專利名稱：信號生物標志物的制作方法
信號生物標志物
領(lǐng)域
本發(fā)明涉及診斷學(xué)和相關(guān)技術(shù)，包括涉及C型利尿鈉和紅細胞生成素信號肽的診斷學(xué)，及其試劑盒、用途和應(yīng)用。
背景
下文包括可用于理解本發(fā)明的信息。而并非承認本文提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)，或者與正在描述或要求保護的發(fā)明相關(guān)，或者具體或暗示地引用的任何出版物或文件是現(xiàn)有技術(shù)。
急性冠脈綜合癥(ACS)涵蓋了從不穩(wěn)定的絞痛至急性心肌梗死(AMI)的廣譜的心臟局部缺血性事件。AMI是這類事件最嚴重的表現(xiàn)，因此需要快速而精確的診斷。將表現(xiàn)出兩種或多種所述特征(局部缺血性胸痹史、系列心電圖(ECG)跡的演化改變和血漿心臟生物標志物的上升和下降)的患者明確定義為正在經(jīng)受AMI。1然而，表現(xiàn)出疑似AMI的患者中有顯著比例(40%-50%)沒有ECG的系列變化或典型癥狀，因此著重強調(diào)了用于精確診斷的生物標志物分析。u心肌梗死的精確早期診斷有助于迅速引入再灌注治療，包括有效的經(jīng)皮或溶栓性再血管化以及輔助抗凝劑和抗血小板療法。隨著診斷和管理每小時的延遲，此類治療對于死亡率和發(fā)病率的降低逐漸失效。3_6考慮到臨床情況中需要加速的精確決策，對為急性心臟綜合癥和病癥，特別是AMI提供早期并且特異性診斷的生物標志物，特別是循環(huán)的生物標志物的鑒別有相當興趣。1提出的生物標志物包括肌酸激酶-MB (CK-MB)、肌鈣蛋白T(TnT)、肌鈣蛋白I (TnI) BNP、N-BNP (也被稱為NP-BNP) ,BNP信號肽(BNP-SP)和肌紅蛋白。然而，達到血漿心臟生物標志物可檢測的或異常的升高的時間可以從高達6小時(肌紅蛋白、CK-MB)至12小時或更多(TnT、Tn1、BNP、N-BNP)，且峰值水平通常直到損傷發(fā)作后24-48小時時才發(fā)生，對精確診斷和治療前造成了延遲窗口。3_6此外，肌紅蛋白和CK-MB都是非特異性的，可由心臟外的來源分泌，尤其是在創(chuàng)傷或手術(shù)的過程中。1需要這樣的標志物或標志物組， 其為關(guān)于急性心臟綜合癥和病癥(例如急性心臟損傷)提供早期和特異性的信息，特別是在臨床表現(xiàn)的前幾個小時內(nèi)。
還需要監(jiān)控血管易損斑塊的工具，所述易損斑塊為急性心臟事件提供底物。動脈粥樣硬化是主要的健康問題，僅在美國就造成500，000例死亡的年死亡率。目前認為，急性冠脈綜合癥是血管造影術(shù)中等嚴重程度的動脈粥樣化易損斑塊破裂的最常見的結(jié)果?！耙讚p斑塊”用于指中等狹窄但不穩(wěn)定的斑塊的亞組，其易于破裂，并因此導(dǎo)致突然的心搏停止。冠脈血管造影術(shù)廣泛用于顯示和監(jiān)控冠狀動脈腔變窄，但其不能提供易損斑塊的選擇性鑒別。鑒別易損斑塊的大部分備選方法都是基于侵入性血管內(nèi)的方法。因此，開發(fā)能夠區(qū)別易損斑塊與穩(wěn)定斑塊的非侵入性技術(shù)對于降低動脈粥樣硬化患者的發(fā)病率和死亡率是關(guān)鍵的和迫切所需的。如果可獲得不依賴于腔直徑變窄的程度而檢測不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊的方法和裝置，并且在發(fā)生不穩(wěn)定的絞痛和/或急性心肌梗死及其后果之前進行治療，則是非常理想的。7
根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(ProgramAnnouncement PA-09-196, “AncillaryStudies of Acute Kidney Injury, Chronic Kidney Disease， and End Stage RenalDisease Accessing Information from Clinical Trials,Epidemiological Studies，andDatabases”)，美國由于慢性腎病造成的公眾健康和經(jīng)濟負擔(dān)是巨大的。糖尿病和高血壓是慢性腎病的主要病因。2006年，晚期腎病的新發(fā)病例數(shù)超過110，000例，而正在接受治療的患者數(shù)多于500，000名。由于美國人群體持續(xù)衰老，預(yù)期晚期腎病的新發(fā)病例數(shù)仍將增力口。據(jù)估計，美國有約26，000，000人患慢性腎病。住院患者的急性腎衰竭也是美國的嚴重問題，占1-15%的住院患者。急性腎衰竭的醫(yī)學(xué)管理傳統(tǒng)上主要由支持性醫(yī)護組成，最嚴重的病例使用換腎療法。盡管對急性腎衰竭進行上述干預(yù)，然而，患病患者的死亡率仍然非常高(一些情況下> 50% )。
類似的，慢性腎衰竭(CRF)具有高的死亡率和發(fā)病率，對此除支持性醫(yī)護外沒有任何特異性療法。8在組織學(xué)上，局部缺血性CRF的特征是急性腎小管壞死；然而應(yīng)對該疾病的主要限制是缺少用于早期檢測的臨床可行的診斷。慢性腎病的早期鑒別和發(fā)展的及時檢測是全球腎臟學(xué)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)，尤其是由于用于減緩病情發(fā)展的多種有前景的初級和次級干預(yù)是可用的。為了控制成本，醫(yī)生需要降低慢性腎病發(fā)展為晚期腎病(ESRD)的速度。腎病和腎病發(fā)展的現(xiàn)有標志物是血清肌酸酐和尿蛋白濃度，包括微蛋白尿。8已證實腎小球濾過率(GFR)降低的斜率用于預(yù)測對ESRD定時，而多個研究顯示蛋白尿的水平與腎病發(fā)展速度相關(guān)。然而，它們識別早期腎病的能力有限。血清肌酸酐濃度依賴于對象的年齡、性別、種族、肌肉量、體力活動的程度，而基于血清肌酸酐的多種用藥和對腎臟功能的正確解讀需要復(fù)雜的公式。雖然尿蛋白對進行性腎病敏感，但它出現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)生嚴重的腎損害之后。出于最大效益考慮，早期和/或進行性腎損害的生物標志物應(yīng)該在盡可能早的時間點變成陽性，優(yōu)選在開始發(fā)生腎損害之前的點變成陽性。仍然強烈的需要發(fā)現(xiàn)和驗證相關(guān)的標志物，特別是用于早期檢測的標志物。8
世界反興奮劑機構(gòu)持續(xù)面臨的問題是運動員將肽/蛋白質(zhì)激素(例如紅細胞生成素(EPO))作為性能增強劑的濫用。目前，通過電泳或免疫測定方法分析血液和尿液樣品中存在的違禁物質(zhì)。除任何的內(nèi)在技術(shù)問題外，這些測量結(jié)果必須考慮可接受的內(nèi)源性肽激素的生理水平，以及確定其合成的或重組的形式的存在。然而，還應(yīng)認識到，對于該組中的某些激素，它們較新的合成或重組形式也使得對體`育運動中的濫用的檢測更加困難，并且由于以下內(nèi)容使該問題更加復(fù)雜:(I)合成或重組EPO構(gòu)建的技術(shù)發(fā)展，⑵受控的施用時間點以避免檢測，(3)造成的對超過可接受的標準的物質(zhì)水平進行驗證的難度，和(4)不確定的記錄，其反映第第二抗體體非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)變化性(特別是在尿濃縮液中)和等電測試中非特異性的酶誘導(dǎo)的條帶移動。
本發(fā)明的實施方案涉及發(fā)現(xiàn)用于診斷學(xué)的新的早期標志物，包括用于例如急性冠脈綜合癥、急性和慢性腎病癥和損傷，和易損斑塊的評估、診斷和預(yù)后，以及用于檢測例如運動員服用EPO。
概述
本文中描述并要求保護的發(fā)明具有許多屬性和實施方案，包括但不限于此概述中提出或描述或參考的那些。其并非意在包括一切并且本文中描述并要求保護的發(fā)明不限于或不被此概述中鑒別的特征或?qū)嵤┓桨赶拗?，包括此概述的目的僅僅是示例，而非限制。
申請人已發(fā)現(xiàn)C型利尿鈉肽的信號肽片段(CNPsp)和紅細胞生成素的信號肽片段(EPOsp)。申請人還發(fā)現(xiàn)可以通過測定生物學(xué)樣品來檢測這些信號肽片段，包括通過測定含有釋放到循環(huán)中的材料的生物學(xué)材料的樣品。本發(fā)明涉及C型利尿鈉肽和紅細胞生成素的信號肽和信號肽的片段，和用于檢測它們的方法(包括檢測EPOsp和/或CNPsp，和EPOsp和/或CNPsp片段的免疫反應(yīng)性)，例如，以及用于所述方法的結(jié)合劑和測定。本發(fā)明還涉及它們在生物學(xué)事件或病癥或狀態(tài)的預(yù)后、診斷和監(jiān)控中的用途，所述生物學(xué)事件或病癥或狀態(tài)導(dǎo)致將它們釋放到可以取樣的體液中。用于預(yù)后、診斷和監(jiān)控的生物學(xué)事件、病癥和狀態(tài)的實例包括急性和慢性心血管病癥、脆弱的動脈粥樣硬化斑塊、充血性心カ衰竭、心臟心率不齊、急性冠脈綜合癥、慢性動脈病、急性和慢性腎病病癥、損傷和病況。使用和測量EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或EPOsp和CNPsp的片段(包括免疫反應(yīng)性肽片段)，較之現(xiàn)有的標準標志物，提供了更優(yōu)秀的檢測和區(qū)分能力。在這此方面，注意到了達到血液峰值水平的短得多的時間和每種標志物針對病況的特異性本質(zhì)。后者源自每種信號肽片段的器官特異性分布。因此，EPOsp是從腎臟中特異性釋放的，而CNP是從心臟和血管中釋放的。此外，因為較之現(xiàn)有的標志物，信號肽在血液中具有更短的半壽期，信號肽具有更快速地升高和降低的能力，來檢測潛在的活動性疾病。對于現(xiàn)有標志物則并非如此，其具有長半壽期，并因此其血液水平不快速響應(yīng)活動性疾病。人EPOsp 具有序列 MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLG (SEQ ID NO: I)人EPOsp片段包括例如EPOsp (1-9)和EPOsp (18-27)，可如下書寫:MGVHECPAff (SEQ ID NO:2)
SLPLGLPVLG(SEQ ID NO:3)人CNPsp 具有序列 MHLSQ LLACA LLLTL LSLRP SEA (SEQ ID NO:4)。人CNPsp片段包括例如CNPsp (1-13)和CNPsp (14-23)，可如下書寫:MHLSQLLACALLL(SEQ ID NO:5)TLLSLRPSEA(SEQ ID NO:6)用于制備這些人和動物的信號肽和片段的結(jié)合劑的這些信號肽和片段的動物類似物，及其變體都落入本發(fā)明中。本發(fā)明包括用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的生物學(xué)事件或病癥的方法，其中事件與CNPsp或EPOsp或其片段釋放進入循環(huán)中相關(guān)，或者用于評估服用EPO的方法。在ー個方面，方法包括測量來自對象的生物學(xué)樣品中的這些信號肽或片段中的ー種或多種的水平，和將信號肽片段的水平與來自對照和對照群體(包括歷史對照)的所述信號肽片段的單個或組合水平進行比較，其中測量水平與對照水平的差距提示了生物學(xué)事件。還測量信號肽自身。申請人:還發(fā)現(xiàn)EPOsp和/或CNPsp片段可用于評估急性心臟綜合癥的存在，并且所述EPOsp和/或CNPsp片段中的ー種或多種通常在疑似急性冠脈綜合癥發(fā)作或臨床表現(xiàn)時之后的前幾個小時內(nèi)是最高的。在其他方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的ACS的方法，方法包括測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp片段的水平，和將所述EPOsp和/或CNPsp片段的水平與來自一個或多個對照的所述EPOsp和/或CNPsp片段的水平進行比較，其中高于對照水平的所述EPOsp和/或CNPsp片段的測量水平提示了 ACS。升高的EPOsp和/或CNPsp片段水平通常是MI和絞痛的診斷法。
升高的EPOsp和/或CNPsp片段水平還可用作心カ衰竭的診斷法。升高的EPOsp和/或CNPsp片段水平還可用作血管疾病和/或動脈粥樣硬化的診斷。例如，在這些病況中，CNPsp可以比正常值升高約50%或更高。升高的CNPsp片段水平也可以用于診斷高血壓。升高的CNPsp片段水平也可以用于診斷暈厥，暫時的意識喪失和通常與臨時性的流向腦部血液不足相關(guān)的姿勢。暈厥最常見于血壓太低(低血壓)和心臟沒有為腦部泵送正常的供氧。升高的EPOsp和/或EPOsp片段水平也可以用于評估服用EPO。EP0/EP0sp免疫反應(yīng)性(提示EPOsp和/或EPOsp片段)血漿比例預(yù)期可超過高至1000: 1，特別是例如在施用的急性階段期間。本發(fā)明還包括用于監(jiān)控對象對生物學(xué)事件或病癥，特別是急性心臟綜合癥的治療的響應(yīng)的方法，方法包括優(yōu)選地在治療之前和之后測量來自對象的生物學(xué)樣品中的本文提及的信號肽片段(例如，EPOsp和/或CNPsp片段)中的ー種或多種的水平，和將所述片段的水平與來自對照的所述片段的水平進行比較，其中片段的水平或測量的水平(例如，歷史水平或基線)相對于對照水平的改變提示了對治療的響應(yīng)。本發(fā)明還包括用于診斷或評估對象中的急性和慢性腎病或腎衰竭或損傷的方法，其中EPOsp水平的測量結(jié)果顯示了與GFR(腎功能的指標)的負相關(guān)。血漿EPOsp水平在例如慢性腎病患者和心カ衰竭患者中，較之正常是升高的。EPOsp與EPO的比例在正常健康中是約6，在腎病中升至約10，在心カ衰竭患者中降至約4。本發(fā)明還包括用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的急性心臟綜合癥的方法，方法包括在ACS或疑似ACS發(fā)作或臨床表現(xiàn)的約前12小時或更長，優(yōu)選前4-6小時或更短以內(nèi)，測量從對象獲得的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp片段中的ー種或多種的水平，將所述EPOsp和/或CNPsp片段中的一種或多種的測量的水平與來自對照的EPOsp和/或CNPsp片段中的ー種或多種的水平(例如，歷史對照或已知的對照水平)進行比較，其中EPOsp和/或CNPsp片段中的一種或多種的測量的水平高于對照水平提示了 ACS。廣泛而言，本發(fā)明可用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控任何事件，在所述事件中，從細胞釋放EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種和/或其片段進入例如循環(huán)中或其他的生物學(xué)流體或組織中。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，特別地對于心血管或腎病癥，或疑似的心血管或腎病癥，在患有病癥或疑似病癥的患者表現(xiàn)約48小吋，約24小吋，約12小吋，約10小吋，約8小時，約6小時，約4小時，約2小時，或約I小時，或約30分鐘內(nèi)，測量EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種和/或其片段的水平。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是體外方法，而生物學(xué)樣品是血液、血漿、血清、尿液、唾液、組織液或心臟組織。在一個實施方案中，測量步驟包括檢測ー種或多種靶片段和結(jié)合劑之間的結(jié)合，所述結(jié)合劑以理想的特異性和選擇性結(jié)合所述片段。測量步驟可以包括:(a)在有或無孵育步驟的條件下，將含有或疑似含有一種或多種靶片段的生物學(xué)樣品與ー種或多種結(jié)合劑接觸；和

