專利名稱：病毒基因組中的高度保守區(qū)序列作為設計治療性sliRNA模板的應用的制作方法
病毒基因組中的高度保守區(qū)序列作為設計治療性SI iRNA模板的應用交叉引用本申請要求2010年9月20日提交的美國申請第12/886，446號的權(quán)益，該美國申請的全部內(nèi)容在此通過弓I用并入本文。對序列表的引用本申請包括通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且該序列表的全部內(nèi)容在此通過引用并入本文。在2011年9月19日創(chuàng)建的ASCII副本的名稱為Doc.N0.4170050_1.txt,大小為 9.28KB。
背景技術(shù)：
小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)是帶有特定基因密碼的短雙鏈RNA片段，功能長度一般為21-23核苷酸。siRNA與互補mRNA特異性結(jié)合，使靶定的mRNA降解并失去功能。這種由siRNA有效介導的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象稱之為RNAi (RNA干擾)，其為自然存在于細胞中的防御機制。當雙鏈RNA進入細胞內(nèi)時，其被切割成帶有21-25個核苷酸的siRNA片段。所述片段先與細胞內(nèi)的其它成分結(jié)合以形成核酸蛋白復合體，稱之為RNA誘導的沉默復合物(RISC)。激活的RISC通過堿基配對靶向到同源mRNA上，從而切割并降解mRNA，由此阻止細胞內(nèi)特定的基因表達。siRNA不僅廣泛應用于生物醫(yī)學研究，而且在治療多種疾病如病毒感染、癌癥、血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等具有廣闊的前景。年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是50歲以上的人視力不可逆性損害的主要原因之一。AMD在臨床上分為“干性”和“濕性”兩型，濕性AMD發(fā)展快，是引起失明的主要原因。其病理變化導致嚴重的視力障礙。AMD的表現(xiàn)包括視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)功能受損和黃斑部脈絡膜新生血管(CN V)。在一些嚴重病例中還會出現(xiàn)液體滲出，RPE或神經(jīng)上皮的脫離，血管破裂造成出血性脫離。已發(fā)現(xiàn)許多細胞因子在CNV的生成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，所述細胞因子包括血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、VEGF受體(VEGFR)、缺氧誘導因子(HIF)、血管生成素(Ang)和其它細胞因子，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及其它。已對RNAi在抑制CNV方面的效力做了測試，Cashman等的研究表明(Cashman SM等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2006 ;47 (8):3496_3504)，將構(gòu)建在腺病毒表達載體中的VEGF短發(fā)夾RNA (shRNA)玻璃體腔內(nèi)注射于VEGF165誘導的CNV小鼠模型。該注射治療可有效地抑制VEGF的過表達并且成功地阻止CNV的形成。證據(jù)顯示shRNA腺病毒載體被遞送(跨膜)至細胞質(zhì)并引發(fā)RISC的活化，使目標RNA降解。由于人們對腺病毒載體在臨床應用上的顧慮，嘗試使用裸露(無傳輸介質(zhì)M^VEGF siRNA使目標基因沉默。結(jié)果顯示通過裸露的“siRNA”抑制VEGF表達確實降低了在小鼠模型中CNV的形成(Reich，S.J等人，Mol.Vis.2003 ；9:210 - 216)。本領(lǐng)域仍然需要改良的、基于RNA的抑制劑，用于治療如AMD和CNV的疾病
發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)的sliRNA，該sliRNA含有與病毒基因組序列的高度保守區(qū)的片段具有至少80%同源性的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述核苷酸序列與高度保守區(qū)的片段具有至少85%、90%、95%、100%的同源性。在一些實施方式中，Toll樣受體是Toll樣受體3 (TLR3)。在一些實施方式中，高度保守區(qū)位于病毒基因組的選自5’非翻譯區(qū)(UTR)、3’UTR及開放閱讀框(ORF)的區(qū)域。在一些實施方式中，病毒是選自脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、人腸道孤病毒、微小核糖核酸病毒、腸道病毒的人類病毒。在一些實施方式中，高度保守區(qū)序列位于SEQ ID NO:1的241-263位。在一些實施方式中，sliRNA包括雙鏈RNA，該雙鏈RNA可為平末端或可具有3’或5’突出端。在一些實施方式中，sliRNA的長度為14-25核苷酸。在一些實施方式中，sliRNA包括位于核苷酸序列的3’端的I 2個DNA堿基。另一方面，本發(fā)明提供sliRNA，該sliRNA包含具有以下序列的雙鏈RNA分子:正義鏈:5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3’ (SEQ ID NO: 14)反義鏈:5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3’，(SEQ ID NO: 15)或:正義鏈:5’-AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3’ (SEQ ID NO:28)反義鏈:5’-GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3，(SEQ ID NO:29)其中，N是選自胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶及其脫氧形式的核苷酸，并且，其中，η是O 2的整數(shù)。在一些實施方式中，N是dT，且η為2。在一些實施方式中，η為2。再一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文提供的sliRNA,以及藥學上可接受的載體。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療病理性血管生成相關(guān)疾病的方法，所述方法包括將藥學有效劑量的本文提供的sliRNA給藥至需要這種治療的受治者。在一些實施方式中，這些疾病選自:老年性黃斑變性(AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變及癌癥。另一方面，本發(fā)明提供了一種設計sliRNA的方法，所述方法包括從病毒基因組序列中選擇高度保守區(qū)，并測試包含與高度保守區(qū)的片段具有至少80%、85%、90%、95%、100%同源性的核苷酸序列的RNA調(diào)節(jié)TLR (如TLR3)活性的能力。通過引用并入本文如同將各單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用單獨并入本文中一樣，本文所提及的所有出版物、專利和專利申請均以相同的程度通過引用并入本文。


本發(fā)明的新特征由所附的權(quán)利要求書中的具體內(nèi)容來闡述。為了更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，以下將利用本發(fā)明原理通過說明書實施例和附圖進行詳細闡明。圖1是鞏膜-脈絡膜/視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)鋪片的熒光顯微照片(放大40倍):綠色通道圖片顯示鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)陽性的RPE細胞呈均勻一致的六邊形緊密排列(圖la)，紅色通道圖片顯示同工凝集素-B4 (iB4)_陽性的血管內(nèi)皮細胞(圖lb)，綠色-紅色-藍色通道的疊加圖像顯示出RPE、血管內(nèi)皮細胞和4’，6’- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標記的細胞核的重疊(圖lc)。 圖2a為在C57BL/6J小鼠體內(nèi)通過激光光凝作用誘導的CNV小鼠模型的眼球剖面圖。圖右下方箭頭指示光凝斑在視乳頭旁。圖2b為氪激光光凝后5min的眼底照片，箭頭指示光凝斑和視網(wǎng)膜水腫；圖2c是顯微鏡下下觀察到的鞏膜-脈絡膜/RPE的鋪片顯微照片(放大IOOX )，箭頭指示光凝斑在視神經(jīng)旁。圖3是用共焦激光視網(wǎng)膜斷層掃描儀記錄的顯微照片:眼底熒光血管造影(FFA)檢查顯示C57BL/6J小鼠在氪激光光凝后發(fā)生血管改變。光凝后7天，可在盤狀熒光素滲漏處觀察到光凝斑(圖3a);光凝后14天，可在熒光素滲漏處明顯地觀察到光凝斑(圖3b)(圖中箭頭所指為光凝部位)。光凝后28天，在熒光滲漏處無明顯光凝斑，并且出現(xiàn)瘢痕化(圖3c)。圖4是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片的熒光顯微照片(放大100倍):激光誘導的灼傷位于如圖4d-f所示的環(huán)形缺損區(qū)內(nèi)。在光凝后第4天，缺損區(qū)內(nèi)出現(xiàn)一些細胞碎片以及細胞核碎片(圖4g-1 )。到第7天時，在激光損傷區(qū)可以看到同工凝集素-B4染色的CNV網(wǎng)。RPE細胞覆蓋CNV復合體區(qū)域(圖4j-l)。第14天和第28天CNV面積無明顯不同，但是與第7天的CNV面積相比明顯增加。圖5是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光D API (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖6是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。用5%葡萄糖溶液處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖7是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。用阿瓦斯汀(Avastin)處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色)、同工凝集素-B4(紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖8是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。用siEv70_l處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖9是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。用siEv70_2處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖10是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。用siEv70_3處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖11是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。用siEv70_4處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖12是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片(放大100倍)。用siEv70_5處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)及鬼筆環(huán)肽(綠色)分別標記細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE。圖13顯示用ImageJ圖像分析軟件定量分析CNV的平均面積，圖中顯示每個處理組均小于陰性對照組；siEv70_2處理組明顯小于其它處理組。
