專利名稱：用于間皮瘤預(yù)后的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在外科手術(shù)后間皮瘤患者預(yù)后的組合物和方法。特別地，本發(fā)明涉及與間皮瘤預(yù)后有關(guān)的微RNA分子，以及與之相關(guān)或來(lái)源于其中的各種核酸分子。
背景技術(shù)：
最近幾年中，微RNA (miRs、miRNA)作為新的重要調(diào)節(jié)RNA類別而出現(xiàn)，其對(duì)各種各樣的生物過(guò)程具有重大影響。這些小的(通常長(zhǎng)18-24個(gè)核苷酸)非編碼RNA分子可通過(guò)促進(jìn)RNA降解，抑制mRNA翻譯，并且還影響基因轉(zhuǎn)錄，來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)模式。miRs在諸如發(fā)育和分化、細(xì)胞增殖控制、應(yīng)激反應(yīng)和代謝等各種過(guò)程中起關(guān)鍵作用。目前有大約1100種已知的人miRs。已發(fā)現(xiàn)許多miRs的表達(dá)在多種人類癌癥類型中發(fā)生改變，在一些病例中，提出了強(qiáng)有力的證據(jù)支持如下推測(cè):這類改變可能在腫瘤進(jìn)程中起致病作用。間皮瘤是發(fā)生在間皮中的腫瘤，間皮覆蓋分別包覆胸腔器官(例如肺和心臟)和腹器(例如消化道和肝)的胸膜、腹膜和心包的表面。在彌漫性胸膜間皮瘤的情況下，胸痛由胸壁胸膜側(cè)的肋間神經(jīng)侵襲引起，而呼吸與循環(huán)障礙可因腫瘤生長(zhǎng)和器官側(cè)的胸膜中的胸膜液蓄積而產(chǎn)生(Takagi, Journal of Clinical and Experimental Medicine, (3 月增刊)，“Respiratory Diseases”，第469-472頁(yè)，1999)。存在最終增殖進(jìn)入鄰近的縱隔器官，發(fā)展成直接侵襲心臟，或者借助膈膜發(fā)展到腹腔，或者由于另外的淋巴或循環(huán)轉(zhuǎn)移而可能在胸腔外發(fā)展。 據(jù)報(bào)道，在美國(guó)每年有3，000人發(fā)生彌漫性胸膜間皮瘤，在1980年代病例數(shù)開(kāi)始顯著增加，并且在60多歲男性中頻繁觀察到，且男性發(fā)病率約是女性發(fā)病率的約5倍。按照最新報(bào)道，在美國(guó)和歐洲，間皮瘤的發(fā)病率呈快速升高的趨勢(shì)，并且根據(jù)1995年英國(guó)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，預(yù)測(cè)間皮瘤的死亡數(shù)在未來(lái)25年中將持續(xù)增加，在最差可能情況下，已指出在1940年代出生男性中具有達(dá)到占所有死亡1%的程度的風(fēng)險(xiǎn)。多種不同的臨床疾病病期分類已被用于間皮瘤，由于所用的用于病期分類的方法不同，因此當(dāng)比較治療結(jié)果時(shí)，先前的對(duì)間皮瘤的治療報(bào)告便遇到困難(Nakano, Respiration,第18卷,第9期,第916-925期，1999)。另外，惡性間皮瘤與暴露于石棉具有病因關(guān)系，這在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)(Tada，Journal of Clinical and Experimental Medicine (3 月增干丨J )，“RespiratoryDiseases”，第406-408頁(yè)，1999)。吸入呼吸道的石棉到達(dá)胸膜正下方的位置，由于通常20年的慢性刺激，腫瘤最終在此發(fā)展，而且該腫瘤在胸膜整個(gè)表面散開(kāi)呈一薄層。因此，雖然惡性間皮瘤被歸類為石棉相關(guān)疾病，但并非所有惡性間皮瘤都由石棉引起，并且只在全部患者的一半左右中觀察到已完整記錄的暴露。惡性胸膜間皮瘤(MPM)對(duì)治療具有抗性，這與預(yù)后極差有關(guān)，需要立即采取對(duì)策(Nakano，Respiration，第18卷，第9期，第916-925頁(yè)，1999)。惡性間皮瘤的預(yù)后受病期影響。當(dāng)作為與細(xì)胞毒性化學(xué)療法和放射療法以及輔助免疫治療(例如干擾素或白介素)的綜合治療(multimodality therapy)的部分進(jìn)行時(shí)，手術(shù)可能是有效的治療，但這只是在早期診斷的罕見(jiàn)情況下。當(dāng)研究胸膜或腹膜中間皮瘤的可能性時(shí)，應(yīng)考慮少數(shù)差異指征。胸膜和腹膜兩者可具有以不同速率伴隨原發(fā)腫瘤(primaries)的繼發(fā)性惡性腫瘤，因此間皮瘤和繼發(fā)性惡性腫瘤或另一種不同來(lái)源的原發(fā)腫瘤間的區(qū)分是重要的。大多重點(diǎn)都放在獨(dú)特腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和表征上。然而，沒(méi)有鑒定出具有足夠靈敏性或特異性而在臨床上有用的標(biāo)志物，雖然已表明多個(gè)標(biāo)志物的組合提高預(yù)后準(zhǔn)確性。對(duì)于與間皮瘤有關(guān)的特異性和精確的標(biāo)志物的需求未得到滿足，包括對(duì)可能具有預(yù)后意義以確定對(duì)生存是必需或適度的治療程度的標(biāo)志物。發(fā)明概述
按照本發(fā)明的一些方面，SEQ ID NO: 1-77或其任何組合的表達(dá)水平的改變表示間皮
瘤預(yù)后。按照本發(fā)明 的一個(gè)方面，提供用于確定受試者的間皮瘤預(yù)后的方法，所述方法包括:
(a)提供來(lái)自受試者的生物樣品；
(b)測(cè)定所述樣品中選自SEQID NO: 1-16、21-77的核酸序列和與之有至少約80%同一'I"生的序列的表達(dá)水平；和
(C)將所述表達(dá)水平與閾值表達(dá)水平進(jìn)行比較，
其中與所述閾值表達(dá)水平相比，SEQ ID NO: 1-16、21-77的任一個(gè)和與之有至少約80%同一性的序列的水平表示所述受試者的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，核酸序列選自SEQ ID NO: 1-4、11-12、21、22、27_35、45_47、52-59,70-72和與之有至少約80%同一性的序列，且與閾值表達(dá)水平相比，所述核酸序列中任一個(gè)表達(dá)水平的提高都表示所述受試者的預(yù)后良好。在其它實(shí)施方案中，核酸序列選自SEQ ID NO: 5-10、13-16、23-26、36-44、48-51、60-69、73-77 和與之有至少約 80% 同一性的序列，且與閾值表達(dá)水平相比，所述核酸序列中任一個(gè)表達(dá)水平的提高都表示所述受試者的預(yù)后差。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在某些實(shí)施方案中，所述方法用來(lái)確定受試者的療程。在某些實(shí)施方案中，獲自受試者的生物樣品選自體液、細(xì)胞系或組織樣品。在某些實(shí)施方案中，組織是新鮮、冷凍、固定、蠟包埋或福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)組織。在某些實(shí)施方案中，組織是間皮。按照一些實(shí)施方案，表達(dá)水平通過(guò)選自核酸雜交、核酸擴(kuò)增或其組合的方法測(cè)定。按照一些實(shí)施方案，核酸雜交使用固相核酸生物芯片陣列或原位雜交進(jìn)行。按照其它實(shí)施方案，核酸擴(kuò)增方法是實(shí)時(shí)PCR。按照一些實(shí)施方案，PCR方法包括正向引物和反向引物。按照一些實(shí)施方案，正向引物與SEQ ID NO: 1-16、21-77、其片段或與之有至少約80%同一性的序列部分互補(bǔ)。按照一些實(shí)施方案，正向引物包含選自SEQ ID NO: 78-100的序列和與之有至少約80%同一性的序列。按照一些實(shí)施方案，反向引物包含SEQ ID NO: 124和與之有至少約80%同一性的序列。按照一些實(shí)施方案，實(shí)時(shí)PCR方法還包括探針。按照一些實(shí)施方案，探針與SEQ IDNO: 1-16、21-77、其片段或與之有至少約80%同一性的序列互補(bǔ)。按照一些實(shí)施方案，探針包含選自SEQ ID NO: 101-123的序列和與之有至少約80%同一性的序列。本發(fā)明還提供間皮瘤預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含正向引物和反向引物和探針。按照一些實(shí)施方案，正向引物與SEQ ID NO: 1-16、21-77、其片段或與之有至少約80%同一性的序列部分互補(bǔ)。按照一些實(shí)施方案，正向引物包含選自SEQ ID NO: 78-100的序列和與之有至少約80%同一性的序列。按照一些實(shí)施方案，反向引物包含SEQ ID NO: 124和與之有至少約80%同一性的序列。按照一些實(shí)施方案，探針包含與選自SEQ ID NO: 1-16,21-77的序列、其片段或與之有至少約80%同一性的序列互補(bǔ)的核酸序列。按照一些實(shí)施方案，探針包含選自SEQ ID NO: 101-123的序列和與之有至少約80%同一性的序列。按照一些實(shí)施方案，試劑盒包含用于進(jìn)行原位雜交分析的試劑。按照一些實(shí)施方案，試劑盒包含用于進(jìn)行固相核酸生物芯片陣列的試劑。附圖簡(jiǎn)述


