輕鏈⑶R氨基酸序列
權(quán)利要求
1.與人VEGFR-3特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQID N0:2的IXDR1、SEQ ID NO:2 的 LCDR2、SEQ ID NO:3 的 LCDR3、SEQ ID NO:6 的 HCDRl，SEQ ID NO:7 的HCDR2 和 SEQ ID NO:8 的 HCDR3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含SEQID NO:5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO:10的重鏈可變區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體包含SEQID NO:15的輕鏈和SEQ ID NO:16的重鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體包含SEQID N0:15的兩條輕鏈和SEQ ID NO:16的兩條重鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中 a)所述抗體與人VEGFR-3的結(jié)合因人VEGFR-3的Pro-219單突變成Leu減少至少90%;和 b)所述抗體與人VEGFR-3的結(jié)合因人VEGFR-3的Val_175單突變成Ala減少至少50%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體與人VEGFR-3的結(jié)合因人VEGFR-3的Leu-221單突變成Val減少至少50%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其也與SEQID N0.20的突變小鼠VEGFR-3和SEQ ID N0.21的突變小鼠VEGFR-3結(jié)合，其中與野生型小鼠VEGFR-3 (SEQ ID N0.19)的結(jié)合相比較時，與SEQ ID N0.20的突變小鼠VEGFR-3的結(jié)合增加多于50倍，并且與野生型小鼠VEGFR-3的結(jié)合相比較時，與SEQ ID N0.21的突變小鼠VEGFR-3的結(jié)合增加多于10 倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體對人VEGFR-3 具有 I X KT9M 至 5.6 X 1(ΓηΜ 的 Kd，如在BIACORE 2000 生物傳感器上于 20°C通過表面等離子體共振法所測量的那樣。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體以2nM至1.3nM 的 IC50 抑制人 VEGF-CΔΝΔc (SEQ ID NO:22)與人 VEGFR-3 結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體以IOnM至5nM的IC5tl抑制VEGF-C^,。刺激的促有絲分裂反應(yīng)。
11.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合部分和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
12.權(quán)利要求11中所述的藥物組合物，其中所述組合物任選地含有至少一種其他治療成分。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，用作藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，用于治療卵巢癌、人紅白血病、頭頸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其與選自順鉬、5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉬和多西紫杉醇的其他抗癌藥組合，用于在治療中同時、分別或依次使用。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗VEGFR-3單克隆抗體、含有所述抗體的藥物組合物和所述抗體在治療疾病中的用途。
文檔編號C07K16/28GK103080133SQ201180043057
公開日2013年5月1日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者B·皮托夫斯基, K·佩爾紹德, N·扎耶克 申請人:伊姆克羅尼責(zé)任有限公司