圖14是不同處理組VEGF mRNA表達水平:激光誘導的未處理的眼內(nèi)的VEGF mRNA水平明顯高于其它處理組，在處理組中，siEv70_2處理組的VEGFmRNA水平為統(tǒng)計學意義上的最低水平。圖15顯示實時PCR檢測不同處理組TLR3的mRNA水平:siEv70_2處理組的TLR3mRNA水平高于對照組。其它處理組與對照組相比沒有明顯差異。siEv70_6 (DNA:RNA雜交體)激活TLR3能力弱于具有同樣序列的dsRNA (siEv70_2)。圖16顯示實時PCR檢測不同處理組IL12a mRNA水平:siEv70_2處理組的IL12amRNA水平高于對照組。其它處理組與對照組相比沒有明顯差異。siEv70_6(DNA:RNA雜交體)激活I(lǐng)L12a能力弱于具有同樣序列的dsRNA (siEv70_2)。圖17a和17b顯不了病毒基因組的聞度保守區(qū)。圖18a是pNF- κ B-TA-1uc的質(zhì)粒圖譜。圖18b是不同處理組激活的NF- κ B的不同水平。圖19a顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片(放大100X)。用siEv70_6處理的激光光凝后第7天的樣品作為對照。細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE分別用熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)和鬼筆環(huán)肽(綠色)標記。siEv70_6 (DNA:RNA雜交體)的CNV抑制效力弱于具有同樣序列的dsRNA (siEv70_2)。圖19b顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片(放大100X )。用siEv70_7處理的激光光凝后第7天的樣品作為對照。細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE分別用熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)和鬼筆環(huán)肽(綠色)標記。沒有觀察到明顯的CNV抑制。

圖20顯示了經(jīng)A) siEv70_2、B)阿瓦斯汀和C) 5%葡萄糖刺激后觀察到的主動脈環(huán)內(nèi)皮發(fā)芽情況。圖21顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片(放大100X )。在CNV小鼠中評價注射siEv70_2抑制激光誘導的CNV的劑量效應關(guān)系。細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE分別用熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-B4 (紅色)和鬼筆環(huán)肽(綠色)標記。與未處理組(圖 21a-c)和陰性對照組(圖 21d-f)相比，siEv70_2 (2μ g)(圖 21m_o)處理組，siEv70_2(IOyg)(圖21p-r)處理組和poly(1:C)陽性對照組(圖21g_i)的CNV面積明顯減少。siEv70_2 (0.2μ g)處理組未觀察到CNV抑制效果(圖21j_l)。圖22顯示了 CNV面積的盒須圖。Y軸表示CNV的面積，用平方微米(μ m2)表示。每個點對應一個 CNV 缺損(總數(shù)為 247)，包括 siEv70_2 (0.2μ g) (n=41)、siEv70_2 (2μ g)(η=52)、siEv70_2 (10 μ g) (η=35)、poly (1: C) (n=39)、GS (η=40)和未處理組(η=40)。圖23顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片(放大100倍)。在激光誘導的CNV小鼠中評價玻璃體內(nèi)注射BMOl對CNV的抑制效果。細胞核、內(nèi)皮細胞和RPE分別用熒光DAPI (藍色)、同工凝集素-Β4 (紅色)和鬼筆環(huán)肽(綠色)標記。與未處理組(圖23a-c)和陰性對照組(圖23d-f)相比，在BMOl處理組和poly(1:C)處理組(圖23J-1和圖23g-1)中CNV被明顯抑制。圖24顯示CNV面積的盒須圖。Y軸表示CNV的面積，用平方微米(μ m2)表示。每個點對應一個 CNV 缺損(總數(shù)為 155)，包括 BMOl (n=36)、poly (1: C) (n=39)、GS (n=40)和未處理組(n=40)。
具體實施例方式下面參考實施例以舉例說明的目的對本發(fā)明的幾個方面進行描述。應當理解的是，以下列出的許多具體細節(jié)、關(guān)系和方法用以完整理解本發(fā)明。然而，相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認識到，本發(fā)明可不通過具體描述中的一個或一個以上方法來實施而以其它方法實施。另外，本發(fā)明并不限于所示的行為或事件的順序，因為一些行為可能以不同的順序和/或與其它行為或事件同時出現(xiàn)。此外，并不要求所有示出的動作或事件均根據(jù)本發(fā)明的方法來實施。本文使用的術(shù)語是用于描述特定實施方式，而無意限定本發(fā)明。除非另有明確說明，本文所用的單數(shù)形式(“a”，“an”和“the”)也意在包括復數(shù)形式。此外，術(shù)語“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“帶有”或同類用法用在具體實施方式
和/或權(quán)利要求書中，這些術(shù)語意在包括與術(shù)語“包括”類似的方式。術(shù)語“約”或“大約”是指由本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的特定值的可接受的誤差范圍，該誤差范圍部分取決于該值是如何被檢測或確定的，即，測量系統(tǒng)的限制。例如，本領(lǐng)域中“大約”可意味著每次實施在I或I個以上標準偏差以內(nèi)。可選地，“大約”可意味著高達給定值的20%，優(yōu)選地為高達給定值的10%，更優(yōu)選地為高達給定值的5%，并且還更優(yōu)選地為高達給定值的1%?？蛇x地，對于生物系統(tǒng)或過程而言，該術(shù)語可意味著在一個數(shù)量級之內(nèi)，優(yōu)選地為某個值的5倍之內(nèi)，更優(yōu)選地為某個值的2倍之內(nèi)。在本申請和權(quán)利要求書中對具體值進行描述的條件下，除非另有說明，認為術(shù)語“約”是指在特定值的可接受的誤差范圍內(nèi)。1.小配體 RNA
一方面，本發(fā)明提供了與用于調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)的sliRNA有關(guān)的組合物和方法，該RNA包括與病毒基因組序列的高度保守區(qū)的片段具有至少80%同源性的核苷酸序列。本文所述的小配體RNA (sliRNA)是指作為TLR配體的RNA。術(shù)語“調(diào)節(jié)”或“調(diào)節(jié)表達”是指編碼基因的核酸分子(如DNA或RNA)的量或水平升高(刺激)或降低(抑制)。抑制通常為調(diào)節(jié)表達的優(yōu)選形式，并且mRNA通常為優(yōu)選的靶核酸。Toll 樣等體Toll樣受體(TLR)在識別病原體成分以及隨后的激活先天免疫反應中發(fā)揮重要作用，然后所述先天免疫反應的激活引發(fā)適應性免疫反應的產(chǎn)生。TLR由引起與病原相關(guān)分子模式(PAMP)結(jié)合的大的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域和與分子結(jié)合并啟動細胞免疫反應的細胞內(nèi)Toll/白介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域組成。在哺乳動物體內(nèi)已鑒別出至少10種特異性識別所有主要類別的病原體的TLR成員，在小鼠中已鑒別出11種特異性識別所有主要類別的病原體的分子模式的TLR成員。TLR與親水性核酸至LPS范圍內(nèi)的多種多樣的配體結(jié)合，而且，異源二聚作用擴大了配體范圍。TLR2和TLR4識別細菌細胞成分。TLR6與TLR2結(jié)合識別多種細菌細胞壁成分(Mariotti等人，Diversity2009, I, 7_18)。在一些實施方式中，Toll樣受體是Toll樣受體3 (TLR3)。TLR3識別雙鏈(ds)RNA。病毒在感染細胞中復制時產(chǎn)生dsRNA，這說明其胞外結(jié)構(gòu)域引起 dsRNA 結(jié)合(Akira 等人.Biochem Soc Trans, 2003 ;31:637_642)。所觀察到的TLR3的抗新生血管功能的建議機制為激活I(lǐng)L12和IFN-Y，IL12和IFN-Y為已表現(xiàn)出抑制新血管形成的兩個媒介(Voest 等人.JNatl Cancer Inst, 1995 ；87:581-586.19)。RISC介導的基因沉默需要將siRNA遞送到細胞質(zhì)。然而，裸露的“siRNA”不能透過生物膜。裸露的“siRNA”抑制CNV的秘密直到近期Kleinman等人(Kleinman等人.Nature ；2008 ；452:591-597)做了報道才被知曉。他們發(fā)現(xiàn)基于裸露的“siRNA”對CNV的抑制是通過激活細胞表面Toll樣受體3 (TLR3)而實現(xiàn)的，而不是通過RISC實現(xiàn)的，且抑制不依賴于RNA序列。最近，另一科研組證實“siRNA”介導的通過TLR3的信號轉(zhuǎn)導能夠抑制通過實驗的方式誘導的CNV,而不依賴于“siRNA”祀定的基因(Maloney等人.0phthalmic Res,2010 ;44:237-241)。sliRNA的化學纟目成本發(fā)明所述的sliRNA包括單鏈或雙鏈的寡核苷酸。本文使用的術(shù)語“雙鏈RNA”或“dsRNA”是指一種具有雙鏈結(jié)構(gòu)的核糖核酸分子或核糖核酸分子的復合物，所述雙鏈結(jié)構(gòu)的核糖核酸分子包含如本文所定義的兩條反向平行的且基本互補的核酸鏈。形成雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈，可以是一個較大的RNA分子的不同部分，或是單獨的RNA分子。當這兩條鏈為一個較大的RNA分子的不同部分時，這兩條鏈由在形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈的3’端和另一條鏈的5’端之間的連續(xù)的核苷酸鏈連接，連接的RNA鏈稱為“發(fā)卡環(huán)”。當兩條鏈由不同于上述在形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈的3’端和另一條鏈的5’端之間的核苷酸的連續(xù)鏈的共價方式連接時，連接的結(jié)構(gòu)稱為“接頭”。RNA鏈可以含有相同或不同數(shù)目的核苷酸。堿基對的最大數(shù)是最短鏈的dsRNA的核苷酸數(shù)。除了雙體結(jié)構(gòu)之外，dsRNA還可以包含一個或一個以上核苷酸懸垂部分。本文所述的dsRNA也被稱為“小配體 RNA” 或“sliR NA”。本文所述的“核苷酸懸垂部分”是指一種不配對的核苷酸或當dsRNA的一條鏈的3’端延伸超出另一條鏈的5’端時從dsRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)中突出的核苷酸，反之亦然?！捌蕉恕被颉捌侥┒恕笔侵冈赿sRNA的末端沒有不配對的核苷酸，S卩，無核苷酸懸垂部分?！捌侥┒说摹眃sRNA是在其整個長度范圍內(nèi)均為雙鏈的dsRNA，S卩，在分子的任一端都無核苷酸懸垂部分。術(shù)語“反義鏈”是指包括與病毒基因組序列高度保守區(qū)序列的相應部分基本互補的區(qū)域的dsRNA鏈。本文所述的術(shù)語“互補區(qū)域”是指反義鏈中的與序列(例如，本文所定義的靶序列)基本互補的區(qū)域。當互補區(qū)域與高度保守區(qū)的序列不完全互補時，只允許錯配發(fā)生在末端區(qū)域，如果存在錯配，一般是在末端區(qū)域或者例如，在5’和/或3’末端的6、5、