圖1A-1D是外科手術(shù)后間皮瘤患者的K aplan Meier圖,根據(jù)預(yù)后良好與預(yù)后差的患者中差異表達(dá)的miRs的表達(dá)水平(單位:log2 (表達(dá)))分組。y軸表示生存患者分?jǐn)?shù)，x軸表示生存月數(shù)。圖1A表示hsa-miR-130b (SEQ ID NO: 9)的表達(dá)。18名患者的表達(dá)為9.56單位或更小(實(shí)曲線)，其中位生存時(shí)間為12個(gè)月，19名患者的表達(dá)為9.65或更大(虛曲線)，其中位生存時(shí)間為4個(gè)月。log-rank的p值=0.0009
圖1B表示hsa-miR-29c* (SEQ ID NO: 19)的表達(dá)。18名患者的表達(dá)小于8.15單位(實(shí)曲線)，其中位生存時(shí)間為4個(gè)月，19名患者的表達(dá)超過(guò)8.15 (虛曲線)，其中位生存時(shí)間為14個(gè)月。log-rank的p值=0.0027
圖1C表示hsa-miR-224 (SEQ ID NO: 25)的表達(dá)。18名患者的表達(dá)為8.71單位或更小(實(shí)曲線)，其中位生存時(shí)間為10個(gè)月，19名患者的表達(dá)為8.74或更大(虛曲線)，其中位生存時(shí)間為4個(gè)月。log-rank的p值=0.0015
圖1D表示hsa-miR-34a (SEQ ID NO: 27)的表達(dá)。18名患者的表達(dá)為11.63單位或更小(實(shí)曲線)，其中位生存時(shí)間為4個(gè)月，19名患者的表達(dá)為11.65或更大(虛曲線)，其中位生存時(shí)間為13個(gè)月。log-rank的p值=0.0148
圖2.利用對(duì)MPM患者的miR-29c* (SEQ ID NO: 19)表達(dá)數(shù)據(jù)100，000次隨機(jī)重新分布中每一個(gè)的鑒別指數(shù)，計(jì)算的P值的分布。y軸表示頻率，X軸表示鑒別指數(shù)評(píng)分C。垂直實(shí)線表示對(duì)應(yīng)于miR-29c* (SEQ ID NO: 19)的計(jì)算的鑒別指數(shù)評(píng)分C (0.726)。發(fā)明詳述
本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即miRNA表達(dá)可用作用于確定間皮瘤預(yù)后的新工具。按照本發(fā)明的一些方面，特定的核酸序列(SEQ ID NO: 1_77和與之有至少約80%同一性的序列)可用于確定間皮瘤的預(yù)后。
在公開(kāi)和描述本發(fā)明的組合物和方法之前，要理解本文所用術(shù)語(yǔ)只用于描述具體實(shí)施方案的目的，并無(wú)意限制。必須注意，本說(shuō)明書(shū)和隨附權(quán)利要求書(shū)所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文另有明確說(shuō)明。對(duì)于本文敘述的數(shù)字范圍，明確包括每一個(gè)介于其間的具有相同精確度的數(shù)字。例如對(duì)于6-9的范圍，除6和9以外還包括數(shù)字7和8，對(duì)于6.0-7.0的范圍，還明確包括數(shù)字 6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 和 7.0。1.定義 約
本文所用術(shù)語(yǔ)“約”是指+/-10%。表達(dá)改變
本文所用術(shù)語(yǔ)“表達(dá)改變”包括過(guò)量表達(dá)、表達(dá)不足和異位表達(dá)。按照一些實(shí)施方案，表達(dá)水平改變是基于核酸序列或其任何組合的表達(dá)水平的組合的評(píng)分改變。改善
本文所用改善是指減小病況或疾病的至少一個(gè)指示物的嚴(yán)重程度。在某些實(shí)施方案中，改善包括延遲或減慢病況或疾病的一個(gè)或多個(gè)指示物的發(fā)展。指示物的嚴(yán)重程度可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的主觀或客觀度量確定。反義
本文所用術(shù)語(yǔ)“反義”是指與特定DNA或RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“反義鏈”用來(lái)指與“有義”鏈互補(bǔ)的核酸鏈。反義分子可通過(guò)任何方法產(chǎn)生，包括以反向?qū)⒛康幕蚺c允許互補(bǔ)鏈合成的病毒啟動(dòng)子連接的合成。一旦引入細(xì)胞，則該轉(zhuǎn)錄鏈與由細(xì)胞產(chǎn)生的天然序列組合形成雙鏈體。這些雙鏈體然后阻斷進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄或翻譯。用這種方式可產(chǎn)生突變型表型。連接的
本文所用“連接的”或“固定化的”是指探針和固相支持體，并可意指探針和固相支持體之間的結(jié)合在結(jié)合、洗滌、分析和除去條件下足夠穩(wěn)定。結(jié)合可以是共價(jià)或非共價(jià)的。共價(jià)鍵可在探針和固相支持體之間直接形成，或可通過(guò)交聯(lián)劑或通過(guò)在固相支持體或探針或兩者上包括特定反應(yīng)基團(tuán)來(lái)形成。非共價(jià)結(jié)合可以是靜電、親水和疏水相互作用的一種或兩種。非共價(jià)結(jié)合所包括的是分子(例如鏈霉抗生物素)與支持體的共價(jià)連接和生物素化探針與鏈霉抗生物素的非共價(jià)結(jié)合。固定還可包括共價(jià)和非共價(jià)相互作用的組合。生物樣品
本文所用“生物樣品”意指包含核酸的生物組織或液體(fluid)的樣品。這類樣品包括但不限于自受試者中分離的組織或液體。生物樣品還可包括組織(例如活檢樣品和尸檢樣品、FFPE樣品)切片，采集用于組織學(xué)目的的冷凍切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、淚液、粘液、毛發(fā)和皮膚。生物樣品還包括外植塊和來(lái)源于動(dòng)物或患者組織的原代和/或轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物。生物樣品還可為血液、血液級(jí)分、尿液、滲出物、腹水、唾液、腦脊液、宮頸分泌物、陰道分泌物、子宮內(nèi)膜分泌物、胃腸分泌物、支氣管分泌物、痰、細(xì)胞系、組織樣品、細(xì)針抽吸術(shù)(FNA)的細(xì)胞內(nèi)容物或乳房分泌物。還可通過(guò)從動(dòng)物中移出細(xì)胞樣 品來(lái)提供生物樣品，但也可通過(guò)使用之前分離的細(xì)胞(例如由其它人、在其它時(shí)間和/或出于其它目的分離的細(xì)胞)，或通過(guò)體內(nèi)進(jìn)行本文所述方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。還可以使用歸檔組織(archival tissues),例如具有治療或結(jié)果記載的組織。生物樣品還可以保存于RNA7ater 用于后期分析。癌癥
術(shù)語(yǔ)“癌癥”意在包括所有類型的癌性生長(zhǎng)或致癌過(guò)程、轉(zhuǎn)移組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，不論組織病理類型或侵襲階段。癌癥的實(shí)例包括但不限于實(shí)體瘤和白血病，包括:成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胺前體攝取脫羧細(xì)胞瘤(apudoma)、迷芽瘤、鰓原瘤、惡性類癌綜合征、類癌性心臟病、癌(例如Walker癌、基細(xì)胞癌、基底鱗狀癌、Brown-Pearce癌、導(dǎo)管癌、Ehrlich瘤、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(例如肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和肺未分化的大細(xì)胞癌)、燕麥細(xì)胞癌、乳頭狀癌、細(xì)支氣管癌、支氣管癌、鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞癌)、組織細(xì)胞病癥、白血病(例如B細(xì)胞白血病、混合細(xì)胞白血病、裸細(xì)胞白血病、T細(xì)胞白血病、T細(xì)胞慢性白血病、HTLV-1I相關(guān)白血病、淋巴細(xì)胞急性白血病、淋巴細(xì)胞慢性白血病、肥大細(xì)胞白血病和髓細(xì)胞性白血病)、惡性組織細(xì)胞增多病、霍奇金病、免疫增生性小(immunoproliferative