(b)測量結(jié)合的(ー種或多種)靶信號肽或片段的水平。
結(jié)合劑可以是例如抗體或包含其抗原結(jié)合片段的任何分子。最常見的是，抗體可以是單克隆、多克隆、嵌合或人源化抗體。在一個實施方案中，抗體是單克隆抗體。在另ー個實施方案中，結(jié)合劑是例如單鏈抗體或scFv。在一個實施方案中，抗片段結(jié)合劑是例如，識別生物學(xué)樣品中的片段或獲得自生物學(xué)樣品的片段的抗體或其抗原結(jié)合片段。在另ー個實施方案中，使用質(zhì)譜測量一種或多種靶片段的水平。使用本發(fā)明的結(jié)合劑，可以結(jié)合對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段。其他的EPOsp和CNPsp片段也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。由一種或多種結(jié)合劑所結(jié)合的分子可以是全長的人信號肽分子(SEQ ID NO:1、4)或其抗原性變體或片段。在一個實施方案中，片段的長度是至少4個連續(xù)的氨基酸。ー種或多種結(jié)合劑可以結(jié)合例如EPOsp和/或CNPsp的N端或C端。片段可以是例如SEQ IDNO:2、3、5和/或6中的任ー項?？梢允褂美绻潭ㄔ诠滔嗌系目贵w或抗體片段或其他結(jié)合劑，來測量對應(yīng)于SEQID NO:1-6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段或其他信號肽片段的結(jié)合。可以通過例如，RIA、ELISA、熒光免疫測定、免疫熒光測量法、質(zhì)譜或免疫放射測定，有效地測量對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的水平。本發(fā)明的方法包括來自對象的生物學(xué)樣品中對應(yīng)于SEQID NO:1-6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的結(jié)合劑和測定的用途，測定包括使用任何已知的方法，來確定樣品中對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6 (或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的存在或量。本發(fā)明還 提供了測定，包括用于本文所述用途的測定，用于對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6 (或其非人類似物或變體)的ー種或多種肽或肽片段，或其他EPOsp和/或CNPsp片段，包括例如:(a)結(jié)合來自樣品的對應(yīng)于SEQ ID NO: 1-6 (或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種；和(b)測量ー種或多種對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6(或其非人類似物或變體)的被結(jié)合的肽或肽片段的水平。本發(fā)明還提供了對應(yīng)于SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的一種或多種測定，其用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的生物學(xué)事件或病癥。在一個實施方案中，測定是體外測定。本發(fā)明還包括對應(yīng)于例如SEQ ID NOS:2、3、5和/或6中任ー種的經(jīng)分離的、基本經(jīng)純化的、或經(jīng)純化的，以及合成制備的片段。本發(fā)明的心臟相關(guān)的方法可還包括測量例如ACS的ー種或多種非EPOsp和非CNPsp標志物的水平，和將標志物的水平與対照的水平進行比較，其中測量的水平與對照水平的差異，以及EPOsp和/或CNPsp片段中的一種或多種的測量的水平高于EPOsp和/或CNPsp片段中的一種或多種的對照水平，預(yù)測或診斷ACS，或所述方法可用于監(jiān)控所述ACS。用于急性冠脈綜合癥環(huán)境下的標志物包括例如，肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白1、肌酸激酶MB、肌紅蛋白、BNP, NT-BNP, BNP-SP, ANP、ANP-SP, LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶和心臟特異性脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)。在另ー個方面，本發(fā)明還提供了對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他片段的結(jié)合剤。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合劑結(jié)合SEQ ID NO:2、3、5和/或6之一。在另ー個實施方案中，結(jié)合劑結(jié)合對應(yīng)于SEQ IDNO:1-6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的變體或片段。結(jié)合劑在預(yù)測、診斷或監(jiān)控生物學(xué)事件或病癥中是有用的，所述生物學(xué)事件或病癥與對應(yīng)于SEQ ID NOS:1、2、3、4、5或6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的釋放相關(guān)，釋放包括例如釋放到循環(huán)中。此類事件或病癥包括對象中的急性心臟綜合癥。本發(fā)明還提供了抗EPOsp和/或抗CNPsp抗體或其抗原結(jié)合片段?？贵w可以是例如單克隆、多克隆、嵌合或人源化抗體。本發(fā)明還包括結(jié)合EPOsp和/或CNPsp片段的抗體及其結(jié)合片段，所述EPOsp和/或CNPsp片段包括由SEQ ID NO:2、3、5和/或6鑒別的片段。本發(fā)明還涉及結(jié)合劑在生產(chǎn)測定中的用途，所述測定用于對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6 (或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段，用于評估對象中的生物學(xué)事 件或病癥，或者涉及結(jié)合劑在生產(chǎn)預(yù)后、診斷或監(jiān)控工具中的用途，所述工具用于評估對象中的生物學(xué)事件或病癥和/或其治療，或用于評估EPO濫用或服用興奮劑。在一個實施方案中，事件或病癥與對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段釋放到循環(huán)中相關(guān)，包括來自慢性腎病或損傷、心カ衰竭、高血壓、暈厥、包括動脈粥樣硬化的血管疾病，或包括心肌梗死和絞痛的急性心臟綜合癥，或EPO濫用或服用興奮劑。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)用于評估生物學(xué)事件或病癥的預(yù)后、診斷或監(jiān)控工具中的用途，所述生物學(xué)事件或病癥與對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6(或其非人類似物或變體)中任一種的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段釋放(包括，例如，到循環(huán)中)相關(guān)，包括對象中的慢性腎病或損傷、心カ衰竭、高血壓、暈厥、包括動脈粥樣硬化的血管疾病，或包括心肌梗死和絞痛的急性心臟綜合癥。在一個實施方案中，校正預(yù)后、診斷或監(jiān)控工具，來測量例如在0.1至1500pmol/L、0.1 至 500pmol/L、I 至 300pmol/L、10 至 250 或 20 至 150pmol/L 范圍內(nèi)的對應(yīng)于 SEQ IDNO:1-6 (或其非人類似物或變體)中任ー種的ー種或多種肽或肽片段，或其他信號肽片段的水平。此外，可見于生物學(xué)樣品，包括血漿樣品的紅細胞生成素信號肽的水平在從約400至 4000pmol/L，約 400 至 200pmol/L，約 320 至 520pmol/L，或約 400_420pmol/L 或更低的范圍內(nèi)。至少低至5pmol/L的水平是可檢測的?？梢娪谏飳W(xué)樣品，包括血漿樣品中的血管緊張素信號肽的水平在從約10至1000pmol/L,約5至500pmol/L,約I至100pmol/L,或約0.1至10pmol/L或更低的范圍內(nèi)。至少低至0.lpmol/L的水平是可檢測的?？梢娪谏飳W(xué)樣品，包括血漿樣品中的C型利尿鈉信號肽的水平在從約50至1500pmol/L，約25至750pmol/L,約10至500pmol/L,或約5至150pmol/L或更低的范圍內(nèi)。至少低至2pmol/L的水平是可檢測的?？梢娪谏飳W(xué)樣品，包括血漿樣品中的內(nèi)皮素-1信號肽的水平在從約10 至 200pmol/L,約 5 至 100pmol/L,約 10 至 50pmol/L,或約 I 至 20pmol/L 或更低的范圍內(nèi)。至少低至lpmol/L的水平是可檢測的。在ー個方面，包括SEQ ID NO:1_3的EPOsp和/或EPOsp片段的正常水平是約14至約90pmol/L，而在本文提及的ー種或多種疾病狀態(tài)或病況中是約30至約200pmol/L?？梢詼y量例如血液或血漿中此類水平。在ー個方面，包括SEQ ID NO:4_6的CNPsp和/或CNPsp片段的正常水平是約5至約15pmol/L，而在本文提及的ー種或多種疾病狀態(tài)或病況中是約18至約55pmol/L?？梢詼y量例如血液或血漿中此類水平。在另ー個方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的生物學(xué)事件或病癥的試劑盒，試劑盒包含針對對應(yīng)于SEQ ID NO:1-6(或其非人類似物或變體)中的一種或多種的肽或肽片段，或其他信號肽片段的結(jié)合剤。在一個實施方案中，校正試劑盒，來測量對應(yīng)于SEQ ID NO:1_6(或其非人類似物或變體)中的一種或多種的肽或肽片段，或其他信號肽片段在上述范圍內(nèi)的水平。在一個實施方案中，試劑盒還包括使用結(jié)合劑來進行測定的信息和/或說明。試劑盒也可以包括用于從生物學(xué)樣品中測量的對應(yīng)于SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的水平，井比較所測量的水平與對照水平，來預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的生物學(xué)事件或病癥的信息和/或說明，所述生物學(xué)事件或病癥包括對象中慢性腎病或損傷、心カ衰竭、高血壓、暈厥、包括動脈粥樣硬化的血管疾病，或包括心肌梗死和絞痛的急性心臟綜合癥中的ー種或多種。本發(fā)明還涉及對應(yīng)于SEQ ID NO:1_6 (或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段在制備抗體或其結(jié)合片段中的用途。`附圖簡介現(xiàn)在將參考后文附圖中的圖片描述本發(fā)明，其中

圖1使用單字母注釋顯示了 EPOsp和CNPspP的氨基酸序列。圖2(上圖):CNPsp(15-23)RIA的代表性標準曲線。(下圖):人的區(qū)域血管床取樣顯示了相比循環(huán)動脈(FAl和FA2)的水平，僅心臟冠狀竇(CS)和腎靜脈(RV)具有較高的CNPsp濃度。這提示心臟是CNPsp的功能性來源，且可以采集理想的靜脈來源的樣品而不需要采集動脈來源樣品?？梢栽趧用}樣品中鑒別信號肽，但可以使用靜脈樣品鑒別肽的來源。圖3 (上圖)血漿EPOsp (1-9)水平顯示了與GFR(腎功能的指標)的負相關(guān)。(中圖)血漿EPOsp水平在慢性腎病患者中(EP0顯著下降)和心カ衰竭患者中升高，其中EPOsp水平相比正常升高(EP0顯著升高)。(下圖)EP0sp(pmol/L)與EP0(mU/L)的比例在正常健康中約為6。在腎病中升至約10，而在心カ衰竭患者中降至約4。圖4顯示了從前原肽前體分子切割信號肽的一般示意圖，提示生成了之前未知的和未識別的、可檢測的信號肽片段。圖5是免疫測定結(jié)果，其顯示上圖:從在醫(yī)院急診部門胸痛發(fā)作的時間起，8名具有經(jīng)證明的ST升高型心肌梗死(STEMI)的患者中的CNPsp系列血漿濃度(14-23)。下圖:在上圖中鑒別的相同的STEMI患者中，伴隨的Tnl、CK-MB和肌紅蛋白血漿水平。圖6顯示了 EPOsp和CNPsp抗血清的交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)的表格。