4、3或2個核苷酸范圍內(nèi)的區(qū)域。本文所述術(shù)語“正義鏈”是指包括與反義鏈的區(qū)域基本互補的區(qū)域的dsRNA鏈。正義鏈一般是與從病毒基因組轉(zhuǎn)錄而來的RNA相同的鏈，優(yōu)選地是編碼蛋白質(zhì)的RNA。術(shù)語“同源性”是指兩個或兩個以上多聚核苷酸序列之間的關(guān)系，如通過序列比對確定。同源性還指多聚核苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)度，如由序列的字符串之間的匹配確定。已有許多檢測兩個多聚核苷酸序列之間同源性的方法，并且該術(shù)語是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見如分子生物學序列分析，von Heinje1G.,科學出版社(1987);以及引物序列分析，Gribskov.，M.and Devereux, J., eds., M.Stockton Press, New York (1991))。本文所述的術(shù)語“基本相同”是指dsRNA的正義鏈與靶基因的相應部分之間存在非常高度的同源性(如100%序列同源性)。然而，本發(fā)明還可使用具有超過90%或95%序列同源性的dsRNA，因此可以容忍由基因突變、應變多態(tài)性或進化趨異導致的預期的序列變異。盡管100%同源性是典型的，但是dsRNA可以包括RNA和高度保守區(qū)序列之間的單個或多個堿基對的隨機錯配。在一種實施方式中，dsRNA的至少一個末端含有I至4個核苷酸的，通常為I或2個核苷酸的個單鏈核苷酸懸垂部分。出乎意料地，包含至少一個核苷酸懸垂部分的dsRNA具有優(yōu)于其平末端對照物的抑制性能。在一些實施方式中，只有一個核苷酸懸垂部分可以增強dsRNA的活性，而不影響它的整體穩(wěn)定性。僅僅包含一個懸垂部分的dsRNA被證實在體內(nèi)特別穩(wěn)定和有效，同時在不同的細胞、細胞培養(yǎng)基、血液、血清中也特別穩(wěn)定和有效。一般地，單鏈懸垂部分位于反義鏈的3’端，或可選地，位于正義鏈的3’端。dsRNA也可以含有平末端，其一般位于反義鏈的5’端。這些dsRNA被證實具有提高的穩(wěn)定性和抑制活性，因此允許給藥低劑量，即，少于每天5mg/kg受試者體重。在一種實施方式中，dsRNA的反義鏈在超出正義鏈的3’端和5’端分別 具有1-10個核苷酸懸垂部分。在一種實施方式中，dsRNA的正義鏈在3’端和反義鏈的5’端分別具有1-10個核苷酸懸垂部分。在另一實施方式中，懸垂部分中的核苷酸中的一個或一個以上可被硫代磷酸酯核苷替代。在一些實施方式中，sliRNA包含具有連接至RNA = RNA雙鏈的3’端或5’端的O、1、
2、3、4或5個DNA堿基對的RNA: RNA雙鏈。在一些實施方式中，優(yōu)選地為DNA堿基對連接至3’端。堿基對可具有1、2、3或4個核苷酸懸垂部分。在一些實施方式中,優(yōu)選地為平末端DNA堿基對。在一些實施方式中，DNA優(yōu)選地為T或dT。在一些實施方式中，sliRNA包含在核苷酸序列的3’端的1、2、3、4或5個脫氧核糖核苷酸堿基。所述堿基可以是:胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、脫氧胞苷(dC)、脫氧鳥苷(dG)、脫氧腺苷(dA)、或脫氧胸苷(dT)，或其類似物。在本發(fā)明中，術(shù)語“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體，或模擬物。本文所述術(shù)語“寡核苷酸”包括天然的和/或修飾的單體或鍵合的線性或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷類、核糖核苷類、其取代形式和α-異頭物形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯，及其它類似物。寡核苷酸能夠通過單體-單體相互作用(例如，Watson-Crick型堿基配對，Hodgsteen或反式Hodgsteeii型堿基配對，等等)的常規(guī)模式特異性地結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同的區(qū)域組成。在本發(fā)明中，“嵌合的寡核苷酸”或“嵌合體(chimeras)”是含有兩個或兩個以上化學上不同的區(qū)域的寡核苷酸，其中，每個區(qū)域由至少一個核苷酸構(gòu)成。這些寡核苷酸通常包括至少一個修飾的核苷酸區(qū)域和作為能夠切割RNA = DNA或RNA: RNA雜交體的酶的底物的區(qū)域，其中，所述至少一個修飾的核苷酸區(qū)域賦予一種或一種以上有益性能(如，提聞對核酶的耐受:性、提聞細胞的攝取、提聞RNA革巴的結(jié)合親和力)。例如，RNase H是一種細胞的核酸內(nèi)切酶，其切割RNA = DNA雙鏈中的RNA鏈。因此,RNase H的激活導致RNA靶被切割，從而大大增強了反義鏈抑制基因表達的效力。因此，和與相同目標區(qū)域雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，當使用嵌合的寡核苷酸時，通?？赏ㄟ^較短的寡核苷酸得到可比較的結(jié)果。RNA靶的切割通?？梢杂媚z電泳檢測，如有必要,也可以用本領(lǐng)域熟知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)。
在一些實施方式中，被修飾的寡核苷酸的區(qū)域包括至少一個在糖環(huán)的2’位被修飾的核苷酸，最優(yōu)選地為2’ -O-烷基、2’ -O-烷基-O-烷基或2’ -氟修飾的核苷酸。在其它優(yōu)選的實施方式中，RNA修飾包括在RNA的3’端的嘧啶核糖上的2’ -氟、2’ -氨基和2’氧-甲基修飾、脫堿基殘基或反堿基。這種增加的親和力的效果大大提高了 sliRNA的寡核苷酸對基因表達的抑制。RNA靶的切割通常由凝膠電泳證實。在另一優(yōu)選的實施方式中，嵌合的寡核苷酸還被修飾以增強核酸酶耐受性。細胞含有多種可降解核酸的外源或內(nèi)源核酸酶。對核苷酸和核苷的許多修飾已顯示出使合并了修飾的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸更耐受核酸酶消化。核酸酶耐受性通常通過如下方式來檢測:使寡核苷酸與細胞提取物或分離的核酸酶溶液共孵育并且通過凝膠電泳測量完整的寡核苷酸隨時間推移其完整程度的變化。與未修飾的寡核苷酸相比，為了提高其核酸酶耐受性而被修飾的寡核苷酸維持其完整性持續(xù)一段更長的時間段。已經(jīng)證實了對多種寡核苷酸的修飾增強或賦予核酸酶耐受性。
本發(fā)明更加優(yōu)選地為包含至少一個硫代磷酸修飾的寡核苷酸。在某些情況下，提高靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾還能夠獨立地增強核酸酶的耐受性。一些理想的修飾見DeMesmaeker et al.Acc.Chem.Res.1995，28:366-374。沒有必要在給出的寡核苷酸的所有位點進行統(tǒng)一修飾，事實上，上述的多個修飾可以摻入到單個的寡核苷酸或甚至寡核酸中的單個核苷中。本發(fā)明也包括如上文定義的作為嵌合的寡核苷酸的寡核苷酸。在另一實施方式中，本發(fā)明中的核酸分子與另一基團偶聯(lián)，所述基團包括但不限于:脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽類、碳水化合物、脂質(zhì)、多聚碳氫化合物。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員會認識到，這些分子可以被連接到包括核酸分子的任何核苷酸中的一個或一個以上的的糖、堿或磷酸基團上的多個位點。本發(fā)明中的寡核苷酸可以通過熟知的固相合成技術(shù)方便地且常規(guī)地制備。包括Applied Biosystems在內(nèi)的不同供應商提供這些合成設備。其它任何合成方法也都可以使用，寡核苷酸的實際合成方法恰好在本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。眾所周知，也可以使用類似的技術(shù)制備諸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物之類的其它寡核苷酸。還眾所周知的是，使用類似的方法和市售的改性單體(amidite )和定孔玻璃珠(CPG)產(chǎn)品，如生物素、熒光素、吖啶或補骨脂素改性單體，和/或CPG合成熒光標記的、生物素化的或其它修飾的寡核苷酸，例如膽固醇改性的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，修飾的應用(例如，用LNA單體來增強效力、特異性和作用時間及拓寬寡核苷酸的給藥途徑)由諸如Μ0Ε、AM、FANA, PS等的現(xiàn)有化學品構(gòu)成(參考=Uhlman編的反義寡核苷酸在醫(yī)療化學中的最新進展，Current Opinions in Drug Discovery&Development2000Vol3No2)o修飾可通過用LNA單體替換現(xiàn)有寡核苷酸中的一些單體來實現(xiàn)。LNA修飾的寡核苷酸的尺寸可與母體化合物類似或更大，或優(yōu)選地更小。優(yōu)選地，這些LNA修飾的寡核苷酸包含少于約70%，更優(yōu)選地少于約60%，最優(yōu)選地少于約50%的LNA單體，并且它們的尺寸為約10至25個核苷酸，更優(yōu)選地為約12-20個核苷酸。優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架，包括但不限于:硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基-烷基-磷酸三酯、甲基或其它烷基膦酸鹽(包括3’烯基膦酸鹽和手性膦酸鹽)、次膦酸鹽、氨基磷酸酯(包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨基-烷基-氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常的3’ -5’連接鍵的硼化磷酸酯，這些硼化磷酸酯的2’-5’連接的類似物，和具有反轉(zhuǎn)極性的那些骨架，其中，相鄰的幾對核苷單位連接方式為3’ -5’至5’ -3’或2’ -5’至5’ -2’。各種鹽、混合鹽和游離酸形式也包括在內(nèi)。教導了制備上述含磷鍵的代表性的美國專利，包括但不限于:美國專利:3，687，808 ;4，469，863 ;4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，196 ;5，188，897 ;5，264，423 ；5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ;5，399，676 ;5，405，939 ;5，453，496 ；5，455，233 ;5，466，677 ;5，476，925 ;5，519，126 ;5，536，821 ;5，541，306 ;5，550，111 ；5，563，253 ;5，571, 799 ;5，587，361和5，625，050，上述美國專利中的每一個通過引用并入本文。