small)、非霍奇金淋巴瘤、衆(zhòng)細(xì)胞瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖、黑素瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨細(xì)胞腫瘤、組織細(xì)胞瘤、脂肪瘤、月旨肉瘤、間皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纖維瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、顱咽管瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、間充質(zhì)瘤、中腎瘤、肌肉瘤、成釉細(xì)胞瘤、牙骨質(zhì)瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、間皮瘤、滋養(yǎng)葉瘤(trophoblastic tumor)、腺癌、腺瘤、膽管瘤、膽脂瘤、圓柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒層細(xì)胞瘤、兩性胚細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞瘤、汗腺腺瘤、胰島細(xì)胞瘤、睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤、乳頭狀瘤、睪丸支持細(xì)胞瘤、卵泡膜細(xì)胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌細(xì)胞瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、非嗜鉻性副神經(jīng)節(jié)瘤、血管角質(zhì)瘤、血管淋巴樣增生伴嗜酸細(xì)胞增多、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤(Iymphangiomyoma)、淋巴管肉瘤、松果體瘤、癌肉瘤、軟骨肉瘤、葉狀囊肉瘤(cystosarcoma, phyllodes)、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤(Ieimyosarcoma)、白血病性肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤(例如尤因肉瘤、實(shí)驗(yàn)性肉瘤、卡波西肉瘤和肥大細(xì)胞肉瘤)、神經(jīng)纖維瘤病和宮頸發(fā)育異常以及其中細(xì)胞變得永生化或轉(zhuǎn)化的其它情 況。癌癥預(yù)后
一種對(duì)癌癥可能進(jìn)程或結(jié)果及對(duì)其治療的反應(yīng)的預(yù)見(jiàn)或預(yù)測(cè)。本文所用癌癥預(yù)后包括辨別癌癥病期和亞型，并且預(yù)見(jiàn)或預(yù)測(cè)以下的任一種或多種:易患癌癥或診斷為癌癥的患者的生存期限、無(wú)復(fù)發(fā)生存期限、易患癌癥或診斷為癌癥的患者的無(wú)進(jìn)展生存期限、易患癌癥或診斷為癌癥的患者組群中的反應(yīng)速率、易患癌癥或診斷為癌癥的患者或患者組群中的反應(yīng)期限和/或易患癌癥或診斷為癌癥的患者中轉(zhuǎn)移的可能性。本文所用“癌癥的預(yù)后”意指提供癌癥的可能進(jìn)程或結(jié)果的預(yù)見(jiàn)或預(yù)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，“癌癥的預(yù)后”包含提供以下任一種或多種的預(yù)見(jiàn)或預(yù)測(cè)(預(yù)后):易患癌癥或診斷為癌癥的患者的生存期限、無(wú)復(fù)發(fā)生存期限、易患癌癥或診斷為癌癥的患者的無(wú)進(jìn)展生存期限、易患癌癥或診斷為癌癥的患者組群中的反應(yīng)速率、易患癌癥或診斷為癌癥的患者或患者組群中的反應(yīng)期限和/或易患癌癥或診斷為癌癥的患者中轉(zhuǎn)移的可能性。化療劑一種用來(lái)治療疾病，尤其是治療癌癥的藥物。對(duì)于癌癥，所述藥物通常快速靶向分裂細(xì)胞，例如癌細(xì)胞?；焺┑姆窍拗菩詫?shí)例包括順鉬、卡鉬、喜樹(shù)堿、多柔比星、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、放線菌素D和cloposide。分類
本文所用“分類”是指其中根據(jù)項(xiàng)目(稱為性狀、變量、性質(zhì)、特征等)中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)在特性的定量信息并根據(jù)統(tǒng)計(jì)模型和/或在先標(biāo)記項(xiàng)目的訓(xùn)練集，將各個(gè)項(xiàng)目分到各組或各類的程序和/或算法。按照一個(gè)實(shí)施方案，分類意指確定癌癥類型?；パa(bǔ)
本文所用“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)的”意指核苷酸或核苷酸類似物間的沃森-克里克(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對(duì)。完全互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物間的100%互補(bǔ)堿基配對(duì)。在一些實(shí)施方案中，互補(bǔ)序列具有相反方向(5’-3’)。Cox 回歸
本文所用“Cox回歸”是用來(lái)確定生存和若干獨(dú)立研究變量之間的關(guān)系的統(tǒng)計(jì)技術(shù)。這種生存分析可用于根據(jù)給定協(xié)變量的值，對(duì)時(shí)間與特定事件建模。在調(diào)整研究變量后，Cox回歸提供治療對(duì)生存率的估計(jì)值。在Cox回歸中，估算研究變量的系數(shù)。Cox回歸的基礎(chǔ)模型產(chǎn)生比例風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)(proportional hazard function),其可通過(guò)設(shè)定層變量(stratavariable)或時(shí)間相關(guān)協(xié)變量而展開(kāi)。Ct Ct信號(hào)表示第一個(gè)PCR循環(huán)，其中擴(kuò)增穿過(guò)熒光閾值(循環(huán)閾值)。因此，低的Ct值表示高的微RNA豐度或表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，使PCR Ct信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，使得標(biāo)準(zhǔn)化Ct保持為表達(dá)水平的倒數(shù)。在其它實(shí)施方案中，可將PCR Ct信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，然后成倒數(shù)，使得低的標(biāo)準(zhǔn)化倒數(shù)Ct表示低的微RNA豐度或表達(dá)水平。檢測(cè)
“檢測(cè)”意指檢測(cè)樣品中組分的存在情況。檢測(cè)還意指檢測(cè)組分的不存在情況。檢測(cè)還意指定量或定性測(cè)量組分的水平。差異表達(dá)
“差異表達(dá)”意指細(xì)胞和組織內(nèi)及細(xì)胞和組織間時(shí)序基因和/或細(xì)胞基因表達(dá)模式的定性或定量差異。因此，差異性表達(dá)的基因可在性質(zhì)上改變其表達(dá)，包括例如正常組織與疾病組織中的活化或失活。可使基因在特定狀態(tài)下相對(duì)于另一狀態(tài)打開(kāi)或關(guān)閉，因此允許比較兩個(gè)或更多個(gè)狀態(tài)。定性調(diào)節(jié)的基因可在某一狀態(tài)或細(xì)胞類型中顯示可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)的表達(dá)模式。一些基因可在一種狀態(tài)或細(xì)胞類型中表達(dá)，但不能在兩種狀態(tài)或細(xì)胞類型中表達(dá)。或者，表達(dá)的差異可以是定量的，例如其中表達(dá)受到調(diào)節(jié)，或增量調(diào)節(jié)(導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物的量增加)，或減量調(diào)節(jié)(導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物的量降低)。表達(dá)的差異程度只需大到足以通過(guò)諸如表達(dá)陣列、定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、RNA印跡分析(northern analysis)、實(shí)時(shí)PCR、原位雜交和RNA酶保護(hù)等標(biāo)準(zhǔn)表征技術(shù)進(jìn)行量化即可。鑒別指數(shù)
本文所用“鑒別指數(shù)”是用于生存分析的統(tǒng)計(jì)工具，可供連續(xù)獨(dú)立協(xié)變量之用。對(duì)于具體的獨(dú)立變量X，鑒別指數(shù)評(píng)分C是范圍為0-1的評(píng)分，測(cè)量X值和生存時(shí)間之間的一致性。C越接近1，越預(yù)示著X值越高，生存時(shí)間越長(zhǎng)。相反，C接近O意指X值越低預(yù)示著生存時(shí)間越長(zhǎng)，CT=0.5意指X與生存時(shí)間無(wú)關(guān)。劑量