定義急性冠脈綜合癥涵蓋了廣譜的心肌局部缺血事件，包括在呈現(xiàn)的ECG上具有ST升高型急性心肌梗死(AMI)、不穩(wěn)定的絞痛和急性非ST升高型心肌梗死；心局部缺血；急性心臟損傷；由急性藥物毒性導(dǎo)致的急性心臟損害；和急性心肌病。這些病癥的完整描述、定義可見于參考文獻I中，參見例如圖5。急性(突發(fā)性)腎衰竭是腎臟突然喪失去除廢物和濃縮尿液而不損失電解質(zhì)的能力。該類腎損害有許多可能的原因，包括疾病和損傷。它們包括急性腎小管壞死；自身免疫腎??；由于非常低血壓導(dǎo)致的血流減少；在腎血管內(nèi)導(dǎo)致凝塊的病癥；直接損傷腎的感染；孕期并發(fā)癥；和尿道堵塞。慢性腎病是腎功能隨時間緩慢喪失。癥狀包括血便、口臭、易于淤傷、精神狀態(tài)或情緒改變、胃ロ減少、感覺減少，尤其是手或足的感覺減少、疲勞、脅腹痛(在肋骨和臀部之間)、手震顫、高血壓、口中金屬味、惡心或嘔吐(可持續(xù)數(shù)天)、流鼻血、持續(xù)的呃逆、長期出血、癲癇發(fā)作、遲緩、運動緩慢、全身腫脹(液體潴留)、踝、足和腿部腫脹，和排尿改變(尿量減少、夜間排尿過多，和完全停止排尿)。慢性腎病(CKD)隨時間緩慢惡化。在早期階段，可能沒有癥狀。通常需要數(shù)月或數(shù)年發(fā)生功能喪失。其是如此緩慢的以至于可能直到腎功能低于正常的十分之ー時才出現(xiàn)癥狀。慢性腎病的 最后階段被稱為末期腎病(ESRD)。腎臟不再行使功能，而患者需要透析或腎移植。每1000個美國人中有2名以上患慢性腎病和ESRD。糖尿病和高血壓是兩種最常見的病因，是大部分的病例原因。損傷是另ー個病因。其他多種疾病和病況可以損害腎臟，包括進入腎臟或在腎臟內(nèi)部的動脈的問題；腎臟的出生缺陷(例如，多囊性腎病)；ー些止痛藥和其他藥物；某些毒性化學(xué)物；自身免疫病癥(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和硬皮病)；損傷或外傷腎小球腎炎；腎結(jié)石和感染；回流性腎炎(腎臟被回流到腎臟中的尿液損害)和其他腎病。癥狀可以包括一般的不適感和疲勞、全身瘙癢(搔癢癥)和皮膚干燥、頭痛、體重減輕而未嘗試減輕體重、缺少胃口和惡心?？梢猿霈F(xiàn)其他癥狀，尤其是當腎功能已經(jīng)惡化時，包括異常的深色或淺色皮膚、骨痛、腦和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、困倦和精神錯亂、難以集中注意力或思考、手、足或其他區(qū)域麻木、肌肉顫搐或痙攣、口臭、易于淤傷、流血或血便、極度ロ渴、頻繁呃逆、低性欲水平和陽痿、月經(jīng)停止(停經(jīng))、睡眠問題例如失眠、下肢不寧綜合癥和阻塞性睡眠呼吸暫停、手足腫脹(水腫)和通常發(fā)生在早晨的嘔吐。易損斑塊是特別易于產(chǎn)生突發(fā)性嚴重問題(例如心臟病發(fā)或中風(fēng))的動脈粥樣斑塊。作為冠脈血栓最常見的病因，由順序血管造影所表明，斑塊破裂涉及冠脈狹窄的陣發(fā)式進展，并通常與不穩(wěn)定的絞痛、心肌梗死和猝死相關(guān)。易破裂的動脈粥樣硬化斑塊在覆蓋新月形細胞減少的脂類團的纖維帽內(nèi)具有巨噬細胞致密浸潤，和較低程度的淋巴細胞浸潤。因此，易損斑塊的特征通常是動脈壁內(nèi)的動脈粥樣斑塊，具有豐富的巨噬細胞、大量的脂類和膽固醇，并且通常被可以破裂的薄纖維帽覆蓋。破裂的斑塊導(dǎo)致脂類核心和其他斑塊組分暴露于血液，并且被認為激發(fā)了大部分的冠脈血栓。這些相對較不狹窄的斑塊的特征是易于侵蝕或破裂，而認識到它們對于不穩(wěn)定的絞痛和心肌梗死的作用具有重要的含義。潛在的易損斑塊的早期鑒別可以導(dǎo)致對于考慮搭橋手術(shù)、血管成形術(shù)和其他方法的患者的適應(yīng)癥的改變。參見 “Molecular and Physical Characterization of the VulnerablePlaque”NIH guide,第 26 卷，第 37 期，November7,1997術(shù)語“抗體”指具有特異性結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，其與包含用于合成抗體的抗原的分子，或者與和其密切相關(guān)的抗原特異性地相互作用(結(jié)合)。如本文中使用的，術(shù)語“抗體”廣泛地包括全長抗體，并且還可以包括其抗原結(jié)合片段。還包括了單克隆和多克隆抗體、多價和單價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體和已經(jīng)親和力成熟的抗體。還包括單鏈抗體、scFv和其他含有抗原結(jié)合構(gòu)建體的分子。如果抗體優(yōu)先結(jié)合靶，包括例如與非EPOsp和/或非CNPsp多肽或多肽片段具有低于約25 %，或低于約10%,或低于約1%或低于約0.1 %交叉反應(yīng)性的那些抗體,則抗體選擇性或特異性地結(jié)合本發(fā)明的EPOsp和/或CNPsp多肽或片段。對于用于本文所述和要求保護的用途的抗原或表位，抗體可具有任何有效的結(jié)合親和カ(解離常數(shù)(Kd)值)。典型的結(jié)合親和力可等于例如10_6或10_7M，更通常至少約IO-8MUO-9MUO-1ciUO-11或10_12M?？梢允褂帽砻娴入x子體共振或本領(lǐng)域已知的其他方法，評估結(jié)合親和力。如本文中使用的，“抗原結(jié)合片段”或“抗體片段”意指完整抗體的一部分，所述部分優(yōu)選地保留了該抗體片段的大部分或全部，或者最少至少ー種的正常功能。抗體片段例如可以包含F(xiàn)v區(qū)，所述Fv區(qū)保留了完整抗體-抗原結(jié)合區(qū)中相對應(yīng)的Fv區(qū)的所有或大部分或ー些功能?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F (ab’)2和Fv片段、線性抗體、雙抗體、單鏈抗體(ScFV)和多特異性抗體。如本文中使用的，“單克隆抗體”意指針對單個靶抗原的抗體。單克隆抗體可獲得自同質(zhì)或基本同質(zhì)的抗體群體，其中除了微量存在的天然突變外，每種單克隆抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位?！胺蛛x的抗體”是已經(jīng)與其天然環(huán)境的組分分開(例如，與包括酶和激素的其他蛋白質(zhì)分開)和/或回收的經(jīng)過鑒別的抗體。在一個實施方案中，將抗體純化至以抗體重量計至少約95 %，約96 %、約97 %、約98 %或約99 %?？梢酝ㄟ^例如Lowry方法確定純度。通常通過至少ー個純化步驟制備抗體。術(shù)語“結(jié)合剤”在本文中用于指能夠結(jié)合EPOsp和/或CNPsp多肽，或其片段或變體的任何固體或非固體材料。在一個實施方案中，術(shù)語指結(jié)合EPOsp和/或CNPsp多肽或其片段或變體的任何天 然的或非天然的分子。結(jié)合劑的實例包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂類和小分子化合物。生物學(xué)樣品在本文中意指源自待篩選的對象的任何樣品，其含有或疑似含有EPOsp和/或CNPsp多肽或多肽片段。樣品可為其中能夠檢測到靶的本領(lǐng)域已知的任何樣品。包括體液，例如血衆(zhòng)、血清、血液(包括動脈和/或靜脈樣品)、尿液、唾液、組織液、滑液、腦脊液、淋巴液、精液、羊膜液、心包液和腹水，以及組織例如心臟和腎組織，但不限于此。術(shù)語“表位”包括能夠與免疫球蛋白和/或T細胞受體特異性結(jié)合的任何蛋白質(zhì)決定簇。即，在抗原上的位點，抗體結(jié)合所述位點或B和/或T細胞應(yīng)答所述位點。表位決定簇通常由化學(xué)活性的表面分子團(例如氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，并且通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征和特異性的電荷特征。表位一般包括3個、5個或通常8-10個氨基酸。氨基酸可以是連續(xù)的，或者通過三級折疊并列的非連續(xù)氨基酸。癥狀發(fā)作或臨床表現(xiàn)的約2或4至約12小時內(nèi)包括，例如ACS或本文描述的其他病癥或疑似的病癥，從在醫(yī)療設(shè)施處發(fā)作或表現(xiàn)起，從I分鐘多至并且包括約240至約720分鐘?？梢詮陌l(fā)作或表現(xiàn)起約10小時內(nèi)(從I分鐘多至并且包括約600分鐘)，約8小時內(nèi)(從I分鐘多至并且包括約480分鐘)，約6小時內(nèi)(從I分鐘多至并且包括約360分鐘)，約4小時內(nèi)(從I分鐘多至并且包括約240分鐘)，約2小時內(nèi)(從I分鐘多至并且包括約120分鐘)或約I小時內(nèi)(從I分鐘多至并且包括約60分鐘)內(nèi)，在發(fā)作或表現(xiàn)的5至約45分鐘內(nèi)、15至約40分鐘內(nèi)、20至約35分鐘內(nèi)，或約25至30分鐘內(nèi)進行測量。在一個實施方案中，“高干”或“低干”対照的水平，或相對于對照的改變或差異是統(tǒng)計學(xué)顯著的。如果相比對照水平，水平與對照水平相差約5%或更多，約10%或更多，約20%或更多，或約50%或更多，則可以認為存在相對于對照水平或平均或歷史對照水平的較高水平、較低水平、差異或改變。統(tǒng)計學(xué)顯著的可以備選地計算為P <0.05。還可以通過求助于測定的參考限制或參考區(qū)間，確定較高水平、較低水平、差異和改變?？梢酝ㄟ^直觀評價或非參數(shù)法來計算?？偠灾?，這些方法可以將0.025和0.975分位點計算為0.025* (n+1)和0.975(n+l)。這類方法是本領(lǐng)域普遍已知的。9’1CI存在對照中缺少的標志物可視為較高的水平、差異和改變。缺少對照中存在的標志物可視為較低的水平、差異和改變。包括了來自任何對象的樣品，例如來自沒有生物學(xué)事件或病癥(包括糖尿病或ACS)的臨床史的正常健康對象，和具有多種ACS的對象，包括但不限于急性冠脈綜合癥:在呈現(xiàn)的ECG上具有ST升高的·AM1、不穩(wěn)定的絞痛、和急性非ST升高型MI ;心肌局部缺血；急性心臟損傷；由急性藥物毒性導(dǎo)致的急性心臟損害，和急性心肌病。術(shù)語“心肌病”在本文中用于指心肌的疾病，其中心肌或心臟肌肉衰弱。這可以導(dǎo)致降低的心臟泵出。常見的心肌病因是心臟病發(fā)作、病毒感染、高血壓、醇中毒和自身免疫病?！吧飳W(xué)事件或病癥”在本文中用于指EPOsp和/或CNPsp多肽或多肽片段從細胞釋放到例如對象的循環(huán)中的一系列事件，包括急性和慢性病況。示例性病況包括急性和慢性腎病與心血管疾病(包括急性冠脈綜合癥)。慢性病況的實例是心カ衰竭、AMI和心血管疾病，以及高血壓。 EPOsp和/或CNPsp指人序列的完整信號肽。術(shù)語EPOsp和/或CNPsp還涵蓋其變體和片段。在一個實施方案中，EPOsp和/或CNPsp多肽作為信號多肽，或作為可以結(jié)合抗體的抗原性多肽發(fā)揮作用。EPOsp和/或CNPsp的變體和片段包括保留了上述功能的一者或兩者的變體和片段。術(shù)語“包含”在本說明書和權(quán)利要求中意指“包括”;即當解讀本說明書和權(quán)利要求中包括“包含”的陳述時，各陳述中由該術(shù)語開始的特征都必須存在，但也可以存在其他特征。相關(guān)的術(shù)語例如“包含”和“包含的”以相似的方式理解。術(shù)語“多肽”在本文中涵蓋了任何長度的氨基酸鏈，包括全長序列，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。用于本發(fā)明中的多肽可以是純化的天然產(chǎn)物，或者可以部分或完全使用重組或合成技術(shù)生產(chǎn)。術(shù)語可以指多肽、多肽聚合物，例如ニ聚體或其他多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體，或其衍生物。本文中的多肽可以具有全長EPOsp和/或CNPsp的至少4個氨基酸、至少5個氨基酸，或至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22，或所有23個氨基酸的鏈長度。應(yīng)該相似地理解提及的本發(fā)明的其他多肽或本文描述的其他多肽。多肽的“片段”是多肽子序列(subsequence)，其可以使用結(jié)合劑檢測。術(shù)語可以指多肽、多肽聚合物，例如ニ聚體或其他多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體，或其衍生物。
當用于本文公開的多肽序列時，術(shù)語“分離的”用于指從其天然的細胞環(huán)境或其他天然存在的生物學(xué)環(huán)境中移出的序列。可以通過任何方法或方法的組合獲得分離的分子，包括生物化學(xué)、重組和合成的技木?？梢酝ㄟ^至少ー個純化步驟制備多肽序列。術(shù)語“純化的”在本文中使用時不需要絕對純度。例如，在多個實施方案中，純化的指，例如，樣品中的多肽的至少約80%、85%、90%、95%、98%或99%的同質(zhì)性。術(shù)語應(yīng)該與本文描述的其他分子和構(gòu)建體相似理解。如本文中使用的，術(shù)語“變體”指與具體鑒別的序列不同的多肽序列，其中缺失、替換或添加了 I至6個或更多個氨基酸殘基?？紤]1、2、3、4、5或6個氨基酸的替換、添加或缺失。變體可以是天然存在的等位變體，或非天然存在的變體。變體可以來自相同的物種或其他物種，可以涵蓋同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些實施方案中，用于本發(fā)明中的多肽的變體具有與親代多肽相同或相似的生物學(xué)活性，包括信號肽活性或抗原結(jié)合性質(zhì)。術(shù)語“變體”當涉及多肽時，涵蓋了所有類型的本文定義的多肽。變體多肽序列表現(xiàn)出與本發(fā)明的序列至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約71 %、至少約72 %、至少約73 %、至少約74 %、至少約75 %、至少約76 %、至少約77 %、至少約78%、至少約79 %、至少約80 %、至少約81 %、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、 至少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至少約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98%，或至少約99%的同一性。對于多肽，從至少5至7個氨基酸位置的比較窗ロ得出同一‘注。多肽變體還涵蓋了這樣的變體，所述變體表現(xiàn)出與具體鑒別的序列中的一種或多種的相似性，可能保留了所述序列的功能等價性，包括由于隨機的機會發(fā)生而不能合理預(yù)期的那些變體。如上所述，在EPOsp和/或CNPsp變體的情況下，功能可以是作為信號多肽，或抗原性多肽，或兩者?？梢园聪铝蟹绞酱_定多肽序列同一‘丨生和相似性。使用可自NCBI (ftp://ftp, ncb1.nih.gov/blast/)公開獲得的 bl2seq 的 BLASTP (來自 BLAST 程序組，2.2.18 版(2008 年 4月))，將對象多肽序列與候選多肽序列進行比較。利用bl2seq的默認參數(shù)，除了應(yīng)該關(guān)閉低復(fù)雜性區(qū)域過濾外?？梢允褂孟铝蠻NIX命令行參數(shù)，檢驗多肽序列的相似性:bl2seq-1peptideseql-j peptideseq2_F F_p blastp。參數(shù) _F F 關(guān)閉低復(fù)雜性區(qū)域過濾。參數(shù)-P選擇用于序列對的恰當算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列之間的相似區(qū)域，并且為每個這類區(qū)域報告“E值”，所述E值是在含有隨機序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中，可預(yù)期偶然發(fā)現(xiàn)此類匹配的次數(shù)。對于遠低于I的小的E值，這近似是此類隨機匹配的概率。當與任一條具體鑒別的序列比較時，變體多肽序列通常表現(xiàn)出低于I X 10_5、低于I X 10_6、低于I X 10_9、低于1X10—12、低于1X10—15、低于1X10—18或低于1X10-21的E值。還可以使用全局序列比對程序，在重疊的全長上計算候選和對象多肽序列之間的多肽序列同一性。如上所述，EMBOSS-needle (可獲得自 http: /www.eb1.ac.uk/emboss/align/)和 GAP (Huang, X.(1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the BioscienceslO，227-235.)也是用于計算多肽序列同一性的合適的全局序列比對程序。BLASTP的用途優(yōu)選的用于確定根據(jù)本發(fā)明的多肽變體。