優(yōu)選的不包括磷原子的修飾的寡核苷酸骨架具有由如下方式形成的骨架:短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合，混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合，或一個或一個以上短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合。這些骨架包括具有嗎啉代鍵合(部分從核苷的糖部分中形成)的那些骨架；硅氧烷骨架、硫化物、亞砜和砜骨架；formaCetyl和硫代formacetyl骨架；亞甲基formacetyl和硫代formacetyl骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基聯(lián)氨基骨架；磺酸鹽和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其它含有混合的N、O、S和CH2基團的骨架。教導了制備上述寡核苷酸的方法的代表性的美國專利包括，但不限于:美國專利 5，034，506 ;5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235，033 ;5，264，562 ；5，264，564 ;5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ;5，541，307 ；5，561，225 ;5，596，086 ;5，602, 240 ;5，610, 289 ;5，602, 240 ;5，608, 046 ;5，610, 289 ；5，618，704 ;5，623，070 ;5，663，312 ;5，633，360 ;5，677，437 和 5，677，439，上述美國專利中的每一個通過引用 并入本文。在其它優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵合(S卩，骨架)被新的基團取代。保留堿基單元用于與適當?shù)暮怂崮繕嘶衔镫s交。表現(xiàn)出具有優(yōu)異的雜交性質(zhì)的一個這樣的寡聚化合物(寡核苷酸的模擬物)被稱作為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架取代，具體而言，是被氨基乙基甘氨酸骨架取代。核酸堿基被保留，并直接或間接連接至骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。教導了制備PNA化合物的方法的代表性的美國專利，包括但不限于:美國專利:5，539，082 ;5，714，331和5，719，262，該美國專利中的每一個通過引用并入本文。更進一步地，對PNA化合物的教導也可在Nielsen 等人的文章中(Science, 1991，254，1497-1500)找到。在一些本發(fā)明更優(yōu)選的實施方式中，含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和含雜原子骨架(特別是-CH2-NH-O-CH2-、被稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架的-CH2-N(CH3)-O-CH2-,-CH2ON(CH3) -CH2-、-CH2N(CH3) -N(CH3) CH2-和-ON(CH3) -CH2-CH2-)的寡核苷酸，其中天然的磷酸二酯骨架被表示為上述引用的美國專利5，489，677中的-O-P-O-CH2-,和上述引用的美國專利5，602，240中的酰胺骨架。還優(yōu)選地是具有上述引用的美國專利5，034，506中的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾的寡核苷酸還可以含有一個或一個以上取代的糖基團。優(yōu)選的寡核苷酸在2’位包括以下基團中的一個:0H、F、0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-鏈烯基；0-、S-或N-炔基；或O-烷基-ο-烷基，其中烷基、鏈烯基和炔基可以被或不被C-CO烷基或C2-CO烯基和炔基取代。特別優(yōu)選地為，0[(CH2)n0]mCH3、O(CH2)nOCH3^ O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3^ O(CH2)nONHjP0(CH2n0N[(CH2)nCH3)]2，其中η和m可以是I至約10。其它優(yōu)選的寡核苷酸在2’位包括以下基團中的一個:C-C0，(低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、0CN、氯、溴、CN、CF3、OCF3、SOCH3 > SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基團、報告基團、嵌入劑，用于改善寡核苷酸的藥代動力學性質(zhì)的基團，或用于改善寡核苷酸的藥效學特性的基團，和具有類似性質(zhì)的其它取代基。優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’ -O-CH2CH2OCH3,也稱為2’ -0-(2-甲氧基乙基)或 2，-MOE) (Martin 等人,Helv.Chim.Acta, 1995, 78, 486-504),即:燒氧基燒氧基基團。進一步優(yōu)選的修飾包括2’ - 二甲基氨基-氧-乙氧基，S卩，O(CH2)2ON(CH3)2基團，也被稱為2’-DMA0E，如以下本文實施例中所述，以及2’- 二甲基氨基-乙氧基-乙氧基(本領(lǐng)域也稱為2’ -O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’ -DMAEOE),即:2’ -O-CH2-O-CH2-N(CH2)2，下面本文的實施例中也有描述。其它優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基(2’ -OCH3)、2’ -氨基丙氧基(2’ -OCH2CH2CH2NH2^p2’-氟(2’-F)。寡核苷酸其它位置上也可以進行類似的修飾，特別是3’末端核苷酸或2’-5’連接的核苷酸中的糖的3’位上和5’末端核苷酸的5’位上。寡核苷酸也可含有糖模擬物，如環(huán)丁基代替呋喃戊糖基糖。教導了制備這些修飾的糖結(jié)構(gòu)的方法的代表性的美國專利包括但不限于:美國專利:4, 981，957 ;5，118，800 ;5，319，080 ;5，359，044 ;5，393，878 ；5，446，137 ;5，466，786 ;5，514，785 ;5，519，134 ;5，567，811 ;5，576，427 ;5，591，722 ；5，597，909 ;5，610，300 ;5，627，053 ;5，639，873 ;5，646，265 ;5，658，873 ;5，670，633 和5，700, 920，上述美國專利中的每一個通過弓I用并入本文。寡核苷酸可以還包括核堿基(通常稱為簡單地稱為“堿基”)修飾或替換。如本文所用，“未修飾”或“天然的”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核堿基包括其它合成或天然的核堿基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-巰基胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(偽尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫代、8-烷硫基、8-羥基、和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代(特別是5-溴代、5-三氟甲基)和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。此外，核堿基包括在美國專利3，687，808中公開的那些核堿基，以及在JohnWiley&Sons等人(The Concise Encyclopaedia of Polymer Science And Engineering.1990:858-859, Kroschwitz, J.1., ed), Englisch 等人(Angewandle Chemie, InternationalEdition.1991，30:613), Sanghvi,Y.S (Chapterl5,'Antisense Research andApplications’，pages289_302, Crooke, S.T.and Lebleu, B.ea., CRC Press, 1993)的文章 中所公開的那些核堿基。這些核堿基中的一些在增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力方面特別有用。這些核堿基包括5-取代嘧啶，6-氮雜腺嘌呤嘧啶和N-2、N-6取代的嘌呤和0-6取代嘌呤，所述N-2、N-6取代的嘌呤和0-6取代嘌呤包括2-氨丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已表現(xiàn)出使核酸雙鏈的穩(wěn)定性增加
0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.and Lebleu, B., eds, iAntisense Research andApplications’，CRC Press, Boca Raton, 1993，pp.276-278)并且 5-甲基胞嘧啶取代為目前優(yōu)選的堿基取代，甚至當其與2’ -O-甲氧基乙基糖修飾相結(jié)合時為更加優(yōu)選的。教導了制備上述修飾的核堿基及其它修飾的核堿基的方法的代表性美國專利包括但不限于:美國專利 3，687，808 ;4，845，205 ;5，130，302 ;5，134，066 ;5，175，273 ；5，367，066 ;5，432，272 ;5，457，187 ;5，459，255 ;5，484，908 ;5，502，177 ;5，525，711 ；5，552，540 ;5，587，469 ;5，596，091 ;5，614，617 ;5，750，692 和 5，681，941，上述美國專利中的每一個通過引用并入本文。本發(fā)明的寡核苷酸的另一修飾包括將一個或一個以上基團或偶合物化學連接至寡核苷酸，從而增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取。這樣基團包括但不限 于:脂質(zhì)基團(例如，膽固醇基團(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989, 86, 6553-6556)),膽酸(Manoharan 等人.，Bioorg.Med.Chem.Let., 1994, 4, 1053-1060),硫釀(例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sc1.，1992，660，306-309 ; Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Let., 1993, 3, 2765-2770)),硫代膽固醇(Oberhauser 等人，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，脂肪族鏈(例如，十二烷基二醇(dodecandiol)或十一燒基殘基(Kabanov 等人，F(xiàn)EBS Lett., 1990, 259, 327-330;Svinarchuk etal.，Biochimie, 1993，75，49-54))，磷脂(例如二-十六烷基-外消旋甘油或三乙基銨1，2- 二 -O-十六燒基-外消旋甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，TetrahedronLett.