本文所用“劑量”意指按單次給藥提供的藥劑的規(guī)定量。在某些實(shí)施方案中，劑量可以兩次或更多次大丸劑(boluses)、片劑或注射劑給予。例如，在某些實(shí)施方案中，在需要皮下給藥的情況下，所需劑量要求不易通過(guò)單次注射而容納的體積。在這類實(shí)施方案中，可采用兩次或更多次注射以達(dá)到所需劑量。在某些實(shí)施方案中，劑量可用兩次或更多次注射給予以使個(gè)體中的注射部位反應(yīng)降到最低。劑量單位
本文所用“劑量單位”意指其中提供藥劑的形式。在某些實(shí)施方案中，劑量單位是裝有凍干寡核苷酸的小瓶。在某些實(shí)施方案中，劑量單位是裝有重構(gòu)寡核苷酸的小瓶。表達(dá)譜
本文所用“表達(dá)譜(expression profile) ”可意指基因組表達(dá)譜,例如微RNA的表達(dá)譜。譜可通過(guò)用于測(cè)定核酸序列水平的任何合適方法例如微RNA、標(biāo)記的微RNA、擴(kuò)增的微RNA、cRNA等的定量雜交、定量PCR、用于定量的ELISA等來(lái)產(chǎn)生，并且可供分析兩個(gè)樣品間的差異基因表達(dá)。對(duì)受試者或患者腫瘤樣品(例如其細(xì)胞或收集物(例如組織))進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適方法收集樣品。目的核酸序列是發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測(cè)性的核酸序列，包括上文提供的核酸序列，其中表達(dá)譜可包括5、10、20、25、50、100個(gè)或更多個(gè)(包括所有)所列核酸序列的表達(dá)數(shù)據(jù)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)譜”還可意指在所測(cè)樣品中測(cè)量核酸序列的豐度。表達(dá)比
本文所用“表達(dá)比”是指通過(guò)檢測(cè)生物樣品中相應(yīng)核酸的相對(duì)表達(dá)水平而確定的兩種或更多種核酸的相對(duì)表達(dá)水平。FDR
當(dāng)進(jìn)行多重統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)時(shí)，例如在比較多個(gè)數(shù)據(jù)特征的兩組間的信號(hào)時(shí)，由于可達(dá)到在另外情況下可視為統(tǒng)計(jì)顯著性的水平的組間隨機(jī)差，獲得假陽(yáng)性結(jié)果的概率越來(lái)越高。為了限制這類錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)的比例，統(tǒng)計(jì)顯著性定義為僅用于其中差異達(dá)到閾值以下P值(雙側(cè)t檢驗(yàn))的數(shù)據(jù)特征，其有賴于所進(jìn)行的檢驗(yàn)數(shù)目和這些檢驗(yàn)中所獲得的P值的分布。片段
“片段”在本文中用來(lái)表示核酸或多肽的非全長(zhǎng)部分。因此，片段本身也分別是核酸或多肽?；?br> 本文所用“基因”可以是天然基因(例如基因組)或合成基因，其包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(例如內(nèi)含子、5’和3’非翻譯序列)?；虻木幋a區(qū)可以是編碼氨基酸序列或功能性RNA例如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA或反義RNA的核苷酸序列?；蜻€可以是相當(dāng)于編碼區(qū)(例如外顯子和miRNA)的mRNA或cDNA，任選包含與之連接的5’ 或3’非翻譯序列?；蜻€可以是包含全部或部分編碼區(qū)和/或與之連接的5’或3’非翻譯序列的體外產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸分子。溝結(jié)合物/小溝結(jié)合物(MGB)“溝結(jié)合物”和/或“小溝結(jié)合物”可互換使用，是指通常以序列特異性方式適應(yīng)雙鏈DNA的小溝的小分子。小溝結(jié)合物可以是長(zhǎng)的扁平分子，可呈新月形，因此緊貼地適應(yīng)雙螺旋的小溝中，常常置換水。小溝結(jié)合分子通?？砂瑤讉€(gè)通過(guò)具有扭轉(zhuǎn)自由度的鍵連接的芳族環(huán)例如呋喃、苯或吡咯環(huán)。小溝結(jié)合物可以是抗生素，例如紡錘菌素、偏端霉素、berenil、噴他脒和其它芳族二脒、Hoechst 33258、SN 6999、金霉酸抗腫瘤藥物例如色霉素和光神霉素、CC-1065、二氫環(huán)卩比咯并卩引哚(dihydrocyclopyrroloindole)三肽(DPI3)、1，2- 二氫-(3H)-吡咯并[3，2-e]吲哚_7_羧化物(carboxylate) (CDPI3)和相關(guān)化合物和類似物，包括 Nucleic Acids in Chemistry and Biology,第 2 版，Blackburn 和 Gait主編，Oxford University Press，1996和PCT公布申請(qǐng)?zhí)朩O 03/078450中描述的那些，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。小溝結(jié)合物可以是引物、探針、雜交標(biāo)簽互補(bǔ)序列的組分或其組合。小溝結(jié)合物可提高它們與之連接的引物或探針的Tm,允許這類引物或探針在較高溫度下有效地雜交。風(fēng)險(xiǎn)
本文所用風(fēng)險(xiǎn)(hazard)用于生存分析理論，其中風(fēng)險(xiǎn)是在時(shí)間t時(shí)發(fā)生的目標(biāo)事件每時(shí)間單位的概率，前提是它在時(shí)間t前未發(fā)生。宿主細(xì)胞
本文所用“宿主細(xì)胞”可以是可含有載體和可支持載體復(fù)制的天然存在的細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。同一性
本文在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列的情況下所用“同一性的”或“同一性”意指在特定區(qū)域內(nèi)具有特定百分比的相同殘基的序列。百分比可如下計(jì)算，對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最佳比對(duì)，比較特定區(qū)域內(nèi)的兩個(gè)序列，確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同殘基的位置數(shù)以得到匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除 以該特定區(qū)域中的位置總數(shù)，將結(jié)果乘以100，得到序列同一性的百分比。在其中兩個(gè)序列具有不同長(zhǎng)度或比對(duì)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)交錯(cuò)末端以及比較的特定區(qū)域只包括單個(gè)序列的情況下，單一序列的殘基包括在分母中，但不包括在分子中。當(dāng)比較DNA和RNA時(shí)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可視為等同物。同一性可手工進(jìn)行或通過(guò)應(yīng)用計(jì)算機(jī)序列算法例如BLAST或BLAST 2.0進(jìn)行。原位檢測(cè)
本文所用“原位檢測(cè)”意指在原始位置處因此意指在組織樣品(例如活組織檢查)中檢測(cè)表達(dá)或表達(dá)水平。抑制
本文所用“抑制”可指預(yù)防、阻止、阻抑、減少或消除。Kaplan-Meier
本文所用Kaplan-Meier方法由生存時(shí)間數(shù)據(jù)估算生存函數(shù)。生存函數(shù)的Kaplan-Meier估算圖是一系列的下降量值的水平階梯(horizonal steps),當(dāng)取足夠大的樣品時(shí)，其接近該群體的真實(shí)生存函數(shù)。連續(xù)的不同取樣觀察間的生存函數(shù)值被假定是常數(shù)。Kaplan-Meier曲線的優(yōu)勢(shì)是該方法可考慮一些類型的刪失數(shù)據(jù)，特別是如果患者從研究中退出時(shí)發(fā)生的刪失，即在觀察到最終結(jié)果前從樣品中失去。圖中，小的垂直記號(hào)線表示損失，其中患者生存時(shí)間已右刪失。
標(biāo)記
本文所用“標(biāo)記”意指通過(guò)分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理手段可檢測(cè)的組合物(composition)。例如有用的標(biāo)記包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如常用于ELISA的酶)、生物素、洋地黃毒苷(digoxigenin)或半抗原和可使其可檢測(cè)的其它實(shí)體?？蓪?biāo)記在任何位置處摻入核酸和蛋白質(zhì)中。邏輯斯謫回歸