在一個實施方案中，變體包括這樣的肽，所述肽的序列通過不影響肽的生物學(xué)活性的1、2、3、4、5、6或更多個保守氨基酸替換、缺失、添加或插入，而不同于本文中的人信號肽和片段。保守性替換通常包括將ー個氨基酸替換為具有相似特征的另ー個氨基酸，例如下列組中的替換:纈氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。保守性替換的實例還可見于序列表所示的序列，其中顯示了不同哺乳動物物種中較之人序列的替換。其他保守性替換是本領(lǐng)域已知的。還可以使用非保守性替換，可以引起例如用一種氨基酸類別的成員(例如，疏水性、中性親水性、酸性、堿性、影響鏈取向的殘基，和芳香族)交換另ー種類別的成員。其他變體包括具有影響肽穩(wěn)定性的修飾的肽。此類類似物可以在肽序列中含有例如ー個或多個非肽鍵(其替代肽鍵)。還包括這樣的類似物，所述類似物包括并非天然存在的L-氨基酸的殘基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸，例如P或Y氨基酸和環(huán)狀類似物?！皩ο蟆痹诒疚闹袃?yōu)選是哺乳動物，包括人和非人哺乳動物，例如貓、狗、馬、牛、羊、鹿、小鼠、大鼠、靈長類(包括大猩猩、恒河猴和黒猩猩)，以及其他的馴養(yǎng)的農(nóng)場動物或動物園動物。在一個實施方案中，哺乳動物是人。術(shù)語“表現(xiàn)”在本文中用于指，包括，例如在處于醫(yī)療設(shè)施(例如醫(yī)生辦公室，臨床或醫(yī)院)的醫(yī)務(wù)人員面前的對象的表現(xiàn)。然而，表現(xiàn)包括在將使用本發(fā)明的任何人(例如救護車上的急救醫(yī)士人員)前的對象的表現(xiàn)。術(shù)語“治療 ”和“預(yù)防”指減輕、改善、管理、預(yù)防、壓抑、停止或逆轉(zhuǎn)生物學(xué)事件進展的治療性或預(yù)防性措施，所述生物學(xué)事件的特征是顯示出與正常的對照水平有差異的EPOsp和/或CNPsp多肽或多肽片段水平，包括心血管疾病、ACS、腎病和AMI，以及本文提及的其他病癥和病況。對象可以表現(xiàn)出在葡萄糖、乳酸、胰島素、脂肪酸、甘油三酷、Tnl、TnT、BNP、N-BNP、BNP-SP、ANP、ANP-SP、肌酸激酶-MB、肌紅蛋白LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶、H-FABP、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)素、凝乳酶、血管緊張素II和其他標志物中的一種或多種中可觀察到的或可測量的(統(tǒng)計學(xué)顯著)降低。術(shù)語“質(zhì)譜”在本文中用于指基于離子的質(zhì)量電荷比來過濾、檢測和測量離子的方法。參見例如 US5, 719，060、US6, 204，500、US6, 107，623、US6, 124，137、US6, 225，047、US6, 268，144、US7, 057，165和US7, 045，366。常見的質(zhì)譜技術(shù)包括基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)和表面增強激光解吸離子化(SELDI)。兩種都可以與飛行時間分析儀偶聯(lián)(MALD1-T0F和SELD1-T0F)，允許在非常短的離子脈沖中分析飛克摩爾水平的分析物。例如在US5，719，600、US6, 124，137和US6，225，047中討論的，可用于本發(fā)明中的SELDI版本，包括表面增強的親和捕獲(SEAC)、表面增強的整齊解吸(SEND)和表面增強的光不穩(wěn)定的附著和解離(SEPAR)。參考本文公開的數(shù)值范圍(例如I至10)意在包含參考該范圍內(nèi)所有相關(guān)的數(shù)值(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)，以及該范圍內(nèi)的任何合理的數(shù)值范圍(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，因此，本文明確公開的所有范圍中的所有子范圍也是明確公開的。這僅是具體提及的實例，在枚舉的最小值和最大值之間的所有可能的數(shù)值組合都以類似的方式被認為是在該申請中明確陳述的。
發(fā)明詳述長期以來認為，EPOsp和/或CNPsp的功能作用限于控制親代分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的運輸。已經(jīng)假設(shè)一旦完成此過程，信號肽就被降解，而從未從細胞分泌。12本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，EPOsp和/或CNPsp、EPOsp和/或CNPsp片段可獲得自生物學(xué)樣品，并出現(xiàn)在例如循環(huán)中。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EPOsp和CNPsp及其片段可用作例如，用于一系列的生物學(xué)事件或病癥的循環(huán)生物標志物。較之現(xiàn)存的標準標志物，EPOsp和/或CNPsp的免疫反應(yīng)性信號肽片段的使用和測量提供了優(yōu)秀的檢測和區(qū)分能力。在這此方面，注意到快得多的在血液中到達峰值水平的時間和每種標志物針對病況的特異性性質(zhì)。關(guān)于后者，還注意到每種信號肽片段的器官特異性定位。因此，EPOsp是從腎臟中釋放的，而CNP是從心臟和血管中釋放的。此外，由于較之現(xiàn)有標志物，信號肽在血液中具有更短的半壽期，因此它們具有更快升高和降低，檢測潛在的活動性疾病的能力。對于現(xiàn)有標志物而言則并非如此，現(xiàn)有標志物具有長的半壽期，因此，其具有不能快速響應(yīng)活動性疾病的血液水平。在ー個方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的生物學(xué)事件的方法，其中，事件與EPOsp和/或CNPsp片段中的一種或多種釋放到循環(huán)中相關(guān)，方法包括:(a)測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp片段中的ー種或多種的水平；和(b)將EPOsp和/或CNPsp片段中的ー種或多種的水平與來自對照的EPOsp和/或CNPsp片段中的ー種或多種的水平進行比較，

其中，測量水平與對照水平的差異提示了生物學(xué)事件。生物學(xué)事件或病癥包括急性和慢性腎病或損傷、心カ衰竭、高血壓、暈厥，和慢性心血管疾病、包括動脈粥樣硬化的血管疾病、易損斑塊，或包括心肌梗死和絞痛(不穩(wěn)定的)的急性心臟綜合癥或病癥，以及穩(wěn)定的絞痛中的ー種或多種。申請人:還驚訝地發(fā)現(xiàn)在具有急性心肌梗死(AMI)的患者中，在患者的癥狀發(fā)作后的最初幾小時中，EPOsp和/或CNPsp片段的循環(huán)濃度最高。令人驚訝地，在最初2至6小時，或4小時中觀察到的水平非常高，通常達到比正常對照群體中的水平高約1.5至5倍，通常高2至3倍的峰?？偠灾?，EPOsp和/或CNPsp片段中的ー種或多種可用作例如急性冠脈綜合癥(ACS)如AMI (特別是非ST升高的MI)、急性心肌局部缺血和本文提及的其他病癥的明確的早期階段標志物?；谶@些令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，申請人首次確定，篩選從對象采集的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或其變體或片段是有用的，特別是在例如病癥發(fā)作或臨床表現(xiàn)的12、10、8、6、4、2或I小時內(nèi)。EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種的抗原性片段或變體在本發(fā)明中是有用的，其長度至少是4或5個氨基酸長。特別有用的片段是本文的信號肽的N端(1-9)或C端。具體抗原性肽的實例顯示在SEQ ID NO:1-6中。核酸分子和肽都構(gòu)成本發(fā)明的方面。本發(fā)明的具體多肽包括具有本文示出的SEQ ID NO:1_6中任一項的氨基酸序列的多肽。還考慮了本文定義的這些多肽的變體和片段，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%,90^,95%或99%氨基酸同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，變體或片段是功能上等價的變體或片段。即，變體或片段保留了作為抗原或信號肽功能。SEQ ID NO:1-6中任一項的肽可用于制備結(jié)合劑，例如抗體。可以使用本領(lǐng)域普遍已知的肽合成方法制備包括變體多肽和片段的多肽，例如使用固相的直接肽合成或自動化合成。還可以使用合成方法生產(chǎn)多肽的突變的形式，例如編碼氨基酸序列的DNA的位點特異性誘變。在一個實施方案中，多肽及其變體多肽和片段是分離的。它們可以從天然來源分離或純化，或者使用本領(lǐng)域普遍已知的多種技術(shù)合成。技術(shù)包括HPLC、離子交換層析和免疫層析，但不限于此。在另ー個方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的急性心臟綜合癥的方法,方法包括:測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或片段的水平，并將所述EPOsp和/或CNPsp或片段的水平與來自對照的水平進行比較，其中，測量水平高于對照水平并且提示了 ACS。在其他方面，本發(fā)明提供了用于監(jiān)控對于對象中的ACS或慢性腎病的治療的響應(yīng)的方法，方法包括測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種或片段的水平，并將所述EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或片段的水平與來自對照的水平進行比較，其中，測量水平相對于對照水平的改變提示了對治療的響應(yīng)。熟練的讀者可以理解，出于評估的目的，EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或片段的水平可有用地與參照值或?qū)φ罩当容^或關(guān)聯(lián)。如本文中使用的，對照可以是個體或組，從其中采集EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種或片段的樣品，并確定平均水平。通常，個體或組可包含正常的健康個體或未知患有待監(jiān)控的生物學(xué)事件的個體的組。正常`個體中的EPOsp片段的水平的范圍在約14-90pmol/L之間(平均是約50pmol/L)。正常個體中的CNPsp片段的水平的范圍在約8_50pmol/L之間，而平均對照水平是約21pmol/L。備選地，可以基于來自之前測試過的個體或組的多個讀數(shù)，估計對照水平。將理解，測量樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或其片段的水平的步驟可以是對單個樣品的單次測量，或?qū)Χ鄠€樣品的重復(fù)測量，取決于所研究的生物學(xué)事件。在ACS的情況下，測量可包含，例如，在不同時間采集的樣品中測量EPOsp和/或CNPsp或片段I至20次或更多次，測量EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種或其片段I至10、I至
5、I至3，或2或3次。在一個實施方案中，測量是對這樣的樣品進行的，所述樣品是在病癥或疑似病癥的發(fā)作或臨床表現(xiàn)后的前12、10、8、6、5、4、2小時內(nèi)，或I小時或更少的時間內(nèi)采集的。還可以在上述取樣期以外進行單次或重復(fù)的測量，以確立EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或其片段的水平是否已經(jīng)落至正常的對照水平，或者例如心臟組織的對照水平。在一個實施方案中，方法包括測量發(fā)作或表現(xiàn)后的第一個小時內(nèi)采集的I個或2個樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或其片段的水平，隨后測量發(fā)作或表現(xiàn)后的2至4小時，或2至3小時內(nèi)采集的I個或2個樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種或其片段的水平，或進行EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或其片段的水平的初
始測量。
如上所述，在ACS、心力衰竭或腎衰竭發(fā)作或表現(xiàn)后的前I小時至12、10、8、6、4或2小時或更少的時間內(nèi)所測量的EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種其片段的水平，例如，比正常對照中測量的水平高1.5至10、1.5至5倍，通常高2至3倍。在一個實施方案中，校正預(yù)后、診斷或監(jiān)控工具，以測量對應(yīng)于SEQ ID NO:1,2,3,