，1995，36，3651-3654; Shea 等人，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783))，聚胺或聚乙二醇鏈(Mancharan 等人,Nucleosides&Nucleotides, 1995, 14, 969-973),或金剛燒乙酸(Manoharan 等人，Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654),掠櫚基基團(Mishra 等人，Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1264, 229-237),或十八胺或己基氨基-羰基-叔氧膽固酉享基團(Crooke 等人,J.Pharmacol.Exp.Ther., 1996, 277, 923-937)。教導了制備這些寡核苷酸偶合物的方法的代表性的美國專利，包括但不限于:美國專利:4, 828，979 ;4，948，882 ;5，218，105 ;5，525，465 ;5，541，313 ;5，545，730 ；5，552，538 ;5，578, 717 ;5，580, 731 ;5，580, 731 ;5，591，584 ;5，109, 124 ;5，118，802 ；5，138，045 ;5，414，077 ;5，486，603 ;5，512，439 ;5，578，718 ;5，608，046 ;4，587，044 ；4，605，735 ;4，667，025 ;4，762，779 ;4，789，737 ;4，824，941 ;4，835，263 ;4，876，335 ；4，904，582 ;4，958，013 ;5，082，830 ;5，112，963 ;5，214，136 ;5，082，830 ;5，112，963 ；5，214，136 ;5，245，022 ;5，254，469 ;5，258，506 ;5，262，536 ;5，272，250 ;5，292，873 ；5，317，098 ;5，371，241 ;5，391，723 ;5，416，203 ;5，451，463 ;5，510，475 ;5，512，667 ；5，514，785 ;5，565，552 ;5，567，810 ;5，574，142 ;5，585，481 ;5，587，371 ;5，595，726 ；5，597，696 ;5，599，923 ;5，599，928和5，688，941，上述美國專利中的每一個通過引用并入本文。sliRNA 的序列在一些實施方式中，核苷酸序列與本文提供的病毒基因組高度保守區(qū)的片段具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性。在一些實施方式中，高度保守區(qū)序列位于序列SEQ ID NO:1的241-263位。I1.小配體RNA的設計方法另一方面，本發(fā)明提供了一種設計sliRNA的方法，所述方法包括選擇病毒基因組序列的高度保守區(qū)，測試RNA調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)(例如，Toll樣受體3 (TLR3))的活性的能力，所述RNA包含與所述高度保守區(qū)的片段具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的核苷酸序列?？稍诒景l(fā)明中使用的病毒序列可以是本領(lǐng)域中熟知的任何病毒。適合的病毒包括但不限于:單鏈RNA (ssRNA)病毒、雙鏈RNA (dsRNA)病毒。在一些實施方式中，病毒是dsRNA病毒,包括但不限于:傳染性胰腺壞死病毒、傳染性腔上囊病病毒、維多利蠕孢菌病毒、囊狀病毒、減毒病毒屬、分病毒、α潛隱病毒屬、β潛隱病毒屬、輪狀病毒屬等。在一些實施方式中,病毒是ssRNA病毒,包括但不限于:冠狀病毒屬、SARS、頭甲病毒、虱P病毒、Plautia stali腸病毒、蚜蟲病毒、琉璃葉蟬病毒I (HoCV-1)、家蟋病毒、海洋RNA病毒屬、腸道病毒屬、鼻病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、感冒病毒、甲型肝炎病毒、腦心肌炎病毒、副腸孤病毒、馬乙型鼻病毒、塞內(nèi)卡谷病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、櫻桃銼葉病毒、溫州蜜柑矮縮病毒、Sequi病毒屬、托拉多病毒、矮化病毒屬、線蟲傳多面體病毒、黑懸鉤子壞死病毒、諾瓦克病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、丙型肝炎病毒、登革熱病毒、β四病毒屬、ω四病毒屬、風疹病毒、羅斯河病毒、辛德畢斯(Sindbis)病毒、切昆貢亞病毒、戊型肝炎病毒、皰疹病毒、埃波拉病毒、馬爾堡病毒、麻疫病毒、腿腺炎病毒、尼帕(Nipah)病毒、Hendra病毒、狂犬病病毒、伊派病毒、拉沙病毒、Lujo病毒、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、Mobala病毒、Mopeia病毒、Amapari病毒、查帕雷病 毒、Flexal病毒、Guanarito病毒、胡寧病毒、拉丁美洲病毒、Machjupo病毒、花漾病毒、Parana病毒、伯欽特病毒、Pirital病毒、Sabia病毒、塔卡里伯病毒、它米阿米病毒、白水阿羅約病毒、漢坦病毒、Dugbe病毒、布尼奧羅病毒、立夫特山谷熱病毒、流感病毒、鮭傳貧病毒、索戈托病毒屬、丁型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等。在選擇病毒之后，從不同數(shù)據(jù)庫(如GenBank)中獲得不同種屬和/毒株的病毒基因組序列，或者對所述病毒基因組序列重新測序。優(yōu)選地，不同種屬和/毒株的病毒來源于人類或接近于人的靈長類，如猴子、狐猴、黑猩猩等。然后，用本領(lǐng)域熟知軟件(如GCG package)將不同種屬和/毒株的病毒基因組序列進行比對以識別高度保守區(qū)。這里的“高度保守區(qū)”是指序列的一個區(qū)段，或延伸部分，其在不同種屬和/毒株的病毒之間是保守的。優(yōu)選地，區(qū)段的同源性為75%至100%，優(yōu)選地為 90% 至 100%ο在確定高度保守區(qū)之后，將高度保守區(qū)的片段的序列用于設計本發(fā)明的sliRNA。在一些實施方式中，高度保守區(qū)位于病毒基因組的選自5’非翻譯區(qū)(UTR)、3’UTR和開放閱讀框(ORF)的區(qū)域。sliRNA具有本文所描述的結(jié)構(gòu)、序列和化學組成(如，修飾)。在一些實施方式中，sliRNA的長度為約14至約25bp，優(yōu)選地為約17至約23bp(如17、18、19、20、21、22、23、24、25)，優(yōu)選地，GC 含量為約 30%_60%，，更優(yōu)選地為約 35%、40%、45%、50% 或 55%。
優(yōu)選地，sliRNA與人類基因，特別是人類的功能性基因沒有同源性。一般地，sliRNA與人類基因沒有同源性，或同源性少于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、95%或95%。在一些實施方式中，sliRNA包含雙鏈RNA，該雙鏈RNA可以是平末端或帶有3’或5’懸垂部分。在一些實施方式中，sliRNA的長度為14 25核苷酸。在一些實施方式中，sIiRNA具有連接至RNA: RNA雙鏈的5’和/或3’端的1、2、3、4或5個DNA堿基。在一些實施方式中，DNA堿基連接至3’端，優(yōu)選地，形成平末端。設計的sliRNA用本文提供的或本領(lǐng)域熟知的方法合成。用本文提供的或本領(lǐng)域熟知的體外實驗、體內(nèi)實驗或動物模型測試合成的sliRNA調(diào)節(jié)TLR (如TLR3)的能力。在一些實施方式中， 通過測試TLR3、IL12、NF-K B或其它生物標記物的表達水平CmRNA和/或蛋白)來評價sliRNA調(diào)節(jié)TLR3的能力。在一些實施方式中，用本發(fā)明提供的大鼠主動脈環(huán)測試或NF-κ B活性測試來檢測 sliRNA。在一些實施方式中，用本發(fā)明提供的小鼠CNV模型來檢測sliRNA。一般地，設計并合成一批sliRNA，優(yōu)選地，所述sliRNA包括所有可能的已知病毒基因組的sliRNA。在一些實施方式中，設計具有一個或一個以上涵蓋整個病毒基因組高度保守區(qū)的重置喊基的一系列sliRNA。在確定一個或一個以上主要sliRNA后，可以進一步通過調(diào)整序列、結(jié)構(gòu)、修飾等對所述主要sliRNA進行優(yōu)化，從而獲得預期的特征，諸如DM和PK。sliRNA的特征包括但不限于:穩(wěn)定性、功效和毒性。sliRNA可以優(yōu)化成與本文提供的或本領(lǐng)域熟知的遞送系統(tǒng)相偶聯(lián)。II1.處理方法另一方面，本發(fā)明提供一種治療病理性血管生成相關(guān)疾病的方法，所述方法包括將本文提供的藥學有效量的sliRNA給藥于需要這種治療的受治者。在一些實施方式中，這些疾病選自:眼新生血管疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、老年性黃斑變性(AMD)、葡萄膜炎、實質(zhì)層角膜炎(SK)及癌癥。本文所述的術(shù)語“受治者”或“個體”是指患有疾病等的個體，所述個體包括哺乳動物和非哺乳動物。哺乳動物例子包括但不限于:哺乳動物種類中的任一成員:人類、非人類的靈長類(如黑猩猩)和其它猿類及猴類；耕作動物(如牛、馬、綿羊、山羊、豬);家養(yǎng)動物(如兔、狗和貓)；包括嚙齒類在內(nèi)的實驗動物(如大鼠、小鼠和豚鼠)，及其它。非哺乳動物的例子包括但不限于:鳥類、魚類及其它。在本文中所提供的方法和組合物的一些實施方式中，哺乳動物是人類。IV.藥物組成及遞送在又一個方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括本文所提供的sliRNA,以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明提供了用于治療病理性血管生成相關(guān)疾病的sliRNA分子制劑。依照相應疾病的給藥方式，藥物的相關(guān)劑型發(fā)生改變，并且所述藥物的相關(guān)劑型對于保持sliRNA分子的活性而言是適當?shù)?。例如，對于與合適遞送系統(tǒng)配套的可注射藥物而言，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型可以含有任何藥學上可接受的佐劑，只要合適的遞送系統(tǒng)對于保持sliRNA分子的活性而言是合適的且適當?shù)摹＠?，在眼科藥物臨床應用上，本發(fā)明的sliRNA可以溶解在無RNA酶的無菌水中。sliRNA濃度被調(diào)整到Iyg/μ L。輕輕混合后進行玻璃體內(nèi)注射。每兩個星期注射一次，4周為一個療程。在另一個優(yōu)選的實施方式中，對病人的治療包括與其它療法聯(lián)合給予一種或一種以上RNA化合物，所述其它療法，例如，化療、放療、手術(shù)、抗炎劑等。其它藥劑可以在給藥RNA化合物之前、之后給藥或與RNA化合物聯(lián)合給藥。本發(fā)明的RNA化合物包括任何藥學上可接受的鹽、酯或這類酯的鹽，或任何其它化合物，所述任何藥學上可接受的鹽、酯或這類酯的鹽，或任何其它化合物在將其給藥于包括人類在內(nèi)的動物之后能夠提供(直接或間接)其具有生物活性的代謝物或殘余物。因此，例如，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物的前藥和藥學上可接受的鹽、這些前藥的藥學上可接受的鹽和其它生物等同物。術(shù)語“前藥”是指一種治療制劑，其被制備成可在體內(nèi)或細胞內(nèi)通過內(nèi)源性酶或其它化學成分和/或條件的作用轉(zhuǎn)化為活性形式(即，藥物)的無活性形式。