邏輯斯謫回歸是稱為廣義線性模型的統(tǒng)計(jì)模型類別的部分。邏輯斯謫回歸允許從一組可以是連續(xù)的、離散的、二分的或任何這些的混合的變量預(yù)測(cè)離散結(jié)果，例如組成員。獨(dú)立變量或反應(yīng)變量是二分的，例如兩種可能的癌癥類型之一。邏輯斯謫回歸將優(yōu)勢(shì)比(oddsratio)(即屬于第一組的概率Ψ)相對(duì)于屬于第二組的概率(2 -P)的比率)的自然對(duì)數(shù)模型化，作為不同表達(dá)水平(以log-space表示)和其它解釋變量的線性組合。邏輯斯謫回歸輸出可通過(guò)規(guī)定如果/7大于0.5或50%，則病例或樣品可歸類為第一類型而用作分類器?；蛘?，計(jì)算的概率Z7在其它情況下(例如ID或2D閾值分類器)可用作變量。轉(zhuǎn)移
本文所用“轉(zhuǎn)移”意指癌從其最初作為原發(fā)腫瘤出現(xiàn)的位置擴(kuò)散到身體其它部位的過(guò)程。原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)程反映多個(gè)階段，包括從相鄰的原發(fā)腫瘤細(xì)胞分離，在循環(huán)中存活，并在繼發(fā)部位上生長(zhǎng)。錯(cuò)配
“錯(cuò)配”意指第一核酸的核堿基不能夠與第二核酸相應(yīng)位置的核堿基配對(duì)。調(diào)節(jié)
本文所用“調(diào)節(jié)”意指干擾 功能或活性。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)意指基因表達(dá)增加。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)意指基因表達(dá)降低。核酸
本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指至少兩個(gè)核苷酸共價(jià)連接在一起。單鏈的描述亦限定了互補(bǔ)鏈的序列。因此，核酸還包括所描述單鏈的互補(bǔ)鏈。核酸的許多變體可用于與給定核酸相同的目的。因此，核酸還包括基本相同的核酸及其互補(bǔ)序列。單鏈提供可在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴(yán)格雜交條件下雜交的探針。核酸可為單鏈或雙鏈，或可含有雙鏈和單鏈序列兩者的部分。核酸可以是DNA (基因組和cDNA兩者)、RNA或雜合體，其中核酸可含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合及包括以下堿基的組合:尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥(niǎo)嘌呤。核酸可通過(guò)化學(xué)合成方法或通過(guò)重組方法獲得。核酸一般含有磷酸二酯鍵，但可包括可具有至少一個(gè)不同鍵的核酸類似物，例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯(methylphosphoroamidite)鍵和肽核酸骨架和鍵。其它類似的核酸包括具有正性骨架、非離子骨架和非核糖骨架的核酸，包括美國(guó)專利號(hào)5，235，033和5，034，506中描述的核酸，所述專利通過(guò)引用結(jié)合。含有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的或修飾核苷酸的核酸也包括在核酸的一種定義中。修飾核苷酸類似物可位于例如核酸分子的5’端和/或3’端。核苷酸類似物的代表性實(shí)例可選自糖或骨架修飾的核糖核苷酸。然而，應(yīng)當(dāng)注意，核堿基修飾的核糖核苷酸，即含有非天然存在的核堿基而不是天然存在的核堿基的核糖核苷酸也是適宜的，所述非天然存在的核堿基例如在5位修飾的尿苷或胞苷,例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位修飾的腺苷和鳥(niǎo)苷，例如8-溴鳥(niǎo)苷；脫氮核苷酸，例如7-脫氮-腺苷；0_和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。2’-OH基團(tuán)可被選自以下的基團(tuán)置換汨、01 、1 、鹵素、5!1、51 、順2、順1 、殿2或01其中R為C1-C6燒基、烯基或炔基，鹵素為F、Cl、Br或I。修飾核苷酸還包括通過(guò)例如以下文獻(xiàn)中描述的輕脯氨醇鍵(hydroxyprolinol linkage)與膽固醇綴合的核苷酸:Krutzfeldt等，Nature 438:685-689 (2005)和 Soutschek 等，Nature 432:173-178 (2004)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。可出于多種原因?qū)颂?磷酸骨架進(jìn)行修飾，例如提高這類分子在生理環(huán)境的穩(wěn)定性和半衰期、促進(jìn)跨細(xì)胞膜的擴(kuò)散或作為生物芯片上的探針。骨架修飾還可提高對(duì)降解的抗性，例如在細(xì) 胞的嚴(yán)酷胞吞環(huán)境中。骨架修飾還可降低經(jīng)由例如肝中的肝細(xì)胞的核酸清除?？芍苽涮烊淮嬖诘暮怂岷皖愃莆锏幕旌衔?；或者，可制備不同核酸類似物的混合物和天然存在的核酸和類似物的混合物。總體生存時(shí)間
本文所用“總體生存時(shí)間”或“生存時(shí)間”意指受試者在疾病診斷或疾病治療后生存的時(shí)間期限。在某些實(shí)施方案中，疾病為癌癥。部分互補(bǔ)
本文所用“部分互補(bǔ)”是指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的互補(bǔ)堿基配對(duì)小于100%。在一些實(shí)施方案中，堿基配對(duì)只跨越部分互補(bǔ)核酸分子的特定部分。藥劑
本文所用藥劑意指當(dāng)給予受試者時(shí)提供治療作用的物質(zhì)?！八幬锝M合物”意指適于給予個(gè)體的物質(zhì)的混合物，其包括藥劑。例如藥物組合物可包含修飾的寡核苷酸和無(wú)菌水溶液?！盎钚运幬锍煞帧币庵柑峁┧枳饔玫乃幬锝M合物中的物質(zhì)。預(yù)防
本文所用預(yù)防意指延遲或預(yù)先阻止病況或疾病的發(fā)作或發(fā)展或進(jìn)展達(dá)一段時(shí)間，包括數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。無(wú)進(jìn)展生存期
“無(wú)進(jìn)展生存期”意指患有疾病病況但在給定時(shí)間內(nèi)生存而疾病并未惡化的受試者的分?jǐn)?shù)。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)給疾病分期或評(píng)分來(lái)評(píng)價(jià)無(wú)進(jìn)展生存期。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)評(píng)價(jià)腫瘤大小、腫瘤數(shù)和/或轉(zhuǎn)移，來(lái)評(píng)價(jià)患有癌癥的受試者的無(wú)進(jìn)展生存期。探針
本文所用“探針”意指能夠通過(guò)一種或多種化學(xué)鍵類型、通常通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)、通常通過(guò)氫鍵形成而與互補(bǔ)序列的靶核酸結(jié)合的寡核苷酸。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)格性，探針可結(jié)合與探針序列缺乏完全互補(bǔ)性的靶序列。可能存在任何數(shù)目的堿基對(duì)錯(cuò)配，所述錯(cuò)配將干擾本文所述靶序列和單鏈核酸間的雜交。然而，如果突變數(shù)如此大以致于甚至在最小嚴(yán)格雜交條件下都不能發(fā)生雜交，則該序列不是互補(bǔ)靶序列。探針可為單鏈的或部分單鏈的和部分雙鏈的。探針的鏈性(strandedness)受靶序列的結(jié)構(gòu)、組成和性質(zhì)支配。探針可被直接標(biāo)記或間接標(biāo)記，例如用生物素標(biāo)記，鏈霉抗生物素復(fù)合物可隨后與之鍵合。啟動(dòng)子