4、5或6中任ー項(或其非人類似物或變體)的肽或肽片段中的ー種或多種，或其他信號肽片段的水平，所述水平在例如從0.1至1500pmol/L、0.1至500pmol/L、I至300pmol/L、10至250或20至150pmol/L的范圍內(nèi)。此外，紅細胞生成素信號肽可見于包括血漿樣品的生物學(xué)樣品中，水平在從約400至4000pmol/L，約400至200pmol/L，約320至520pmol/L，或約400-420pmol/L或更低的范圍內(nèi)。低至至少5pmol/L的水平是可檢測的。血管緊張素信號肽可見于包括血衆(zhòng)樣品的生物學(xué)樣品中，水平在從約10至1000pmol/L,約5至500pmol/L,約I至100pmol/L,或約0.1至10pmol/L或更低的范圍內(nèi)。低至至少0.lpmol/L的水平是可檢測的。C型利尿鈉信號肽可見于包括血漿樣品的生物學(xué)樣品中，水平在從約50至1500pmol/L,約25至750pmol/L,約10至500pmol/L,或約5至150pmol/L或更低的范圍內(nèi)。低至至少2pmol/L的水平是可檢測的。內(nèi)皮素-1信號肽可見于包括血漿樣品的生物學(xué)樣品中，水平在從約 10 至 200pmol/L,約 5 至 100pmol/L,約 10 至 50pmol/L,或約 I 至 20pmol/L 或更低的范圍內(nèi)。低至至少lpmol/L的水平是可檢測的。在另ー個實施方案中，樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或其片段在約 40 至約 250pmol/L，約 65 至 250pmol/L，約 65 至 200pmol/L，約 70 至 150，或約 70 至130pmol/L的范圍內(nèi)的水平提示了 ACS。上文定義的生物學(xué)樣品可以是任何生物學(xué)材料，所述材料中可以定位或分泌EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種或其片段。在一個實施方案中，生物學(xué)樣品是循環(huán)的生物學(xué)樣品，例如血液、血清或血漿。在一個實施方案中，生物學(xué)樣品是心臟組織。核酸測定 可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，確定樣品中的EPOsp和/或CNPspEPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段的存在和表達水平，例如Southern印跡、Northern印跡、FISH或定量mRNA轉(zhuǎn)錄的定量PCR12，斑點印跡，(DNA分析)或使用基于本文提供的序列的恰當?shù)慕?jīng)標記的探針的原位雜交。在一個實施方案中，雜交探針是經(jīng)標記的探針。標記的實例包括熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性酶和生物素-鏈霉親和素標記。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(例如上文所述)，進行經(jīng)標記的探針的標記和可視化。出于方便，核酸探針可以固定在固體支持物上，包括樹脂(例如聚丙烯酰胺)、碳水化合物(例如瓊脂糖)、塑料(例如聚碳酸酷)和乳膠珠?？梢允褂靡阎默F(xiàn)有技術(shù)，例如RT-PCR和電泳技術(shù)，包括SDS-PAGE，來確定核酸的表達水平。使用這些技木，擴增對象樣品中的本發(fā)明核酸分子的DNA或cDNA序列，測量DNA或cDNA或RNA的水平。在備選的方法中，可以直接測量樣品中的DNA、cDNA或RNA水平而不進行擴增。在一個實施方案中，方法是Northern印跡雜交分析。備選地，可以使用基于逆轉(zhuǎn)錄的PCR(RT-PCR)測定來測量表達水平，所述測定使用核酸序列特異性的引物。如果需要，可以參考其表達不依賴于測量的參數(shù)或條件的對照核酸分子，與樣品中的EPOsp和/或CNPsp多核苷酸中的ー種或多種的水平進行比較。對照核酸分子指在病癥或移植排斥狀態(tài)與健康狀態(tài)之間沒有水平差異的分子。對照分子的水平可用于歸ー化所比較的群體中的水平。此類對照分子的實例是GAP-DH。本發(fā)明的EPOsp和/或CNPsp多肽和片段將隨著生物學(xué)事件或病癥而改變水平。肽測定在一個實施方案中，測量步驟包括檢測EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段與結(jié)合劑之間的結(jié)合，所述結(jié)合劑例如選擇性或特異性地結(jié)合EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段或變體。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段或變體的測定，測定包括使用任何已知的方法，檢測和測量樣品中其水平。在一個實施方案中，在從ACS或與生物學(xué)樣品中的片段的濃度或量相關(guān)的其他病癥的發(fā)作起約12、10、8、6、4小時或更少時間內(nèi)，或例如，ACS臨床表現(xiàn)的約12、10、8、6、4小時或更少時間內(nèi)，從對象獲得生物學(xué)樣品，并且測量EPOsp和/或CNPsp或其片段。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于EPOsp和/或CNPspEPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段的測定，包括:(a)結(jié)合來自生物學(xué)樣品的EPOsp和/或CNPspEPOsp和/或CNPsp中的一種或多種，或其片段；和(b)測量結(jié)合的EPOsp和/或CNPspEPOsp和/或CNPsp，或其片段肽或片段的水平。在一個實施方案中，靶分子是SEQ ID NO:1_6中的ー種或多種或其變體或片段。在一個實施方案中，使用結(jié)合劑來結(jié)合EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段。結(jié)合劑可以是選擇性(特異性)結(jié)合剤。即，其與生物學(xué)事件的其他標志物(更特別的是生長素釋放肽(ghrelin))具有低交叉反應(yīng)性。在一個實施方案中，結(jié)合劑是抗體或包含其抗原結(jié)合片段的分子。當在測定中使用抗體時，抗體可以針對EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段，包括在N端或C端內(nèi)的任何抗原性部分，只要其結(jié)合見于生物學(xué)樣品中的片段，優(yōu)選其中存在的片段提示是從細胞分泌的樣品。在一個實施方案中，抗體針對根據(jù)SEQ ID NOS:1-6中任ー種或多種或其變體或片段的肽。本發(fā)明還涉及結(jié)合劑，包括例如抗體和抗體的抗原結(jié)合片段，及其用途。用途包括測定中的用途，或生產(chǎn)測定中的用途，或作為本文所述提供的預(yù)后、診斷或監(jiān)控工具，如帶有使用說明的相關(guān)的試劑盒的用途。結(jié)合劑，例如抗體，可以是分離的或純化的形式。結(jié)合EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段或變體的抗體可以處于任何形式，包括例如所有類別的多克隆、單克隆、單鏈、人、人源化抗體和嵌合抗體，和其他的抗原結(jié)合構(gòu)建體。還包括提供免疫動物(例如小鼠、大鼠或兔)獲得的抗血清?？贵w結(jié)合片段組中的共同序列，或結(jié)合特異性的EPOsp和/或CNPsp片段，或者甚至結(jié)合片段的集合?？梢允褂每贵w 或修飾的抗體的片段，只要其結(jié)合希望的信號肽或其片段或變體?？乖Y(jié)合片段可以是例如Fab、F(ab’)、F(ab’)、Fv片段或單鏈Fv(scFv)，其中來自H和L鏈的Fv片段是通過恰當?shù)慕宇^連接的。13用于制備抗體的方法，和檢測、修飾和分離其的方法是本領(lǐng)域普遍已知的。14’15’16在一個實施方案中，使用的抗體是通過免疫合適的宿主哺乳動物生產(chǎn)的。還可以使用包含EPOsp和/或CNPsp中的一種或多種或其片段的融合蛋白作為免疫原。
可以通過與多種分子(例如聚こニ醇(PEG)、生物素、鏈霉親和素和本文討論的化學(xué)發(fā)光、熒光、量熱和放射免疫標記)綴合，來修飾結(jié)合劑，例如包含抗原結(jié)合位點的抗體或其他分子?？梢酝ㄟ^對抗體進行化學(xué)修飾來獲得經(jīng)修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的。簡而言之，制備多克隆抗體的方法是熟練的技術(shù)人員已知的。可以在哺乳動物產(chǎn)生多克隆抗體，例如，通過一次或多次注射免疫試劑，以及需要時注射佐劑。通常，通過多次皮下或腹腔內(nèi)注射，將免疫劑和/或佐劑注射到哺乳動物中。免疫劑可以包括EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種、或其片段或變體、或其融合蛋白。將免疫劑與已知在被免疫的哺乳動物是免疫原性的蛋白質(zhì)綴合是有用的。此類免疫原性蛋白質(zhì)的實例包括但不限于鑰孔蟲血藍蛋白、牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑?？梢允褂玫淖魟┑睦影ǜナ贤耆魟┖蚆PL TDM佐劑(單磷酰酯A,合成的海藻糖dicorynomycolate)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇免疫方法而無需過度實驗?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普遍已知的雜交瘤方法制備單克隆抗體。雜交瘤細胞可以培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，備選地，雜交瘤細胞可以在體內(nèi)生長，如在哺乳動物的腹水中。優(yōu)選的永生細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，可獲得自例如美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American TypeCulture Collection, Virginia, USA)。可以使用免疫測定篩選分泌目標抗體的永生細胞系。篩選中可以使用EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段或變體。因此本文還考慮了能夠分泌EPOsp和/或CNPsp片段特異性的單克隆抗體的永生細胞系的雜交瘤。用于確定由雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性的普遍已知的手段包括免疫沉淀、放射連接 的免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和Western印跡。例如，可以通過Scatchard分析,確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。14可以類似地篩選來自經(jīng)免疫的動物的樣品多克隆抗體的存在。還可以從重組的宿主細胞中獲得單克隆抗體和其他抗原結(jié)合構(gòu)建體?？梢詮碾s交瘤細胞系獲得編碼抗體或抗原結(jié)合構(gòu)建體的DNA。然后，將DNA置入表達載體中，轉(zhuǎn)染進入宿主細胞(例如，COS細胞、CHO細胞、大腸桿菌細胞)中，并在宿主細胞中生產(chǎn)抗體或抗原結(jié)合構(gòu)建體。然后使用標準技術(shù)分離和/或純化抗體。為了協(xié)助檢測，可以用可檢測的標志物(例如熒光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的化合物，以及放射性同位素、磁珠和親和性標記(例如，生物素和抗生物素蛋白))標記本文中的抗體和片段。允許間接測量結(jié)合的標記的實例包括底物可以提供顯色的熒光產(chǎn)物的酶，合適的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶等?？梢允褂脽晒馊玖?例如，德克薩斯紅、熒光素、藻膽蛋白和藻紅蛋白)和熒光激發(fā)的細胞分選儀。標記技術(shù)是本領(lǐng)域普遍已知的。可以通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，例如，逆相HPLC、蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層祈，從培養(yǎng)基或腹水中分離或純化單克隆抗體(例如由細胞分泌的)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何工具，包括特異性(基于抗體的)和非特異性(例如HPLC固相)的工具，檢測EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段的結(jié)合。最常見的是，使用上述測定，例如ELISA或RIA，來檢測抗體。単獨的競爭性結(jié)合測定、夾心測定、非競爭性測定、熒光免疫測定、免疫熒光測量測定或免疫放射測定、發(fā)光測定、化學(xué)發(fā)光測定，和質(zhì)譜分析，如表面增強的激光解吸和離子化(SELDI)、電噴霧離子化(ESI)、基質(zhì)輔助的激光解吸離子化(MALDI)、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR)，或與非特異性的結(jié)合劑的組合(例如層析形式)也是可行的。方便地，可以將抗體固定在固體底物上，以協(xié)助洗滌和分離多肽/抗體復(fù)合物?？梢允褂靡阎募夹g(shù)實現(xiàn)抗體與固體支持物的結(jié)合。對于抗體有用的固體底物包括玻璃、尼龍、紙和塑料。類似地，EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段可以被吸附到固體底物上，例如吸附性硅膠或樹脂顆粒，或任選地用離子交換、逆相(例如C18包被)或其他材料包被或衍生化的硅芯片。底物的形式可以是珠、平板、管、棍或生物芯片。生物芯片的實例包括可獲得自 Perkin Elmer, USA 的 Ciphergen、ProteinChip 陣列(CiphergenBiosystems (CA, USA))和Packard BioChips0生物芯片可包括層析表面。