術(shù)語“藥學上可接受的鹽”是指本發(fā)明的化合物的生理上和藥學上可接受的鹽，SP保留期望的母體化合物的生物活性而不帶來不需要的毒性作用的鹽。藥學上可接受的堿加成鹽通過諸如堿金屬和堿土金屬或有機胺之類的金屬或胺形成。用作陽離子的金屬包括鈉、鉀、鎂、鈣及類似物。胺包括N，N’- 二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、 二環(huán)己基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普魯卡因(見如Berge等人，Pharmaceutical Salts.J.Pharma Sc1.，1977，66，119)。所述酸性化合物的堿加成鹽通過以常規(guī)方式使足以生成鹽的量的期望的堿與游離酸形式接觸來制備。游離酸的形式可以通過以常規(guī)方式使酸與鹽形式接觸并且分離游離酸再生。游離酸形式與它們各自的鹽在諸如極性溶劑中的溶解度之類的某些物理性質(zhì)方面稍有不同，但除此之外，就本發(fā)明的目的而言，鹽等同于它們各自的游離酸。如本文所用，“藥品加成鹽”包括本發(fā)明的組合物的組分中的一種的酸形式的藥學上可接受的鹽。這些鹽包括胺的有機酸鹽或胺的無機酸鹽。優(yōu)選的酸式鹽是鹽酸鹽、乙酸鹽、水楊酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽。其它合適藥學上可接受的鹽是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且包括多種無機酸和有機酸的堿式鹽，所述無機酸例如，鹽酸、氫溴酸、硫酸或磷酸，所述有機酸例如，有機羧酸、有機磺酸、有機硫酸、有機磷酸或N-取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、馬來酸、羥基馬來酸、甲基馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、撲酸、煙酸或異煙酸、以及氨基酸，如合成天然蛋白質(zhì)所涉及的20種α -氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，所述有機酸還例如苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙烷-1，2- 二磺酸、苯磺酸、4-甲苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5- 二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、N-環(huán)己基氨基磺酸(伴隨環(huán)己基氨基磺酸酯形成)，或其它酸性有機化合物，如抗壞血酸。也可以通過藥學上可接受的陽離子制備化合物的藥學上可接受的鹽。合適的藥學上可接受的陽離子是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知并且包括堿金屬、堿土金屬、銨和季銨陽離子。碳酸鹽或碳酸氫鹽也是可能的。對于寡核苷酸而言，優(yōu)選的藥學上可接受的鹽的實例包括但不限于:(I)與陽離子形成的鹽，所述陽離子如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、聚酰胺(如精胺和亞精胺)等；(II)與無機酸形成的酸加成鹽，所述無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；(III)與有機酸形成的鹽，所述有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等jp(iv)與元素的陰離子形成的鹽，所述陰離子如氯、溴和碘。本發(fā)明的RNA化合物可用于診斷、治療、預防并且可用作研究試劑和試劑盒。對于治療而言，懷疑患有疾病或失調(diào)的動物，優(yōu)選地為人類通過給藥本發(fā)明的RNA化合物來治療，所述動物，優(yōu)選地為人類可通過調(diào)節(jié)靶基因的表達來進行治療。本發(fā)明化合物可以通過將有效量的sliRNA化合物加至合適的藥學上可接受的稀釋劑或載體中用于藥物組合物中。本發(fā)明的RNA化合物和方法的應用也可以用于疾病預防方面。本發(fā)明還包括藥物組合物和劑型，所述藥物組合物和劑型包括本發(fā)明的RNA化合物。本發(fā)明的藥物組合物可通過多種方式給藥，所述多種方式取決于期望局部治療還是全身治療以及待治療的區(qū)域。給藥可以是局部給藥(包括眼部給藥和粘膜給藥(包括陰道及直腸遞送))，肺部給藥(如通過吸入(包括由霧化器吸入)粉末或氣溶膠)，氣管內(nèi)給藥，鼻內(nèi)給藥，表皮和經(jīng)皮給藥，口服給藥或胃腸外給藥。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于:溶液、乳液和含脂質(zhì)體的劑型。這些組合物可由多種成分形成，所述多種成分包括但不限于:預先形成的液體、自乳化固體和自乳化半固體。本發(fā)明的藥物組合物包括用量為0.5mg-3mg/眼的sliRNA。本發(fā)明的藥物組合物每月(約28天)給藥一次。本發(fā)明的某些組合物還在劑型中摻入載體化合物。如本發(fā)明所用，“載體化合物”或“載體”是指核酸或類似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但其通過體內(nèi)過程被識別為核酸，所述體內(nèi)過程通過例如降解生物活性的核酸或促進其從循環(huán)中去除降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和載體化合物的聯(lián)合給藥(通常后者的物質(zhì)是過量的)可導致從肝臟、腎臟或其它額外循環(huán)儲存庫中回收的核酸的量大幅減少，這大概是由于載體化合物和核酸競爭一個共同的受體。例如，當其與聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、polycytidic酸或4-乙酰氨基-4’異硫氰基-均二苯乙烯_2，2’雙磺酸聯(lián)合給藥時(Miyao等人，Antisense Res.Dev., 1995, 5, 115-121 ；Takakura 等人，Antisense&Nucl.Acid DrugDev.，1996，6，177-183)，可以降低部分硫代磷酸酯寡核苷酸在肝組織中的回收。本發(fā)明的某些實施方式提供藥物組合物，所述藥物組合物含有一種或一種以上RNA化合物和一種或一種以上通過非TLR相關(guān)機制起作用的其它化療劑。這些化療劑的實例包括但不限于:抗癌藥，如放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MIX)、秋水仙堿、長春新堿、長春堿、鬼臼乙叉式、替尼泊式、順鉬和己烯雌酹(DES)(見The Merck Manual of Diagnosisand Therapy, 15th Ed., Berkow 等人,eds., 1987, Rahway, N.J., pagesl206_1228)。 還可將抗炎藥和抗病毒藥物與本發(fā)明的組合物聯(lián)合，所述抗炎藥包括但不限于:非甾體抗炎藥物和皮質(zhì)類固醇，所述抗病毒藥物包括但不限于利:巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋、更昔洛韋。(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed.，Berkow 等人,eds., 1987, Rahway, N.J., pages2499-2506and46_49，respectively)。其它非反義化療劑也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩個或更多聯(lián)合的組合物可以一起或依次使用。在另一個相關(guān)的實施方式中，本發(fā)明的組合物中可包含一種或一種以上RNA化合物，特別是具有不同序列的sliRNA。兩個或更多聯(lián)合的化合物可以一起或依次使用。核酸遞送系統(tǒng)優(yōu)選的本發(fā)明的實施方式包括通過合適的核酸遞送系統(tǒng)給藥上述RNA寡核苷酸中的至少一種，如在美國專利申請公開20090247604中所公開的，其公開的內(nèi)容通過引用并入本文。在一種實施方式中，該系統(tǒng)包括可操作地連接至多核苷酸的非病毒載體。這樣的非病毒載體的實例包括單獨的寡核苷酸或與合適的蛋白質(zhì)、多糖或脂質(zhì)制劑結(jié)合的寡核苷酸。此外，合適的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，通常包括來自腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、輔助病毒依賴型腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或日本-脂質(zhì)體(HVJ)復合物中的hemagglutinatin病毒中的至少一種的序列。優(yōu)選地,所述病毒載體包括可操作地連接至多核苷酸的強真核啟動子，例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子。此外，優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學偶合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼氏鼠白血病病毒 和基于艾滋病毒的病毒。一種優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體，其中，gag和pol基因來自于HIV基因組，env基因來自于另一病毒。DNA病毒載體是優(yōu)選的。這些載體包括痘載體(如正痘(orthopox)或禽痘(avipox)載體),皰疫病毒載體(如單純皰疫病毒(HSV)載體)(Geller, A.1 等人，J.Neurochem, 64:487 (1995) ；Lim, F等人，in DNA Cloning:Mammalian Systems, D.Glover, Ed.(Oxford Univ.Press, OxfordEngland) (1995) ；Geller, A.1 等人，Proc Natl.Acad.Sc1.:U.S.A.:907603(1993)；Geller, A.1 等人，Proc Natl.Acad.Sci USA:87:1149(1990))，腺病毒載體(LeGalLaSalle 等人，Science, 259:988(1993) ; Davidson 等人，Nat.Genet.3:219 (1993) ; Yang等人，J.Virol.69:2004(1995))和腺相關(guān)病毒載體(Kaplitt，M.G 等人，Nat.Genet.8:148(1994))。痘病毒載體將基因?qū)氲郊毎|(zhì)中。禽痘病毒載體只能介導核酸短期表達。腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和單純皰疹病毒(HSV)載體可為一些發(fā)明的實施方式中的現(xiàn)象。相對于腺相關(guān)病毒，腺病毒載體介導更短期(例如，約小于一個月)的表達，在一些實施方式中，腺病毒載體可顯示出表達期長得多。選擇的特定載體取決于靶細胞和處理條件。選擇適當?shù)膯幼涌梢院苋菀椎赝瓿?。?yōu)選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用高表達啟動子。合適的啟動子的例子為763個堿基對的巨細胞病毒(CMV)啟動子。Rous肉瘤病毒(RSV) (Davis等人，Hum Gene Ther4:151 (1993))和MMT啟動子也可以使用。用天然的啟動子可以表達某些蛋白質(zhì)。還可以包含可增強表達的其它元件，如增強子，或可提高表達水平的系統(tǒng)，如tat基因和tar元件。