本文所用“啟動(dòng)子”意指能夠賦予、激活或提高細(xì)胞中核酸表達(dá)的合成或天然衍生的分子。啟動(dòng)子可包含進(jìn)一步提高所述分子表達(dá)和/或改變所述分子的空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。啟動(dòng)子還可包含遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制子元件，其可位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多達(dá)幾千個(gè)堿基對(duì)的位置。啟動(dòng)子可來(lái)源于以下來(lái)源，包括病毒、細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(chóng)和動(dòng)物。啟動(dòng)子可組成型或相對(duì)于其中發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞、組織或器官，或相對(duì)于發(fā)生表達(dá)的發(fā)育階段，或因響應(yīng)外部刺激(例如生理應(yīng)激、病原體、金屬離子或誘導(dǎo)齊IJ)而差異性調(diào)節(jié)基因組分的表達(dá)。啟動(dòng)子的代表性實(shí)例包括噬菌體T7啟動(dòng)子、噬菌體T3啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子、Iac操縱基因-啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、RSV-LTR啟動(dòng)子、CMV IE啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子或SV40晚期啟動(dòng)子和CMV IE啟動(dòng)子。q 值
各個(gè)假設(shè)檢驗(yàn)的q值是該檢驗(yàn)可稱為顯著的最小FDR。q值是當(dāng)對(duì)于巢式顯著性區(qū)域(nested significance regions)組,用給定值拒絕統(tǒng)計(jì)數(shù)值時(shí)出現(xiàn)的最小的陽(yáng)性FDR。參比表達(dá)譜
本文所用術(shù)語(yǔ)“參比表達(dá)譜”意指當(dāng)與測(cè)定結(jié)果比較時(shí)與特定結(jié)果在統(tǒng)計(jì)上相關(guān)聯(lián)的值。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)比較微RNA表達(dá)與已知臨床結(jié)果的研究的統(tǒng)計(jì)分析來(lái)確定參比值。參比值可以是閾值評(píng)分值或截止評(píng)分值。通常參比值可為閾值，高于該值一種結(jié)果更有可能，而低于該值備選閾值更有可能。靈敏度 本文所用“靈敏度”可意指二元分類檢驗(yàn)正確鑒定病況的良好程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)度量，例如將癌癥正確歸類為兩種可能類型中的正確類型的頻繁程度。A類的靈敏度是通過(guò)檢驗(yàn)確定屬于“A”類的病例占為“A”類的病例(如通過(guò)某一絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)或金標(biāo)準(zhǔn)確定的)的比例。特異性
本文所用“特異性”可意指二元分類檢驗(yàn)正確鑒定病況的良好程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)度量，例如將癌癥正確歸類為兩種可能類型中的正確類型的頻繁程度。A類的特異性是通過(guò)檢驗(yàn)確定屬于“非A”類的病例占為“非A”類的病例(如通過(guò)某一絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)或金標(biāo)準(zhǔn)確定的)的比例。副作用
本文所用副作用意指可歸因于治療的除所需作用外的生理反應(yīng)。選擇標(biāo)記
本文所用“選擇標(biāo)記”意指賦予宿主細(xì)胞表型的任何基因，選擇標(biāo)記在宿主細(xì)胞中表達(dá)以利于用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的鑒定和/或選擇。選擇標(biāo)記的代表性實(shí)例包括氨芐西林抗性基因(Amp1O、四環(huán)素抗性基因(IV)、細(xì)菌卡那霉素抗性基因(Kan1O、博來(lái)霉素(zeocin)抗性基因、賦予抗生素金擔(dān)子素A抗性的AUR1-C基因、草胺膦(phosphinothricin)抗性基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)、潮霉素抗性基因、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因、綠色熒光蛋白(GFP)-編碼基因和螢光素酶基因。嚴(yán)格雜交條件
本文所用“嚴(yán)格雜交條件”意指例如在核酸的復(fù)雜混合物中，第一核酸序列(例如探針)可與第二核酸序列(例如靶)雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境下將不同。在確定的離子強(qiáng)度、pH下，可選擇嚴(yán)格條件為低于特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10°C。Tm可為在平衡時(shí)50%與靶互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)(因?yàn)榘行蛄羞^(guò)量存在，在Tm處，在平衡時(shí)50%的探針被占用)。嚴(yán)格條件可為這樣的條件，其中鹽濃度小于約1.0 M鈉離子，例如在pH 7.0-8.3下約0.01-1.0 M鈉離子濃度(或其它鹽)，對(duì)于短探針(例如約10-50個(gè)核苷酸)，溫度為至少約30°C，對(duì)于長(zhǎng)探針(例如大于約50個(gè)核苷酸)，至少約60°C。還可加入去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)來(lái)達(dá)到嚴(yán)格條件。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)可為背景雜交的至少2-10倍。示例性的嚴(yán)格雜交條件包括下列條件:50%甲酰胺、5x SSC和1% SDS，在42°C下溫育，或者，5x SSC、1% SDS，在65°C下溫育，同時(shí)在0.2x SSC和0.1% SDS中于65°C洗滌?；净パa(bǔ)
本文所用“基本互補(bǔ)”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多個(gè)核苷酸的區(qū)域內(nèi)，第一序列與第二序列的互補(bǔ)序列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或兩個(gè)序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。基本同一的
本文所用“基本同一的”意指在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多個(gè)核苷酸或氨基酸內(nèi)，第一和第二序列有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 同一性，或?qū)τ诤怂幔绻谝恍蛄信c第二序列的互補(bǔ)序列基本互補(bǔ)。
`
受試者
本文所用術(shù)語(yǔ)“受試者”是指被選擇進(jìn)行治療或療法的人或非人動(dòng)物。本發(fā)明的方法優(yōu)選應(yīng)用于人受試者。“有需要的受試者”是指被鑒定為需要療法或治療的受試者。在某些實(shí)施方案中，受試者需要針對(duì)間皮瘤的治療。在這類實(shí)施方案中，受試者具有間皮瘤的一個(gè)或多個(gè)臨床指征或有發(fā)生間皮瘤的風(fēng)險(xiǎn)。靶核酸
本文所用“靶核酸”意指可被另一核酸結(jié)合的核酸或其變體。靶核酸可以是DNA序列。靶核酸可以是RNA。靶核酸可包含mRNA、tRNA、shRNA、siRNA或Piw1-相互作用RNA、或pr1-miRNA、pre-miRNA> miRNA 或反-miRNA (ant1-miRNA)。靶核酸可包含靶miRNA結(jié)合部位或其變體。一個(gè)或多個(gè)探針可結(jié)合靶核酸。靶結(jié)合部位可包含5-100或10-60個(gè)核苷酸。靶結(jié)合部位可包含總共5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30-40、40-50、50-60、61、62 或 63個(gè)核苷酸。革巴位點(diǎn)序列可包含美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/384，049、11/418，870或11/429,720中公開(kāi)的靶miRNA結(jié)合部位序列的至少5個(gè)核苷酸，所述專利內(nèi)容結(jié)合到本文中。療法
本文所用“療法”意指疾病治療方法。在某些實(shí)施方案中，療法包括但不限于酪氨酸激酶抑制療法、化學(xué)療法、手術(shù)切除、移植、放射療法、“基因療法”、免疫療法和/或化療栓塞(chemoembolization)?！爸委焺币庵赣糜谥斡?、改善或預(yù)防疾病的藥劑?！巴扑]療法”意指醫(yī)學(xué)專業(yè)人員推薦用于治療、改善或預(yù)防疾病的治療。治療有效量本文所用有關(guān)藥物劑量的“治療有效量”或“治療有效的”是指提供特定藥理反應(yīng)(為此將藥物給予眾多需要這類治療的受試者)的劑量。“治療有效量”可隨例如患者的身體狀況、患者的年齡和疾病的嚴(yán)重程度而變化。閾值表達(dá)水平
本文所用短語(yǔ)“閾值表達(dá)水平”是指參比表達(dá)值。將測(cè)量值與相應(yīng)的閾值表達(dá)水平進(jìn)行比較以確定受試者的預(yù)后。組織樣品