具有可尋■址的位置以及精細的微滴度板的生物芯片或平板是特別有用的。還優(yōu)選使用的是多元系統(tǒng)，其中，使用含有針對多個分析物的抗體的珠子來測量單個樣品中的分析物的水平。待測量的分析物可以包括其他標志物，例如心臟標志物，以及EPOsp和/或CNPsp，或其變體或片段。適合用于本文中的多兀珠系統(tǒng)的一個實例是Luminex Flurokine Multianalyte Profiling系統(tǒng)?？贵w測定方法是本領(lǐng)域普遍已知的，參見例如US5, 221，685、US5, 310，687、US5, 480，792、US5, 525，524、US5, 679，526、US5, 824，799、US5, 851，776、US5, 885，527、US5, 922，615、US5, 939，272、US5, 647，124、US5, 985，579、US6, 019，944、US6113, 855、US6, 143，576，而關(guān)于未標記的測定，參見US5, 955，377和US5, 631，171。本文引用的所有文獻都通過引用全文整合到本文中。免疫測定分析儀也是普遍已知的，并且除其他已經(jīng)詳細描述過的之外，包括Beckman Access、Abbott AxSym、Roche ElecSys/Cobas 和 Dade Behring Status 糸統(tǒng)?？梢灾苯踊蜷g 接地檢測由EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段與抗體結(jié)合形成復(fù)合物。使用標記，例如熒光、發(fā)光、放射性核素、金屬、染料等進行直接檢測。間接檢測包括結(jié)合可檢測的標記，例如地高辛或酶(例如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)，以形成標記的抗體，隨后進行通過添加檢測試劑來檢測標記的步驟。例如，辣根過氧化物酶可以與底物(如鄰-苯ニ胺ニ鹽酸鹽(OPD)和過氧化物)孵育，以生成可以測量其吸光值的顯色產(chǎn)物，或與魯米諾和過氧化物孵育，以產(chǎn)生可以在光度計中測量的化學(xué)發(fā)光，如本領(lǐng)域已知地。生物素或地高辛可以與和它們強有力地結(jié)合的結(jié)合劑反應(yīng)。例如，蛋白質(zhì)抗生物素蛋白和鏈霉親和素將強有力地結(jié)合生物素。然后，通過與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)，或者通過使用通?？色@得的交聯(lián)劑(例如MCS和碳ニ亞胺)，或者通過添加螯合劑，共價結(jié)合或連接另外的可測量的標記。一般而言，通過例如離心，分離復(fù)合物和未復(fù)合的試劑。如果抗體是被標記的，則通過檢測到的標記的量來反映復(fù)合物的量。備選地，可以通過與抗體結(jié)合，來標記EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段，并通過當抗體標記的多肽與含有未標記的EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段的生物學(xué)樣品孵育時，測量已結(jié)合的經(jīng)標記的多肽的減少，在競爭性測定中檢測所述EPOsp和/或CNPsp中的ー種或多種，或其片段?？梢允褂闷渌庖邷y定，例如夾心測定。
在一個實施方案中，在與抗體接觸后，通常在4°C 18至25小時過夜，或在25°C至40°C I至2至4小時，將與結(jié)合劑(抗體)結(jié)合的經(jīng)標記的EPOsp和/或CNPsp，或其片段與未結(jié)合的經(jīng)標記的EPOsp和/或CNPsp，或其片段分開。在溶液相的測定中，通過添加與固相顆粒(例如纖維素或磁性材料)偶聯(lián)的抗Y球蛋白抗體(第二抗體)，完成分離。第ニ抗體是在與第一抗體使用的物種不同的物種中產(chǎn)生的，并且結(jié)合第一抗體。因此，所有的第一抗體都通過第二抗體與固相結(jié)合。通過離心或磁力吸引從溶液中去除該復(fù)合物，并且使用與其結(jié)合的標記測量所結(jié)合的經(jīng)標記的肽。用于分離結(jié)合的和游離的標記的其他選項包括形成從溶液中沉淀的免疫復(fù)合物，通過聚こニ醇沉淀抗體，或?qū)⒂坞x的經(jīng)標記的肽與木炭結(jié)合并通過過濾離心從溶液中去除。通過恰當?shù)姆椒?，例如上文所述那些，測量分開的結(jié)合的或游離相中的標記。競爭性結(jié)合測定也可以配置為固相測定，所述固相測定易于實施，并因此比上述測定更優(yōu)選。這ー類型的測定使用具有孔的平板(通常被稱為ELISA或免疫測定平板)、固體珠或管表面。第一抗體吸附于或共價結(jié)合在平板、珠子或管的表面上，或者通過抗Y球蛋白或抗Fe區(qū)第二抗體間接結(jié)合，所述第二抗體吸附于平板或與平板共價結(jié)合。將樣品和經(jīng)標記的肽(如上)同時或順序添加到平板中，并且在允許樣品中的EPOsp和/或CNPsp，或其片段和經(jīng)標記的肽之間的抗體競爭結(jié)合的條件下孵育。之后，可以吸去未結(jié)合的經(jīng)標記的肽，并漂洗平板，留下與附著在平板上的與抗體結(jié)合的經(jīng)標記的肽。然后，可以使用上述技術(shù)測量經(jīng)標記的肽

夾心型測定具有更高的特異性、速度和更大的測量范圍。在該類型的測定中，如上所述，將過量的EPOsp和/或CNPsp，或其片段的第一抗體通過吸附、共價偶聯(lián)或抗Fe或Y球蛋白抗體，附著至ELISA板的孔、珠子或管，用于進行固相競爭性結(jié)合測定。將樣品流體或提取物與附著在固相上的抗體接觸。因為抗體是過量的，因此該結(jié)合反應(yīng)通常很快。還將EPOsp和/或CNPsp，或其片段的第二抗體和第一抗體同時或相繼與樣品孵育。選擇與EPOsp和/或CNPsp，或其片段上的位點結(jié)合的第二抗體，所述位點不同于第一抗體的結(jié)合位點。此兩種抗體反應(yīng)導(dǎo)致了樣品的EPOsp和/或CNPsp，或其片段夾在兩種抗體之間的夾心物。第二抗體通常是用如上所述用于競爭性結(jié)合測定的便于檢測的化合物標記的。備選地，可以將特異性結(jié)合第二抗體的經(jīng)標記的第三抗體與樣品接觸。在洗去未結(jié)合的材料后，可以通過競爭性結(jié)合測定中概述的方法，測量和定量結(jié)合的經(jīng)標記的抗體。還可以使用量尺(dipstick)型測定。這些測定是本領(lǐng)域普遍已知的。它們可以使用例如小顆粒，如附著了特異性抗體的金或有色的乳膠顆粒?？梢詫⒋郎y量的液體樣品添加到預(yù)載了顆粒的膜或紙條的一端，允許其沿著紙條遷移。樣品中的抗原與顆粒的結(jié)合改變了顆粒與捕獲位點結(jié)合的能力，所述捕獲位點含有顆粒的結(jié)合劑(例如抗原或抗體)，進ー步沿紙條。有色顆粒在這些位點的積累導(dǎo)致了依賴于樣品中的競爭抗原的濃度的顯色。其他量尺方法可以使用與紙或膜條共價結(jié)合的抗體，來捕獲樣品中的抗原。應(yīng)用與酶(如辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的第二抗體的后續(xù)反應(yīng)，和產(chǎn)生顏色、熒光或化學(xué)發(fā)光輸出的與底物的孵育，將使得能夠定量樣品中的抗原。如下列實例中所討論的，在一個實施方案中，放射性免疫測定(RIA)是使用的實驗室技木。在ー種RIA中，在與抗體的競爭性結(jié)合中使用了放射性標記的抗原和未經(jīng)標記的抗原。常見的放射性標記包括1251、1311、3h和14C。
涉及用特異性抗體和放射性標記的抗體結(jié)合蛋白沉淀EPOsp和/或CNPsp,或其片段的放射免疫測定可以測量沉淀物中的經(jīng)標記的抗體的量，與樣品中的EPOsp和/或CNPsp,或其片段的量成比例。備選地，生產(chǎn)經(jīng)標記的EPOsp和/或CNPsp，或其片段，并使用未標記的抗體結(jié)合蛋白。然后加入待測試的生物學(xué)樣品。經(jīng)標記的EPOsp和/或CNPsp，或其片段的計數(shù)的減少與樣品中的EPOsp和/或CNPsp，或其片段的量成比例。在RIA中，分離游離的EPOsp和/或CNPsp，或其片段與結(jié)合的EPOsp和/或CNPsp，或其片段也是可行的。這涉及用第二抗體沉淀肽/抗體復(fù)合物。例如，如果肽/抗體復(fù)合物含有兔抗體，則可以使用驢抗兔抗體來沉淀復(fù)合物并計算標記的量。例如在LKB，Gammamaster 計數(shù)器中。9本發(fā)明的方法還包括測量腎病、心血管疾病等的ー種或多種其他標志物的水平?？梢员容^其他標志物的水平與來自對照群體的平均對照水平。測量水平與平均對照水平的差異是急性或慢性腎病、急性或慢性心血管疾病等的預(yù)測或診斷或傾向。已關(guān)于EPOsp和/或CNPsp，或其片段較高的水平或水平的增加描述了本發(fā)明的方法，所述水平提示了急性冠脈綜合癥(例如，AMI和絞痛)、心カ衰竭、包括動脈粥樣硬化的血管疾病和慢性腎病。還考慮了高于或低于對照水平的測量差異。
·
其他標志物包括肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白1、肌酸激酶MB、肌紅蛋白、BNP, NT-BNP,BNP-SP、ANP、ANP-SP、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、H-FABP、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)激素、凝乳酶和血管緊張素II。這些標志物都涉及心臟功能失調(diào)或疾病。用于實施此類測定的試劑盒和試劑都是可自多個供應(yīng)商商購的。將EPOsp和/或CNPsp，或其片段的水平與其他標志物關(guān)聯(lián)，可以增加EPOsp和/或CNPsp，或其片段的預(yù)測、診斷或監(jiān)控價值。在ACS的情況下，將EPOsp和/或CNPsp，或片段標志物的水平與已知的心臟標志物組合可以增加對患者結(jié)果的預(yù)測或診斷價值。使用單個測試樣品，可以同時或分別進行對多個肽標志物的分析。同時的雙位點或多位點形式的測定是優(yōu)選的。多元化珠、微陣列或生物芯片系統(tǒng)是特別有用的。珠、測定或芯片可以具有多個精細的、通常是可尋址的位置，包含一種或多種標志物的抗體，所述標志物包括EPOsp和/或CNPsp，或其片段。一種或多種標志物包括ー種以上的EPOsp和/或CNPsp，或其片段標志物。例如，測定EPOsp和/或CNPsp，或其片段的N端和C端片段，并組合測定結(jié)果是有用的。許多其他的此類標志物組合是可能的。US2005/0064511和US6，019，944提供了對可用于本發(fā)明中的微陣列、芯片、毛細管裝置和技術(shù)的描述。Luminex提供了可用于本發(fā)明中的多元化珠系統(tǒng)。適用于単獨或順序測定的實驗室分析儀包括AxSym(Abbott, USA)、ElecSys (Roche)、Access (Beckman)、ADVIA CEISTA(JR (Bayer)
和 Nichols Advantage (Nichols Institute)免疫測定系統(tǒng)。在一個實施方案中，在單個表面上，例如芯片或陣列，實施多種多肽的同時測定。在另ー種實施方案中，對ー種或多種非EPOsp和/或CNPsp，或片段標志物進行單獨測定，并將結(jié)果與EPOsp和/或CNPsp，或片段標志物的結(jié)果核對或組合。在監(jiān)控對象時，可以隨時間采集多個生物學(xué)樣品。連續(xù)采樣允許隨時間測量標志物水平的改變。采樣可以為事件發(fā)作的大致時間、事件的嚴重程度、提示哪種治療方案是恰當?shù)?、對于所?yīng)用的治療方案的應(yīng)答或長期預(yù)后提供信息?？梢栽谧o理場所進行分析，例如在救護車、醫(yī)生辦公室、臨床表現(xiàn)時，住院期間或出院患者中，患者在常規(guī)的健康篩查過程由T寸。本發(fā)明的方法還可以與一種或多種風(fēng)險因子的分析聯(lián)合實施，所述風(fēng)險因子例如但不限于年齡、體重、生理活動的水平、性別和事件的家族史，例如肥胖、糖尿病和心臟事件。測試結(jié)果還可以與本發(fā)明的方法聯(lián)合使用。例如，葡萄糖耐量測試、ECG結(jié)果和臨床檢驗。EPOsp和/或CNPsp，或其片段的循環(huán)水平的統(tǒng)計學(xué)顯著的改變，以及ー種或多種額外的風(fēng)險因子或測試結(jié)果可用于更準確地診斷、預(yù)測或監(jiān)測對象的病況。急性心臟綜合癥申請人:已經(jīng)顯示多種信號肽片段的濃度與急性心臟病癥相關(guān)(圖6)。此外，在出現(xiàn)疑似的急性心肌梗死(AMI)或者心臟病發(fā)作的患者的情況下，EPOsp和/或CNPsp，或其片段的水平在臨床表現(xiàn)時是最高的。表現(xiàn)出急性心臟綜合癥或病癥，特別是由心肌或心肌層中的心臟病發(fā)作遺留疤痕導(dǎo)致的急性心臟局部缺血性冠狀動脈病的患者，可能經(jīng)歷或不經(jīng)歷隨后的心肌梗死(MI)。不能使用現(xiàn)有的臨床技術(shù)和標志物方便地診斷不經(jīng)歷MI的組。申請人已經(jīng)提供了有效的早期和特異性標志物，用于例如與MI相關(guān)的心肌損害。這將允許早期診斷由不利事件導(dǎo)致的心肌損害，并允許醫(yī)生區(qū)別此類病例與其他的急性冠脈綜合癥(包括絞痛)，以及與胸痛的其他病因(例如，胃腸道疾病、肺/胸膜病癥等)。這顯著地縮短了目前等待現(xiàn)有心臟生物標志物(例如肌紅蛋白、CK-MB、TnT和TnI)的水平升高所經(jīng)歷的窗ロ期。還可以更早實施更精確的診斷和治療，降低發(fā)病率和死亡率，和提供更好的預(yù)后結(jié)果。在另ー個實施方案中，本發(fā)明具有在心臟患者中監(jiān)控再灌注治療的用途。再灌注治療通常包括經(jīng)皮冠脈干預(yù)(例如血管成形木)和/或藥理學(xué)治療。藥理學(xué)治療中通常使用用于再血管化的溶栓性藥物。輔助療法包括抗凝劑和抗血小板療法。當診斷后盡快應(yīng)用吋，再灌注治療是最有效的。使用對EPOsp和/或CNPsp，或其片段的分析來加快診斷允許迅速引入再灌注治療 。還可以通過重復(fù)測試，監(jiān)控治療的效果，并恰當?shù)卣{(diào)整療法。關(guān)于再灌注治療的綜合性討論，參見本文中的Braunwald等人。3心臟病本發(fā)明的方法還可以通過分析EPOsp和/或CNPsp，或其片段，特別是在從循環(huán)采集的生物學(xué)樣品(或源自此類樣品的生物學(xué)樣品)中的EPOsp和/或CNPsp，或其片段，用于診斷或預(yù)測對象中的心臟病。血液興奮劑關(guān)于可供運動員選擇以非法提高其表現(xiàn)的活性劑譜，蛋白質(zhì)和肽提供了有吸引力的選項。