這些表達盒隨后可以插入到載體中，如質(zhì)粒載體(如pUC19、pUC118、pBR322),或包括如大腸桿菌的復制起點其它已知的質(zhì)粒載體(Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratorypress, (1989))。啟動子在下文討論。質(zhì)粒載體還可以包括選擇標記，如氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因，條件是標記多肽對處理的生物體的代謝不產(chǎn)生不利影響。在合成的遞送系統(tǒng)中，表達盒也可以結(jié)合到核酸結(jié)合部分，如PCT專利W095/22618中所公開的系統(tǒng)。如果需要的話，本發(fā)明的多核苷酸也可以與微小遞送載體一同使用，所述微小遞送載體例如陽離子脂質(zhì)體和腺病毒載體。對于脂質(zhì)體制備步驟，靶向和遞送目標物而言，可參見 Mannino and Gould-Fogerite, Bio Techniques, 6:682 (1988)。還可參見 Feignerand Holm,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):21 (1989)和Maurer,R.A.，Bethesda Res.Lab.Focus,11 (2):25(1989)。復制缺陷型重組腺病毒載體可以根據(jù)已知的技術(shù)制備(Quantin等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:2581-2584(1992) ；Stratford-Perricadet 等人，J.Clin.1nvest.，90:626-630(1992) ;Rosenfeld 等人，Cell, 68:143-155(1992))。

另一種優(yōu)選的反義寡核苷酸遞送方法是使用可產(chǎn)生胞內(nèi)反義寡核苷酸的單鏈DNA制造載體。參見例如Chen et al, Bio Techniques, 34:167-171 (2003)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。核酸的有效劑量為特定表達蛋白，待靶定的特定的心律失常、病人和他或她的臨床狀況、體重、年齡、性別等的函數(shù)。一個優(yōu)選的遞送系統(tǒng)是其中摻入了多聚核苷酸中的一種或一種以上(優(yōu)選地約一個多核苷酸)的重組病毒載體。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的病毒載體的PfU (斑形成單位)為約IO8至約sxio'fu。在將多核苷酸與非病毒載體聯(lián)合給藥的實施方式中，常用的有效劑量為約0.1ng至約4000 μ g，例如，約Ing至約100 μ g。本發(fā)明的實施方式還涉及用于表達RNA寡核苷酸的表達載體構(gòu)建體，所述RNA寡核苷酸含雜合啟動子基因序列并具有強組成型啟動子活性或在期望的情況下可被誘導的啟動子活性。在整個申請中，術(shù)語“表達構(gòu)建體”是指包括任何類型的遺傳構(gòu)建體，其含有用于編碼基因產(chǎn)物的核酸，在所述構(gòu)建體中，部分或全部核酸編碼序列能被轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄本可以翻譯成蛋白質(zhì)，但它不需要。在某些實施方式中，表達包括基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯成基因產(chǎn)物。在其它實施方式中，表達僅包括轉(zhuǎn)錄編碼目標基因的核酸。編碼基因產(chǎn)物的核酸是在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下?！皢幼印笔侵副患毎暮铣蓹C制識別的或引入的合成機制識別的DNA序列，需要所述DNA序列啟動基因的特異性轉(zhuǎn)錄。短語“轉(zhuǎn)錄控制下”是指該啟動子位于和核酸有關(guān)的正確位置和方向以控制RNA聚合酶啟動和基因表達。本文所述的術(shù)語“啟動子”是指聚集在聚合酶起始位點周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制模塊。反復考慮的是如何識別來源于多種病毒啟動子分析的啟動子，所述多種病毒啟動子包括用于HSV胸苷激酶(TK)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單元的那些啟動子。啟動子由不連續(xù)的功能模塊構(gòu)成，每個模塊由約7bp至20bp的DNA組成，并含有用于轉(zhuǎn)錄激活子或阻遏子蛋白的一個或一個以上識別位點。每個啟動子中的至少一個模塊起到定位RNA合成的起始位點的作用。所述模塊的最好的已知實例為TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的啟動子中，如哺乳動物的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子和SV40晚期基因啟動子中，覆蓋起始位點的不連續(xù)的元件自身有助于固定起始位點。額外的啟動子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始位點的頻率。典型地，雖然最近許多啟動子顯示出在起始位點的下游也含有功能元件，但是這些額外的啟動子元件位于該區(qū)域起始位點上游的30bp至IlObp區(qū)域。在啟動子元件之間的間距通常是可變的，這樣當元件相對彼此反向或移動時，啟動子功能被保護。在tk啟動子上,在活性開始減退之前,啟動子元件之間的間距可以提高到相距50bp。依賴于啟動子，單個元件看上去可協(xié)同作用或獨立作用從而激活轉(zhuǎn)錄。用于控制目標核酸序列的表達的特定啟動子被認為是不重要的，只要它能夠指導靶細胞中的核酸表達。因此，當靶定人體細胞時，優(yōu)選的是將核酸編碼區(qū)域放置于能在人體細胞中表達的啟動子附近并在其控制下。一般來說，這樣的啟動子可包括人類啟動子或病毒啟動子。在不同實施方式中，可以用人類巨細胞病毒(CMV)即早基因啟動子、SV40早期啟動子、勞氏肉瘤病毒長末端重復序列、β-肌動蛋白、大鼠胰島素啟動子和3-磷酸甘油醛脫氫酶，以獲得目標編碼序列的高水平表達。也可考慮用本領(lǐng)域熟知的其它病毒或哺乳動物細胞或細菌噬菌體啟動子來實現(xiàn)目標編碼序列的表達，條件是表達水平滿足預期目標。通過使用具有已知屬性的啟動子，可以優(yōu)化轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后目標蛋白的表達水平和模式。

對響應特定生理信號或合成信號而被調(diào)節(jié)的啟動子的選擇可以誘導基因產(chǎn)物的表達。例如，在轉(zhuǎn)基因表達或利用多順反子載體進行的轉(zhuǎn)基因表達對細胞(在該細胞中產(chǎn)生載體)產(chǎn)生毒性的情況下，理想的是禁止或減少轉(zhuǎn)基因中的一個或一個以上轉(zhuǎn)基因的表達?？蓪ιa(chǎn)細胞系產(chǎn)生毒性的轉(zhuǎn)基因?qū)嵗秊榇俚蛲龌蚝图毎蜃踊颉Ｔ谵D(zhuǎn)基因產(chǎn)物可能是有毒性的情況下，幾種誘導型啟動子系統(tǒng)可用于病毒載體生產(chǎn)。蛻皮激素系統(tǒng)(InvitiOgen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)就是一個這樣的系統(tǒng)。該系統(tǒng)被設計為允許調(diào)節(jié)哺乳動物細胞中的目標基因的表達。該系統(tǒng)由嚴格的調(diào)控表達機制構(gòu)成，該表達機制實際上不允許基礎水平的轉(zhuǎn)基因表達，但具有200倍以上的誘導性。該系統(tǒng)基于果蠅的異源二聚體蛻皮激素受體，當蛻皮激素或諸如幕黎留酮A之類的模擬物與受體結(jié)合時，該受體激活啟動子以開啟下游轉(zhuǎn)基因的表達，從而獲得高水平的mRNA轉(zhuǎn)錄本。在這個系統(tǒng)中，異源二聚體受體的兩種單體通過一個載體進行組成型表達，而驅(qū)動目標基因表達的蛻皮激素響應啟動子位于另一個質(zhì)粒上。因此，將該類系統(tǒng)構(gòu)建到目標基因轉(zhuǎn)移載體中是有用的。含目標基因的質(zhì)粒和含有受體單體的質(zhì)粒在生產(chǎn)細胞系中的共轉(zhuǎn)染可以產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)移載體而不產(chǎn)生潛在毒性轉(zhuǎn)基因的表達。在適當時間，轉(zhuǎn)基因的表達可以被蛻皮激素或幕黎留酮A激活。另一種有用的可誘導系統(tǒng)是Tet-Off 或Tet-Οη 系統(tǒng)(Clontech公司，帕羅奧圖，加州)。該系統(tǒng)也允許待響應諸如多西環(huán)素之類的四環(huán)素或四環(huán)素衍生物而被調(diào)節(jié)的基因高水平表達。在Tet-On 系統(tǒng)中，基因表達在多西環(huán)素存在的條件下被啟動，而在Tet-Off 系統(tǒng)中，基因表達在無多西環(huán)素的情況下啟動。這些系統(tǒng)基于兩個來自大腸桿菌的四環(huán)素抗性操縱子的調(diào)控元件。四環(huán)素阻遏結(jié)合的四環(huán)素操縱子序列和四環(huán)素阻遏蛋白。目標基因被克隆到質(zhì)粒中，在所述質(zhì)粒中，目標基因位于具有四環(huán)素響應元件的啟動子之后。第二質(zhì)粒含有稱為四環(huán)素控制的反式作用子的調(diào)節(jié)元件，在Tet-Off 系統(tǒng)中所述調(diào)節(jié)元件由源于皰疹單純病毒和野生型四環(huán)素阻遏子的VP16區(qū)域構(gòu)成。因此，在無多西環(huán)素時，轉(zhuǎn)錄是以組成型方式啟動的。在Tet-On 系統(tǒng)中，四環(huán)素阻遏子不是野生型的且在存在多西環(huán)素的條件下激活轉(zhuǎn)錄。對于基因治療載體的生產(chǎn)而言，Tet-Off 系統(tǒng)將是優(yōu)選的，這樣，生產(chǎn)細胞可以在四環(huán)素或多西環(huán)素存在下生長，并阻止?jié)撛诙拘赞D(zhuǎn)基因的表達，但當載體被導入到患者身體中時，基因表達以組成型方式啟動。在一些情況下，理想的是調(diào)節(jié)基因治療載體中的轉(zhuǎn)基因表達。例如，取決于期望的表達水平，可使用具有不同活性強度的不同病毒啟動子。在哺乳動物細胞中，CMV即早期啟動子經(jīng)常用于提供強轉(zhuǎn)錄激活。當期望降低轉(zhuǎn)基因的表達水平時，還可使用效力較低的CMV啟動子的修飾版本。當希望在造血細胞中表達轉(zhuǎn)基因時，逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子，如源于MLV或MMTV的LTR被經(jīng)常使用。取決于所期望的效果可使用的其它病毒啟動子包括SV40、RSVLTR、HIV-1和HIV-2LTR，如源于E1A、E2A或MLP區(qū)域、AAV LTR、花椰菜花葉病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒的腺病毒啟動子。在一個優(yōu)選的實施方式中，組織特異性啟動子用于影響特定組織或細胞中的轉(zhuǎn)錄，從而減少對非靶組織的潛在毒性或不良影響。例如，可將諸如PSA、前列腺堿性蛋白、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特異性腺激肽釋放酶(hK2)之類的啟動子用于前列腺中的靶基因表達。 IRES:在本發(fā)明的某些實施方式中，內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)元件用于產(chǎn)生多基因或多順反子、信使。IRES元件能夠繞過依賴5’甲基化帽的翻譯的核糖體掃描模型，并在內(nèi)部位點開始翻譯。