本文所用組織樣品是采用相關(guān)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法獲自組織活檢的組織。本文所用短語(yǔ)“疑似癌性”意指醫(yī)學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為含有癌細(xì)胞的癌組織樣品。從活組織檢查獲得樣品的方法包括團(tuán)塊(mass)的大致分配(gross apportioning)、顯微切割、基于激光的顯微切割或其它本領(lǐng)域已知的細(xì)胞分離方法。治療
本文所用“治療”或“醫(yī)治”當(dāng)涉及保護(hù)受試者免受病況時(shí)，可指預(yù)防、阻止、阻抑或消除該病況。預(yù)防病況包括在病況發(fā)作前將本文所述組合物給予受試者。阻止病況包括在誘導(dǎo)病況后但在其臨床表現(xiàn)前將組合物給予受試者。阻抑病況包括在病況臨床表現(xiàn)后將組合物給予受試者，使得病況減輕或防止惡化。消除病況包括在病況臨床表現(xiàn)后將組合物給予受試者，使得受試者不再患有該病況。單位劑型
本文所用“單位劑型”可指適于作為人或動(dòng)物受試者的單位劑量的物理分散單位。每個(gè)單位可含有預(yù)定量的本文所述組合物(經(jīng)計(jì)算為足以產(chǎn)生所需作用的量)以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或溶媒。單位劑型的規(guī)格可取決于所采用的具體組合物和要達(dá)到的作用以及宿主中與組合物有關(guān)的藥效學(xué)。變體
本文所用的涉及核酸的“變體”意指⑴參考核苷酸序列的一部分；(ii)參考核苷酸序列或其部分的互補(bǔ)序列；(iii)與參考核酸或其互補(bǔ)序列基本相同的核酸；或(iv)與參考核酸、其互補(bǔ)序列或與之基本相同的序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸。載體
本文所用“載體”意指含有復(fù)制起點(diǎn)的核酸序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、細(xì)菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以是自我復(fù)制的染色體外載體或整合至宿主基因組的載體。野生型
本文所用術(shù)語(yǔ)“野生型”序列是指編碼序列、非編碼序列或連接序列(interfacesequence)，所述連接序列是執(zhí)行該序列的天然或正常功能的序列的等位基因形式。野生型序列包括同族序列(cognate sequence)的復(fù)等位基因形式,例如野生型序列的復(fù)等位基因可編碼編碼序列編碼的蛋白質(zhì)序列的沉默變化或保守變化。1D/2D閾值分類器
本文所用“1D/2D閾值分類器”可意指用于將病例或樣品(例如癌癥樣品)分成兩種可能類型例如兩種癌癥 類型或兩種預(yù)后類型(例如良好和差)之一的算法。對(duì)于ID閾值分類器，判定基于一個(gè)變量和一個(gè)預(yù)定的閾值；如果變量超過(guò)閾值，則將樣品指定為一類，如果變量小于閾值，則指定為另一類。2D閾值分類器是根據(jù)兩個(gè)變量的值歸類為兩種類型之一的算法?？捎?jì)算評(píng)分為兩個(gè)變量的函數(shù)(通常為連續(xù)函數(shù))；然后，與ID閾值分類器相似，通過(guò)將評(píng)分與預(yù)定閾值進(jìn)行比較來(lái)做出判定。2.微RNA及其加工
編碼微RNA (miRNA)的基因可轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致miRNA前體(稱為pr1-miRNA)的產(chǎn)生。pr1-miRNA可以是包含多個(gè)pr1-miRNA的多順?lè)醋覴NA的部分。pr1-miRNA可形成帶有莖和環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。莖可包含錯(cuò)配堿基。Pr1-miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被Drosha (其是一種RNase III內(nèi)切核酸酶)識(shí)別。Drosha可識(shí)別pr1-miRNA中的末端環(huán)，并切割約2個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角到莖中以產(chǎn)生60-70個(gè)核苷酸前體，稱為pre-miRNA。Drosha可切割pr1-miRNA,伴隨RNase III內(nèi)切核酸酶特有的交錯(cuò)切口，產(chǎn)生具有5’磷酸和約2個(gè)核苷酸3’突出端的pre-miRNA莖環(huán)。延伸至Drosha切割位點(diǎn)以外的莖(約10個(gè)核苷酸)的約I個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角對(duì)有效加工可能是必需的。然后可通過(guò)Ran-GTP和輸出受體Ex-portin-5主動(dòng)地將pre_miRNA從核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)。
·
pre-miRNA可被Dicer (其也是一種RNase III內(nèi)切核酸酶)識(shí)別。Dicer可識(shí)別pre-miRNA的雙鏈莖。Dicer還可識(shí)別莖環(huán)基部的5’磷酸和3’突出端。Dicer可從莖環(huán)基部切下末端環(huán)2個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角，留下另外的5’磷酸和約2個(gè)核苷酸3’突出端。所得的可包含錯(cuò)配的siRNA樣雙鏈體包含成熟miRNA和相似大小的稱為miRNA*的片段。miRNA和miRNA*可來(lái)源于pr1-miRNA和pre-miRNA的相對(duì)臂。MiRNA*序列可存在于克隆miRNA文庫(kù)，但通常頻率比miRNA低。雖然最初作為具有miRNA*的雙鏈種類存在，但miRNA最終可作為單鏈RNA摻入到核糖核蛋白復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)。各種蛋白質(zhì)都可形成RISC，這可導(dǎo)致以下方面的變化性:對(duì)miRNA/miRNA*雙鏈體的特異性、靶基因的結(jié)合部位、miRNA的活性(阻抑或活化)、miRNA/miRNA*雙鏈體的哪條鏈加載入RISC中。當(dāng)miRNA:miRNA*雙鏈體的miRNA鏈加載入RISC時(shí)，miRNA*可被除去并降解。力口載至RISC的miRNA:miRNA*雙鏈體的鏈可以是其5’端較不緊密配對(duì)的鏈。在miRNA:miRNA*的兩端具有大致相當(dāng)?shù)?’配對(duì)的情況下，miRNA和miRNA*兩者可具有基因沉默活性。RISC可根據(jù)miRNA和mRNA之間高水平的互補(bǔ)性，尤其通過(guò)miRNA的核苷酸2_7來(lái)鑒定靶核酸。在動(dòng)物中只報(bào)告了一例，其中miRNA及其靶之間的相互作用沿著miRNA的全長(zhǎng)。對(duì)于mir-196和Hox B8表明如此,并且進(jìn)一步表明mir_196介導(dǎo)Hox B8 mRNA的切割(Yekta等，2004，Science 304-594)。否則，僅已知植物中的這種相互作用(Bartel和Bartel 2003，Plant Physiol 132-709)。已對(duì)miRNA及其mRNA靶之間的堿基配對(duì)要求進(jìn)行了許多研究以實(shí)現(xiàn)翻譯的有效抑制(Bartel 2004, Cell 116-281的綜述)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，miRNA的頭8個(gè)核苷酸可能是重要的(Doench和Sharp 2004 GenesDev 2004-504)。然而，微RNA的其它部分也可參與mRNA結(jié)合。此外,在3’處的充分堿基配對(duì)可補(bǔ)償在5’處的不充分配對(duì)(Brennecke等，2005 PLoS 3-e85)。在整個(gè)基因組上分析miRNA結(jié)合的計(jì)算研究表明了 miRNA 5’處的堿基2_7在靶結(jié)合中的特定作用，但也認(rèn)識(shí)到第一個(gè)核苷酸(發(fā)現(xiàn)通常為“A”)的作用(Lewis等，2005Cell 120-15)。同樣地，Krek 等人(2005,Nat Genet 37-495)使用核苷酸 1-7 或 2-8 來(lái)鑒定和證實(shí)靶。mRNA中的靶位點(diǎn)可在5’ UTR,3' UTR或在編碼區(qū)中。引人關(guān)注的是，多個(gè)miRNA可通過(guò)識(shí)別相同位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)相同的mRNA靶。大多數(shù)遺傳上鑒定的靶中多個(gè)miRNA結(jié)合部位的存在可表明，多個(gè)RISC的協(xié)同作用提供最有效的翻譯抑制。miRNA可通過(guò)以下兩種機(jī)制中的任一種指導(dǎo)RISC減量調(diào)節(jié)基因表達(dá):mRNA切割或翻譯阻抑。如果mRNA與miRNA具有某種程度的互補(bǔ)性，則miRNA可指定mRNA的切割。當(dāng)miRNA引導(dǎo)切割時(shí)，切割可介于與miRNA的殘基10和11配對(duì)的核苷酸之間?；蛘撸绻鹠iRNA與miRNA不具有必要程度的互補(bǔ)性,則miRNA可阻抑翻譯。翻譯阻抑在動(dòng)物中可能更普遍，因?yàn)閯?dòng)物在miRNA和結(jié)合部位之間可具有較低程度的互補(bǔ)性。應(yīng)當(dāng)注意，miRNA和miRNA*的任何配對(duì)的5’端和3’端中可存在變化性。該變化性可能由于有關(guān)切割部位的Drosha和Dicer的酶促加工的變化性所致。miRNA和miRNA*的5’端和3’端處的變化性還可能由于pr1-miRNA和pre-miRNA的莖結(jié)構(gòu)的錯(cuò)配所致。莖鏈的錯(cuò)配可導(dǎo)致一群不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。莖結(jié)構(gòu)的變化性還可導(dǎo)致由Drosha和Dicer切割的產(chǎn)物的變化性。3.核酸