在ー個方面，本發(fā)明提供了該問題的解決方法。當通過合成或重組技術(shù)生產(chǎn)時，所制備的蛋白質(zhì)(例如EP0)盡可能近似地模擬存在于循環(huán)或組織中的內(nèi)源性負體(counterpart)。這使得必須去除導(dǎo)致分子易受方便檢測的先驗性或后驗性組分。ー種此類組分是被稱為信號肽的分子區(qū)域。認為源自蛋白質(zhì)的內(nèi)源性生產(chǎn)的信號肽序列經(jīng)歷了細胞內(nèi)破壞，并因此不存在于循環(huán)中。然而，我們研發(fā)了新的免疫測定技木，以證實EPO的信號肽序列不僅存在于人的循環(huán)中，而且還可以在尿液(或另ー種體液、組織樣品等)中測量。相比全長的天然EPO或重組EPO，EPO信號肽序列是非常短的，具有簡單得多的ー級和三級結(jié)構(gòu)，沒有糖基化，使其更易于通過現(xiàn)有的測定形式測量。本文中描述了針對人EPO的信號肽的免疫測定，所述測定對有免疫反應(yīng)性的人EPO信號肽(EPOsp)敏感，并且可以檢測低至< 20fmol/mi( < 640pg/ml)的循環(huán)水平。利用該測定，我們確定了正常人血衆(zhòng)中的EPOsp: EPO比例是約6: I。然而，在具有慢性腎衰竭的患者中，該比例升至約10: 1，而在具有心力衰竭的患者中，該比例是約3: I。因此，在具有不同疾病狀態(tài)的患者中，存在EPOsp: EPO比例的差異應(yīng)答。將該范例應(yīng)用于服用或濫用重組EPO興奮劑的運動員，例如在施用的急性期期間內(nèi)，可以預(yù)期血漿EPOsp: EPO比例將低于1: 1，包括1: 10、I: IOOU: 1000或更低。在重復(fù)施用rEPO后，由于內(nèi)源性分泌和排泄的改變，EPOsp的循環(huán)水平將明顯低于正常的無藥物水平。此外，由于EPOsp是遠小于EPO自身的分子，因此相比血漿EPOsp，它的腎清除率和之后在尿液中的存在將表現(xiàn)出明顯的變化，比例顯著搖擺。試劑盒最常見地，配制試劑盒用于本領(lǐng)域已知的測定，并且在某些實施方案中，用于本領(lǐng)域已知的RIA或ELISA測定。試劑盒還可以包括用于本文提及的病癥的ー種或多種額外的標志物。在例如ACS的情況下，額外的標志物可包括肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白1、肌氨酸激酶MB、肌紅蛋白、ANP、BNP、BNP-SP, ANP、ANP-SP, NT-BNP, LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、H-FABP、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)激素、凝乳酶和血管緊張素II中的ー種或多種。在一個實施方案中，標志物的所有子集都包括在試劑盒中。試劑盒可以由ー個或多個容器組成，還可以包括收集裝置，例如，瓶、袋(例如靜脈輸液袋)、小瓶、注射器和試管。至少包括ー個容器，并且可以裝有對預(yù)測、診斷或監(jiān)控生物學(xué)事件(例如急性或慢性腎病、急性或慢性心血管疾病、ACS等)有用的產(chǎn)物。產(chǎn)物通常是多肽和/或結(jié)合劑，特別是本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段，或包括任何上述物質(zhì)的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，在容器上或與容器相關(guān)的說明書或標簽提示了組合物是用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控生物學(xué)事件的。其他組分可以包括針頭、稀釋劑和緩沖液。有用地，試劑盒可以包括至少ー個容器，所述容器包含可藥用的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。`試劑盒中理想地包括選擇性結(jié)合EPOsp和/或CNPsp，或其片段的結(jié)合剤。在ー個實施方案中，結(jié)合劑是本發(fā)明的抗體，優(yōu)選抗體或抗原結(jié)合片段。測定和試劑盒中使用的抗體可以是例如單克隆或多克隆抗體，并且可以在任何上述哺乳動物中制備，包括例如使用天然的和融合的肽制備的抗體片段和抗體。在一個試劑盒實施方案中，將靶肽檢測試劑固定在固體基質(zhì)上，例如多孔條帶或芯片，形成EPOsp和/或CNPsp，或其片段的至少ー個檢測位點。多孔條帶的測量或檢測區(qū)可以包括多個檢測位點，此類檢測位點含有檢測試劑。位點可以排列成條、十字或點，或其他排列方式。測試條或芯片還可以含有陰性和/或陽性對照的位點。對照位點可以備選地位于不同的條帶或芯片上。不同的檢測位點可以含有不同量的經(jīng)固定的核酸或抗體，例如在第一檢測位點中較高的量，和之后位點中較低的量。添加測試生物學(xué)樣品后，表現(xiàn)出可檢測的信號的位點的數(shù)量提供了存在于樣品中的EPOsp和/或CNPsp，或其片段的量的定量指
/Jn o試劑盒中還包括用于樣品分析的裝置，所述裝置包含用于進行樣品測試的、具有恰當組分(標志物、抗體和試劑)的一次性測試藥筒。裝置方便的包括測試區(qū)和測試結(jié)果窗ロ。免疫層析筒是此類裝置的實例。參見例如US6，399，398 ；US6, 235，241和US5，504,013。
備選地，裝置可以是電動裝置，其允許輸入、儲存和評估相對于對照水平和其他標志物水平的經(jīng)測量的標志物的水平。US2006/0234315提供了此類裝置的實例。還可用于本發(fā)明中的是 Ciphergen 的 Protein Chip ，其可用于使用 Ciphergen 的 Protein Chip 的軟件包處理SELDI結(jié)果。在本說明書中參考專利說明書、其他外部文件或其他信息來源之處，一般是出于提供討論本發(fā)明特征的上下文的目的。除非另外具體說明，對這類外部文件的引用在任何權(quán)限中都不被視為承認此類文件或此類信息來源是現(xiàn)有技術(shù)，或構(gòu)成本領(lǐng)域的一般性常識的一部分。通過參考下列實施例，以非限制性的方式闡明本發(fā)明。實施例1方法所有的人類方法都經(jīng)過新西蘭衛(wèi)生部上南地區(qū)倫理委員會(Upper SouthRegional Ethics Committee of the Ministry of Health, New Zealand)的批準，并且根據(jù)《赫爾辛基宣言》實施?；瘜W(xué)品使用溫和的Fmoc固相合成方法,合成對應(yīng)于EPOsp和CNPsp的合成的人信號肽片段。4’9所有的緩沖液試劑都購自BDH (UK)和/或Sigma (Mo，USA)。合成EPOsp (1-9)和CNPsp(14-23)，其具有用于定向的載體偶聯(lián)的延伸的半胱氨酸(C或N端)。還合成含有酪氨酰的肽，EPOsp (1-9)和CNPsp (14-23)，用于示蹤物制劑。人類研究 從位于Christchurch醫(yī)院,新西蘭的下列患者組，收集非空腹的血液樣品:1)55名正常的健康志愿者。將樣品收集到EDTA血液管中，離心并將血漿儲藏在-80°C直到進行分析。2) 10名具有急性代償失調(diào)性心カ衰竭(CHF)的患者。樣品是在發(fā)病、住院后24_48小時和出院時采集的。3) 23名ST升高的心肌梗死(STEMI)患者。在進入冠心病監(jiān)護室時采集患者樣品(時間0)，之后在00.5、1、2、4、8、12、24和72小時時采集，將樣品采入在冰上的試管中，在+4°C下2700g離心5min，將血漿儲藏在_80°C直到進行分析。4)75名具有末期腎病的患者。在醫(yī)院門診處，將樣品裝入EDTA收集管中，離心制備血漿，儲藏在_80°C。血漿提取如前所述,在SepPak Cartridges (Waters, USA)上提取所有的血衆(zhòng)樣品，9干燥并在RIA和HPLC之前儲藏在_20°C。激素濃度分析根據(jù)標準的生產(chǎn)商的方法，使用釕標記的生物素化抗體，在Elecsys 2010 (Roche,USA)上使用異源免疫測定分析血漿樣品的Tnl、CK-MB、肌紅蛋白和胰島素。如下通過特異性RIA測量EPOsp和CNPsp片段:EPOsp(1-9)和 CNPsp(14-23)RIA為了測量循環(huán)的人EPOsp (1-9)和CNPsp (14-23)肽，我們生成了新的和特異性免疫測定?？贵w生成通過在室溫下溫和攪拌，將含有N-或C-端連接的半胱氨酸的每種抗原性殘基序列，在PBS(pH7.0)中與經(jīng)蘋果酰胺處理的N-e-馬來酰亞胺己酸琥珀酰亞胺酷(EMCS)衍生化的BSA偶聯(lián)。用弗氏佐劑(2ml)乳化經(jīng)偶聯(lián)的肽，按每月I次的時間間隔，在4-5個位點皮下注射(共2ml)到2只綿羊中。在注射12天后，給綿羊放血，評估抗體滴度，直到達到足夠的水平。對于免疫測定，使用最終稀釋范圍在1: 6，000-1: 45，000以內(nèi)的抗血清確定EPOsp和CNPsp免疫反應(yīng)性。每種抗血清與圖6所示的肽和藥物都沒有可檢測到的交叉反應(yīng)性，包括人前BNP (1-13)、前BNP (1-76)、前ANP (1-30)、胰島素、血管緊張素I1、血管緊張素(1-7)、硬骨魚緊張肽I1、CNP、生長素釋放肽、C-生長素釋放肽(52-117)、前CNP (1-15)、腎上腺髓質(zhì)激素、尿皮質(zhì)素 1、尿皮質(zhì)素 I1、BNP-SPn (1-10)、ANP-SPc (16-25)、ANP-SP(1-1O)、INS-SPn(1-9)。按本領(lǐng)域普遍已知的標準方法評估交叉反應(yīng)性。w碘化法和測定方法通過氯胺T方法碘化含有N-或C-端連接的酪氨酸殘基的每種抗原性殘基，并在逆相HPLC(RP-HPLC)上純化。從該制品中，測試在RP-HPLC之后形成的碘化示蹤形式。所有的樣品、標準品、放射性示蹤物和抗血清溶液都在基于鉀的測定緩沖液中稀釋。4’9每種測定孵育物都由100 UL樣品或標準品(恰當?shù)暮铣傻目乖噪男蛄?和100 UL特異性抗原-抗血清組成，經(jīng)過旋渦混合并在4°C下孵育24小吋。然后，加入100 u L示蹤物(4000-5000cpm),并在4°C下再孵育24小時。最后，通過固相第二抗體方法(驢抗綿羊Sac-Cel , IDS Ltd,英格蘭)分離游離的和結(jié)合的免疫反應(yīng)性,并在Gammamaster計數(shù)器(LKB，Uppsala，瑞典)中計數(shù)。

統(tǒng)計學(xué)分析所有的結(jié)果都表示為平均值土SEM。使用雙邊ANOVA重復(fù)測量，隨后為最小顯著性差異post-hoc測試，分析時間-過程數(shù)據(jù)。使用一般的線性回歸模型，進行血漿激素濃度的關(guān)聯(lián)分析。在所有分析中，認為P值<0.05是顯著的。結(jié)果測量的健康人中的EPOsp和CNPsp片段的相應(yīng)靜脈血漿濃度(以pmol/L計)如下:EPOsp 片段 49.9 ± 3.7CNPsp 片段 20.7 ±3.1在健康的人中，血液中的EPOsp和CNPsp的濃度沒有表現(xiàn)出與BMI的顯著關(guān)聯(lián)性。已確定EPOsp和CNPsp片段存在于人血漿中，我們?nèi)缓鬁y量具有書面證明的AMI的患者中的免疫反應(yīng)性EPOsp和CNPsp的系列濃度。在入院數(shù)小時后，觀察到免疫反應(yīng)性EPOsp和CNPsp的最高濃度，并在約8小時中緩慢降低至穩(wěn)定水平。重要的是，平均峰EPOsp和CNPsp片段水平比正常的健康志愿者中的水平高2至3倍(范圍在高2至5倍)。肌紅蛋白的峰值濃度發(fā)生在入院1-2小時后，而峰值TnI和CK-MB水平直到入院后8_12小時時才達到。實施例2對8名具有臨床上穩(wěn)定的疑似ACS患者插入導(dǎo)管，血液樣品來自多個器官位點:這些是股動脈FA(I)和FA(2)股靜脈(FV)、腎靜脈(RV)、肝靜脈(HV)、下腔靜脈(IVC)、頸靜脈(JUG)、心臟冠狀竇靜脈(CS)和肺動脈(PA)。將血液收集到經(jīng)冷凍的EDTA管中，通過離心制備血漿，對血漿進行免疫反應(yīng)性EPOsp和CNPsp RIA0圖2明確顯示了免疫反應(yīng)性CNPsp濃度的最高位點是CS，從心臟，尤其是心室流出的靜脈。這是心臟可以分泌免疫反應(yīng)性CNPsp (例如，CNPsp片段)的證據(jù)。還可以分泌免疫反應(yīng)性EPOsp，特別是以EPOsp片段的形式。實施例3對來自10名具有急性代償失調(diào)性心力衰竭的患者和75名具有慢性腎衰竭的患者的血漿提取物進行特異性EPOsp和EPO免疫測定。上圖:10名慢性腎衰竭患者中的估計的腎小球濾過率(eGFR)。在eGFR和血漿EPOsp之間存在統(tǒng)計學(xué)顯著的負相關(guān)性。中圖:正常的健康個體、慢性腎衰竭患者和代償失調(diào)性急性心カ衰竭患者中的血漿EPOsp濃度。在慢性腎衰竭患者和心カ衰竭患者中的EPOsp的血漿濃度是顯著升高的。下圖:正常的健康、慢性腎衰竭和急性心力衰竭中的EPOsp/EPO的比例。正常的健康中的比例是約6:1，而在慢性腎衰竭中，比例顯著增加(相比正常值)至約10: I。相反，在急性心カ衰竭中，EPOsp/EPO的比例顯著降低(相比正常值)至約3: I。結(jié)論在臨床上穩(wěn)定的患者中，循環(huán)的EPOsp和CNPsp濃度可能源自心臟來源。顯著的心臟分泌與EPOsp和CNPsp是心臟激素是一致的。討論該證據(jù)是首次書面證明在患者表現(xiàn)出ACS的2小時內(nèi)，或在ACS發(fā)作2小時內(nèi)，EPOsp和CNPsp片段存在于循環(huán)和胞外空間中。我們在第一個例子中顯示，血液中的免疫反應(yīng)性EPOsp和CNPsp的測量具有作為急性心肌局部缺血和/或后續(xù)損傷的快速生物標志物的潛力，而在第二個例子中，顯示了在事件后的免疫反應(yīng)性EPOsp和CNPsp的測量具有作為長期預(yù)后和結(jié)果的標志物的潛在優(yōu)點。我們還顯示，免疫反應(yīng)性EPOsp和CNPsp的測量在急性或慢性腎病中具有潛在用途，并且具有作為急性或慢性腎功能/功能失調(diào)的生物標志物發(fā)揮作用的潛力。本領(lǐng)域技術(shù)人員當然可以理解，上述說明是作為實例提供的，本發(fā)明不限于此。引用文獻1.Universal definition of myocardial infarction.Consensus statementfrom the Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Taskforce for the redefinition of myocardialinfarction.Circulation 2007 116:2634-2653.