已描述了來源于小核糖核酸病毒家族(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎)中的兩名成員的IRES元件，以及來源于哺乳動物信使的IRES。IRES元件可被連接到異源開放閱讀框中。多個開放閱讀框可以被一同轉(zhuǎn)錄，分別由IRES分離，建立多順反子信使。憑借IRES元件，每一個開放閱讀框易接近核糖體，進行有效的翻譯。多個基因可通過使用單個啟動子/增強子轉(zhuǎn)錄單個信使而被高效表達。任何異源開放閱讀框可以被連接到IRES元件上。這包括由獨立的基因編碼的分泌蛋白基因、多亞單位蛋白基因，細胞內(nèi)或膜結(jié)合蛋白基因和可選擇的標記物基因。用這種方法，可通過單一構(gòu)建體和單一選擇性標記物將若干蛋白的表達同時構(gòu)建到細胞中。試劑盒在另一個方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括一種或一種以上本文所提供的RNA寡核苷酸。這些寡核苷酸可以包括一個或一個以上修飾的核酸堿基，更短或更長的片段，修飾后的鍵和類似物。在另一方面，本發(fā)明提供靶向細胞的核酸序列和分子的試劑盒，所述細胞的核酸序列和分子與在治療諸如感染性疾病生物體、AMD、血管生成相關(guān)疾病、癌癥、自身免疫疾病等的疾病中調(diào)節(jié)免疫反應有關(guān)。在一種實施方式中，一種試劑盒包括:(a)本文提供的RNA，和(b)將治療有效量的RNA寡核苷酸給藥于細胞或個體的說明書。在一些實施方式中，該試劑盒可以包含用于給藥RNA寡核苷酸的藥學上可接受的鹽或溶液。任選地，試劑盒可進一步包括標簽形式的或單獨插頁形式的的合適操作參數(shù)的說明。例如，試劑盒可具有告知醫(yī)生或?qū)嶒炇壹夹g(shù)人員制備一定劑量RNA寡核苷酸的標準說明。任選地，該試劑盒可以進一步包含一個標準品或?qū)φ招畔?，以便病人樣本可以與對照信息標準比較來確定RNA寡核苷酸的測試量是否為符合例如腫瘤縮小的治療量。本發(fā)明的實施方式可在沒有理論研究支持的條件下實施。此外，在理論研究存在的條件下，可理解的是申請人不受已有理論的約束。實施例應當理解的是，下面的實施例僅用于闡明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。需要說明的是，如果不指定，以下實施例中的百分比都是重量百分比含量wt%。實施例1為了開發(fā)可通過激活TLR3抑制CNV的基于sliRNA的眼藥，我們選擇腸道病毒作為sliRNA的設計模板。腸道病毒是一組直徑為20nm至30nm的ssRNA病毒。在血清型分類上，它們有67種。我們選擇了病毒的高度保守的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)作為模板來設計靶RNA。我們也選擇ORF和3’ UTR的高度變異序列作為模板設計對照RNA。分別將基于以上設計的化學合成的小RNA玻璃體內(nèi)注射到小鼠CNV模型的眼中。結(jié)果顯示來源于高度保守的RNA序列(5’ UTR)的CNV抑制效率明顯高于那些通過位于ORF和3’ UTR中的高度變異區(qū)序列設計的RNA。我們也發(fā)現(xiàn)在眼組織樣品中，與兩個RNA對照組相比，基于高度保守的RNA序列的CNV的抑制上調(diào)了 TLR3和它的信號通路蛋白-1L12 (白介素12)的mRNA水平并下調(diào)了 VEGF mRNA水平。這些數(shù)據(jù)證實病毒基因組中高度保守區(qū)序列可以用作設計TLR3RNA配體(小配體RNA, sliRNA)的模板。通過有效和序列依賴性激活TLR3通路，sliRNA可以潛在用于治療AMD的CNV和其它病理性血管生成相關(guān)疾病，諸如糖尿病視網(wǎng)膜病變、癌癥等。我們首先發(fā)現(xiàn)作為有效激活TLR3配體的RNA靶模板序列位于腸道病毒(包含67種小RNA病毒)的高度保守5’ UTR區(qū)。序列(SEQ ID NO:1)如下:I ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggctagtactccggt61 accccggtac ccttgtacgc ctgttttata ctccctttcc caagtaactttagaagaaat121 aaactaatgt tcaacaggag ggggtacaaa ccagtaccac cacgaacacacacttctgtt181 tccccggtga agttgcatag actgtaccca cggttgaaag cgatgaatccgttacccgct241 taggtacttc gagaagccta gtatcatctt ggaatcttcg atgcgttgcgatcagcactc301 taccccgagt gtagcttggg tcgatgagtc tggacacccc acaccggcgacggtggtcca361 ggctgcgttg gcggcctacc catggctagc accatgggac gctagttgtgaacaaggtgc421 gaagagccta ttgagctacc tgagagtcct ccggcccctg aatgcggctaatcccaacca481 cggagcaaat gctcacaatc cagtgagtgg tttgtcgtaa tgcgcaagtctgtggcggaa541 ccgactactt tgggcgtccg tgtttccttt tatttttatt atggctgcttatggtgacaa601 tctgagattg ttatcatata gctattggat tagccatccg gtga (SEQ ID NO:1).
經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫中RNA病毒基因組比對，我們發(fā)現(xiàn)RNA病毒基因組的5’UTR是高度保守的(圖17a)。并且5’UTR聞度保守區(qū)與脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒和腸道病毒68-71、微小RNA病毒具有同源性。我們用5’UTR高度保守區(qū)作為模板設計激活TLR3的sliRNA。隨機設計的sliRNA與四種、兩種或一種病毒同源，與四種病毒同源的sliRNA與人類編碼基因不同源。表1:隨機設計sliRNA的基因庫比對
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)的sliRNA，所述sliRNA包含與病毒基因組序列的高度保守區(qū)片段具有至少90%同源性的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的sliRNA，其中，所述的核苷酸序列與所述高度保守區(qū)的片段具有至少95%的同源性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的sliRNA，其中，所述核苷酸序列與所述高度保守區(qū)片段具有100%同源性。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的sliRNA，其中，所述Toll樣受體是Toll樣受體3(TLR3)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的sliRNA，其中，所述高度保守區(qū)位于病毒基因組的選自5’非翻譯區(qū)(UTR)、3’UTR及開放閱讀框(ORF)的區(qū)域。
6.如權(quán)利要求1-5任一項所述的sliRNA，其中，所述病毒為選自下列病毒的人類病毒:脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、人腸道孤病毒、微小核糖核酸病毒和腸道病毒。
7.如權(quán)利要求6所述的sliRNA，其中，所述病毒是腸道病毒。
8.如權(quán)利要求1-7任一項所述的sliRNA，其中，所述sliRNA包括雙鏈RNA。
9.如權(quán)利要求8所述的sliRNA，其中，所述雙鏈RNA是平末端。
10.如權(quán)利要求1-9任一項所述的sliRNA，其中，所述sliRNA的長度為14至25個核苷酸。
11.如權(quán)利要求1-10任一項所述的sliRNA，其中，所述SliRNA含有I至2個靠近所述核苷酸序列的3’末端的DNA堿基。
12.如權(quán)利要求1-11任一項所述的sliRNA，其中，所述高度保守區(qū)序列位于SEQIDNO:1的241位至263位。
13.如權(quán)利要求1-12任一項所述的sliRNA，其中，所述sliRNA包含具有以下序列的雙鏈RNA分子: 正義鏈:5，-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3， 反義鏈:5’ -UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3’， 其中，N是堿基，所述堿基可為胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、脫氧胞苷(dC)、脫氧鳥苷(dG)、脫氧腺苷(dA)、或脫氧胸苷(dT)、或類似物；11是0至2的整數(shù)。
14.如權(quán)利要求1-13任一項所述的sliRNA，其中，所述sliRNA包含具有以下序列的雙鏈RNA分子: 正義鏈:5’ -AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3， 反義鏈:5’ -GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3， 其中，N是堿基，所述堿基可為胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、脫氧胞苷(dC)、脫氧鳥苷(dG)、脫氧腺苷(dA)、或脫氧胸苷(dT)、或類似物；η是O至2的整數(shù)。
15.如權(quán)利要求13或14所述的sliRNA，其中，N是dT，且η為2。
16.如權(quán)利要求15所述的sliRNA，其中，η為2。
17.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有權(quán)利要求1-16中任一項所述的sliRNA，以及藥學上可接受的載體。
18.一種治療病理性血管生成相關(guān)疾病的方法，所述方法包括將藥學有效量的權(quán)利要求1-17任一項所述的sliRNA給藥至需要這種治療的受治者。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述疾病選自老年性黃斑變性(AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變及癌癥。
20.一種設計sliRNA的方法，所述方法包括:選擇病毒基因組序列的高度保守區(qū)；并測試包含與所述高度保守區(qū)片段具有至少90%同源性的核苷酸序列的RNA調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)活性的能力。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述Toll樣受體是Toll樣受體3(TLR3)。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒基因組高度保守序列的應用，尤其涉及以腸道病毒基因組高度保守區(qū)作為模板來設計靶小配體RNA(sliRNA)。所得的sliRNA作為治療病理性血管生成導致的相關(guān)疾病的治療性活性成分。
文檔編號C07H21/04GK103221540SQ201180050847
公開日2013年7月24日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者朱遠源, 陳莉, 李鐵軍, 陸毅祥, 孫云成, 王晉康 申請人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司