本文提供核酸。該核酸包含SEQ ID NO: 1-124的序列或其變體。變體可以是參考核苷酸序列的互補(bǔ)序列。變體還可以是與參考核苷酸序列或其互補(bǔ)序列基本相同的核苷酸序列。變體還可以是在嚴(yán)格條件下與參考核苷酸序列、其互補(bǔ)序列或與之基本相同的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。核酸的長(zhǎng)度可為10-250個(gè)核苷酸。核酸的長(zhǎng)度可為至少10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250個(gè) 核苷酸?？墒褂帽疚乃龊铣苫蛟诩?xì)胞(體外或體內(nèi))中合成或表達(dá)核酸。核酸可作為單鏈分子合成，并與基本互補(bǔ)核酸雜交形成雙鏈體?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，包括美國(guó)專利號(hào)6，506，559 (其通過(guò)引用予以結(jié)合)中描述的方法，將核酸以單鏈或雙鏈形式導(dǎo)入細(xì)胞、組織或器官或者能夠通過(guò)合成基因表達(dá)。表1:與間皮瘤患者生存相關(guān)的核酸序列 _
權(quán)利要求
1.一種用于確定受試者的間皮瘤的預(yù)后的方法，所述方法包括: (a)提供來(lái)自受試者的生物樣品； (b)測(cè)定所述樣品中選自SEQID NO: 1-16、21-77的核酸序列和與之有至少約80%同一'I"生的序列的表達(dá)水平；和 (C)將所述表達(dá)水平與閾值表達(dá)水平進(jìn)行比較， 其中所述核酸的表達(dá)水平與所述閾值表達(dá)水平的比較表示所述受試者的預(yù)后。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸序列選自SEQID NO: 1-4、11_12、21、22、27_35、45-47,52-59,70-72和與之有至少約80%同一性的序列，且其中與所述閾值表達(dá)水平相比，所述核酸序列中任一個(gè)表達(dá)水平的提高表示所述受試者的預(yù)后良好。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸序列選自SEQID NO: 5_10、13-16、23_26、36_44、48-51,60-69,73-77和與之有至少約80%同一性的序列，且其中與所述閾值表達(dá)水平相比，所述核酸序列中任一個(gè)表達(dá)水平的 提高表示所述受試者的預(yù)后差。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
5.權(quán)利要求1中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用來(lái)確定所述受試者的治療進(jìn)程。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品選自體液、細(xì)胞系和組織樣品。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述體液是血液。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述組織是新鮮、冷凍、固定、蠟包埋或福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述組織是間皮。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述表達(dá)水平通過(guò)選自核酸雜交、核酸擴(kuò)增及其組合的方法測(cè)定。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸雜交使用固相核酸生物芯片陣列或原位雜交進(jìn)行。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸擴(kuò)增方法是實(shí)時(shí)PCR。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述實(shí)時(shí)PCR方法包括正向引物和反向引物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述正向引物包含與選自SEQID NO: 1_16、21_77的序列、其片段或與之有至少約80%同一性的序列部分互補(bǔ)的核酸序列。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述正向引物包含選自SEQID NO: 78-100的序列和與之有至少約80%同一性的序列。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述反向引物包含SEQID NO: 124和與之有至少約80%同一性的序列。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述實(shí)時(shí)PCR方法還包括探針。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述探針包含與SEQID NO: 1_16，21-77、其片段或與之有至少約80%同一性的序列互補(bǔ)的序列。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述探針包含選自SEQID NO: 101-123的序列和與之有至少約80%同一性的序列。
20.一種用于確定患有間皮瘤的受試者的預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含正向引物和反向引物及探針。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述探針包含與選自SEQID NO: 1_16、21_77的序列、其片段或與之有至少約80%同一性的序列互補(bǔ)的核酸序列。
22.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述探針包含選自SEQID NO: 101-123的序列和與之有至少約80%同一性的序列。
23.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述正向引物與SEQID NO: 1_16、21_77、其片段或與之有至少約80%同一性的序列部分互補(bǔ)。
24.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述正向引物包含選自SEQID NO: 78-100的序列和與之有至少約80%同一性的序列。
25.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述反向引物包含選自SEQID NO: 124的序列和與之有至少約80%同一性的序列。
26.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述試劑盒包含用于進(jìn)行原位雜交分析的試劑。
全文摘要
公開(kāi)了用于在外科手術(shù)后間皮瘤患者預(yù)后的組合物和方法。特別地，本公開(kāi)內(nèi)容提供了與間皮瘤預(yù)后有關(guān)的微RNA分子(miRNA)，以及與之相關(guān)或來(lái)源于其中的各種核酸分子。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了與間皮瘤預(yù)后良好或預(yù)后差相關(guān)的miRNA的改變的表達(dá)。
文檔編號(hào)C07H21/04GK103180461SQ201180046138
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月25日
發(fā)明者H.帕斯, M.霍申, Y.戈倫 申請(qǐng)人:紐約大學(xué)