2.National Academy of Clinical Biochemistry and IFCC Committee forstandardisation of markers of cardiac damage laboratory medicine practiceguidelines !analytical issues for biochemical markers of acute coronarysyndromes.Circulation 2007115:e352-e355.
3.Braunwald E，Zipes DP,Libby P.Acute myocardial infarction Chp.35Heartdisease:a textbook of cardiovascular medicine,6 ed.2001.pgs.1114-1231.
4.Richards AM，Nicholls MG，Yandle TG, Frampton C, Espiner EA, Turner JG,Buttimore RC, Lainchbury JG, Elliott JM, Ikram H，Crozier IG, Smyth DW.PlasmaN—terminal pro-brain natriuretic peptide and adrenomedullin:new neurohormonalpredictors of left ventricular function and prognosis after myocardialinfarction.Circulation 1998 97:1921-1929.
5.Jernberg T，Stridsberg M，Venge P，Lindahl B.N-terminal pro BrainNatriuretic Peptide on admission for early risk stratification of patients withchest pain and no ST-segment elevation.J.Am.Coll.Cardiology 2002 40:437-445.
6.0mland T,Persson A,Ng L，0' Brien R,Karlsson T,Herlitz J,Hartford M，Caidahl K.N-terminal pro—B—type natriuretic peptide and long-term mortality inacute coronary syndromes.Circulation.2002 106:2913-2918.
7.Naghavi M，Libby P，F(xiàn)alk E，Casscells SW,Litorsky S,Rumberger J，BadimonJJ，Stefanadis C,Moreno P,Pasterkamp G,Fayad Z,Stone PH,Waxman S,Raggi P,MadjidM，Zarrabi A，Burke A，Yuan C，F(xiàn)itzgerald PJ, Siscovick DS, de Korte CL，Aikawa M，Airaksinen KE，Assmann G，Becker CR，Chesebro JH，F(xiàn)arb A，Galis ZS，Jackson C，JangIK, Koenig W, Lodder RA，March K，Demirovic J，Navab M，Priori SG，Rekhter MD，BahrR，Grundy SM，Mehran R，Colombo A,Boerwinkle E，Ballantyne C，Insull W Jr,SchwartzRS，Vogel R，Serruys PW，Hansson GK，F(xiàn)axon DP,Kaul S，Drexler H，Greenland P，MullerJE,Virmani R,Ridker PM,Zipes DP,Shah PK,Willerson JT.From vulnerable plaque tovulnerable patient:a call for new definitions and risk assessment strategies:Part II Circulation2003108:1772-1778.
8.Ronco C,Haapio M,House AA,Anavekar N,Bellomo R.Cardiorenal syndrome.J.Am.Coll.Cardiol.200852:1527-1539.
9.Hunt PJ, Richards AM，Nicholls MG，Yandle TG, Doughty RN，EspinerEA.1mmunoreactive amino terminal pro brain natriuretic peptide (NT-proBNP):anew marker of cardiac impairment.Clin.Endocrinol.199747:287-296.
10.The Immunoassay Handbook.3rd edition, ed.David Wild.Elsevier Ltd,2005.
11.Braud VM,Allan DS,Or Callaghan CA,Soderstrom K,Dr Andrea A,Ogg GS,Lazetic S，Young NT，Bell JI，Phillips JH，Lanier LL，McMichael AJ.HLA-E binds tonatural killer cell receptors CD94/NKG2A，B and C.Naturel998391:795-799.
12.Thomas PS.Hybridization of denatured RNA and small DNA fragmentstransferred to nitro cellulose Proc.Natl.Acad.Sc1.USA198077:5201-5205.
13.Huston JS, D Levinson, M Mudgett-Hunter, MS Tai, J Novotny, MNMargolies,RJ Ridge,RE Bruccoleri，E Haber,R Crea.Protein engineering of antibodybinding sites !recovery of specific activity in an ant1-digoxin single-chain Fvanalogue produced in Escherichia coli Proc.Natl.Acad.Sc1.USA198885:5879-5883.
14.Harbour E，Lane D.Antibodies:A Laboratory Manual.1988 Cold SpringHarbour Press New York.
15.Kohler G，Milstein C.Continuous Cultures of Fused Cells SecretingAntibody of Predefined Specficity.Naturel975256:495-497.
16.Verhoeyen M,Milstein C,Winter G.Reshaping human antibodies !graftingan antilysozyme activity.Science 1988 239:1534-1536.
該列表和說明書全文中所有的引用都全文整合到本文中 。
權(quán)利要求
1.分離的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑選自SEQID NO:1或4的結(jié)合劑所組成的組。
2.分離的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑選自SEQID NO:2、3、5和/或6的結(jié)合劑所組成的組。
3.權(quán)利要求1的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑結(jié)合抗原性變體或其片段。
4.權(quán)利要求3的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑結(jié)合抗原性變體或其片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3或4中任一項的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3或4中任一項的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑是多克隆、單克隆、嵌合或人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
7.如權(quán)利要求1至5或6中任一項所要求保護的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑被可檢測的標志物標記。
8.分離的肽，其中肽選自SEQID NO:2、3、5和/或6所組成的組。
9.包括將從患者獲得的含有選自SEQID NO:2、3、5和/或6的肽的生物學(xué)樣品與所述肽的結(jié)合劑接觸的方法，其中樣品是血液樣品、血漿樣品或血清樣品。
10.權(quán)利要求8的多肽在制備抗體中的用途。
11.用于來自對象的生物學(xué)樣品中的權(quán)利要求8的多肽的測定，測定包括獲得所述樣品，使所述樣品與結(jié)合劑接觸，并且使用任何已知的方法檢測和測量樣品中所述肽的水平。
12.權(quán)利要求11的測定，其中生物學(xué)樣品是來自循環(huán)來源的樣品。
13.如權(quán)利要求11或12中任一項所要求保護的測定，其中使用質(zhì)譜法測量所述多肽的水平。
14.如權(quán)利要求11或12中任一項所要求保護的測定，其中使用選自RIA、ELISA、免疫熒光測定和免疫放射測定的測定，測量所述多肽的水平。
15.預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的心臟病癥的方法，所述心臟病癥選自包括AMI和絞痛的急性冠脈綜合癥，心力衰竭、易損斑塊，和包括動脈粥樣硬化的血管疾病所組成的組，所述方法包括: (a)測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、或EPOsp和/或CNPsp、或EPOsp和/或CNPsp片段的水平；和 (b)將所述EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性或所述EPOsp和/或所述CNPsp肽或片段的水平與來自對照的水平進行比較， 其中EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或其EPOsp片段和/或CNPsp片段的測量水平高于對照水平提示了所述心臟病癥。
16.權(quán)利要求15的方 法，其中所述方法用于評價或監(jiān)控對于對象中的急性或慢性心臟病癥的治療的響應(yīng)，其中EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp或其片段的測量水平相對于對照水平的改變提示了對治療的響應(yīng)。
17.用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的急性和/或慢性腎臟疾病、損傷或病癥的方法，所述方法包括: (a)測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或其片段的水平；和 (b)將所述EPOsp和/或CNPsp，或其片段的水平與來自對照的水平進行比較， 其中EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或其片段的測量水平高于對照水平提示了急性或慢性腎臟疾病、損傷或病癥。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述方法用于評價或監(jiān)控對于對象中的急性或慢性腎臟疾病或病癥的治療的響應(yīng)，其中EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或其片段的測量水平相對于對照水平的改變提示了對治療的響應(yīng)。
19.權(quán)利要求15的方法，所述方法包括在所述心臟病癥發(fā)作或臨床表現(xiàn)的前48小時、24小時、12小時、6小時、4小時、2小時、I小時或30分鐘內(nèi)，測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp片段的水平。
20.權(quán)利要求17的方法，所述方法包括在所述腎臟病癥或疾病臨床表現(xiàn)的前48小時、24小時、12小時、6小時、4小時、2小時、I小時或30分鐘內(nèi)，測量來自對象的生物學(xué)樣品中的EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp片段的水平。
21.根據(jù)權(quán)利要求15或19的方法，其中樣品中EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或其片段的水平在40至250pmol/L、65至200pmol/L，70至150或70至130pmol/L的范圍內(nèi)提示ACS。
22.根據(jù)權(quán)利要求15或19的方法，其中樣品中EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或其片段的水平比對照水平高1.5至10、1.5至5、或2至3倍提示ACS。
23.根據(jù)權(quán)利要求15或19的方法，其中急性心臟病癥是在呈現(xiàn)的ECG上具有ST升高的急性心肌梗死(AMI)、不穩(wěn)定的絞痛、急性非ST升高的心肌梗死；心臟局部缺血、急性心臟損傷、由急性藥物毒性導(dǎo)致的急性心臟損害、急性心肌病。
24.如權(quán)利要求15至20中任一項所要求保護的方法，其中生物學(xué)樣品是血液、靜脈血、動脈血、血漿、血清、唾液、組織液、尿液或心臟組織樣品。
25.如權(quán)利要求15至20中任一項所要求保護的方法，其中使用測定來測量所述EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或EPOsp和/或CNPsp片段的水平，所述測定選自質(zhì)譜法(包括SELD1、ES1、MALDI或FTIC)、RIA、ELISA、熒光免疫測定、免疫熒光測定和免疫放射測定。
26.如權(quán)利要求15至20中任一項所要求保護的方法，所述方法還包括測量所述ACS的一種或多種非EPOsp和/或CNPsp標志物的水平，并且將所述水平與來自對照的標志物水平進行比較，其中測量水平與對照水平的差異，連同高于EPOsp和/或CNPsp、或其片段的對照水平的EPOsp和/或CNPsp、或其片段的測量水平預(yù)測或診斷ACS，或者可用于監(jiān)控所述ACS。
27.如權(quán)利要求26中所要求保護的方法，其中非EPOsp和/或CNPsp標志物選自肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白1、肌酸激酶-MB、肌紅蛋白、ANP、ANP-SP、BNP、NT-BNP、BNP-SP、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、H-FABP、局部缺血修飾白蛋白、內(nèi)皮素，、腎上腺髓質(zhì)激素、凝乳酶和血管緊張素II所組成的組。
28.用于EPOsp和/或CNPsp免疫反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp、或EPOsp和/或CNPsp片段的結(jié)合劑用于生產(chǎn)測定的試劑盒的用途，所述測定用于評估對象中的生物學(xué)事件或病癥。
29.權(quán)利要求28的用途，其中生物學(xué)事件或病癥是ACS。
30.權(quán)利要求28的 用途，其中生物學(xué)事件或病癥是腎臟病癥。
31.權(quán)利要求28的用途，其中生物學(xué)事件是由EPO濫用或服用興奮劑導(dǎo)致的。
32.用于預(yù)測、診斷或監(jiān)控急性心臟病癥的試劑盒，所述試劑盒包含針對EPOsp和/或CNPsp或其片段的結(jié)合劑；以及任選地包含說明書，所述說明書用于從ACS發(fā)作或臨床表現(xiàn)的6或4小時內(nèi)獲得的生物學(xué)樣品中測量的EPOsp和/或CNPsp或其片段的水平，在發(fā)作或臨床表現(xiàn)的6或4小時內(nèi)，預(yù)測、診斷或監(jiān)控對象中的所述急性心臟病癥。
33.如權(quán)利要求32中要求保護的試劑盒，其中結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。
34.如權(quán)利要求33中要求保護的試劑盒，其中試劑盒經(jīng)校正以測量在0.1至1500pmol/L、0.1 至 350pmol/L、l 至 300pmol/L、10 至 250、或 20 至 150pmol/L 的范圍內(nèi)的EPOsp和/或CNPsp免疫 反應(yīng)性、EPOsp和/或CNPsp，或其片段的水平。
全文摘要
涉及C型利尿鈉和紅細胞生成素信號肽及片段的診斷學(xué)，及其試劑盒、用途和應(yīng)用。
文檔編號C07K14/00GK103140498SQ201180044836
公開日2013年6月5日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者C·J·彭貝爾彤, A·M·理查茲 申請人:奧塔哥創(chuàng)新有限公司