專利名稱：用于生產(chǎn)乙酰丙酸、乙酰丙酸酯、戊內(nèi)酯、以及其衍生物的發(fā)酵路徑的制作方法
用于生產(chǎn)乙酰丙酸、乙酰丙酸酯、戊內(nèi)酯、以及其衍生物的發(fā)酵路徑優(yōu)先權(quán)本申請要求于2010年8月30日提交的美國臨時申請?zhí)?1/378，199的優(yōu)先權(quán)，將其通過引用結(jié)合于此。背景乙酰丙酸，或稱4-氧代戊酸，是一種具有化學(xué)式CH3C (O) CH2CH2CO2H的有機化合物。它是一種酮酸。乙酰丙酸典型地是例如通過將蔗糖與濃鹽酸加熱來化學(xué)地制備。該程序經(jīng)由葡萄糖的中介而進行，該葡萄糖異構(gòu)化為果糖并且然后為羥甲基糠醛。乙酰丙酸是尼龍類似聚合物、合成橡膠以及塑料的潛在前體。乙酰丙酸是通用的合成中間體，例如在藥物合成中，并且它是其他化學(xué)商品(比如甲基四氫呋喃、戊內(nèi)酯以及乙酰丙酸乙酯)的工業(yè)生產(chǎn)中的前體。發(fā)明概述在某些方面以及實施例中，本發(fā)明提供了用于將從糖或其他碳源獲得的丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛袃r值的C5材料(比如乙酰丙酸)的化學(xué)途徑。示例性的C5化合物展示于

圖1與2中。當以糖作為碳源而使用時，該途徑的關(guān)鍵是將C6糖(比如但不限于，葡萄糖、果糖、半乳糖)和/或C5糖(比如但不限于，木糖、阿拉伯糖)轉(zhuǎn)變?yōu)楸幔⑶译S后通過化學(xué)或生物化學(xué)醛醇加成、氧化、還原、脫水以及環(huán)化反應(yīng)將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N或若干種有價值的C5化合物。當與另一種碳源(比如但不限于脂肪酸以及甘油)使用時，首先將該碳源轉(zhuǎn)變?yōu)楸幔⑶译S后轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N或若干種有價值的C5化合物，這些C5化合物包括線性C5酮酸或酯或其具有以下通式的環(huán)化衍生物=C5C4(X) C3C2 (Y) CJ=O) (Z)，其中X是羥基或酮氧，Y是氫、羥基或酮氧，C3與C2碳之間的化學(xué)鍵是單鍵或雙鍵(例如飽和的或不飽和的)并且Z是有關(guān)產(chǎn)生酯、硫酯或羧酸官能團的烷氧基、硫化物或苯氧基。在一些實施例中，該C5化合物是C5C4 (O1) C3C2⑴C1 (=0) (O1)，其中標記物“0廣指代相同的氧原子，如此使得形成一種環(huán)狀酯或內(nèi)酯，并且Y是氫或羥基或酮氧。所有其他原子價或化學(xué)鍵都假定為氫原子，除非以上另有指明。在一個方面，本發(fā)明提供了一種制造化合物的方法，該化合物是C5酮酸或酯、或C5羥酸或酯、或其環(huán)狀衍生物。本方法包括通過醛醇加成將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环NC5中間體，并且通過化學(xué)或酶步驟或其組合將該C5中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樗龌衔?。在某些實施例中，該C5化合物具有如以上描述的通式C5C4⑴C3C2 (Y) CJ=O) (Z)或C5C4 (O1) C3C2 (Y) CJ=O) (O1)。在某些實施例中，從5-碳和/或6-碳糖或適合用作微生物宿主碳源的原料來制備該化合物。在這些實施例中，該方法包括從該糖或原料(例如通過該微生物宿主)形成丙酮酸，以及乙醛醛醇加成至該丙酮酸(例如，在該微生物宿主中或在一種無細胞系統(tǒng)中)，由此制備5-碳酮酸作為用于制備所希望的C5化合物的中間體?？梢酝ㄟ^在該微生物宿主中的丙酮酸脫羧來制備用于醛醇加成的乙醛?？梢詫⒃撊┐技映僧a(chǎn)物進一步經(jīng)受一種或多種還原、氧化、脫水、基團轉(zhuǎn)移、水解和/或內(nèi)酯化反 應(yīng)(例如，每一種獨立地在該微生物宿主或無細胞系統(tǒng)中)以制備該希望的C5產(chǎn)物。
此類產(chǎn)物可以用作構(gòu)造單元以制備商業(yè)上有價值的化學(xué)品以及燃料。例如，內(nèi)酯，比如2-氧代-戊內(nèi)酯(圖2中的化合物L7)，2-羥基-戊內(nèi)酯(圖2中的化合物L6)，當歸內(nèi)酯(圖2中的化合物L2、L3以及L10)以及4-戊內(nèi)酯U _戊內(nèi)酯，圖2中的化合物LI)，可以用作溶劑。當歸內(nèi)酯以及4-戊內(nèi)酯還可以化學(xué)地轉(zhuǎn)變?yōu)閬喖谆谆?nèi)酯(MeMBL)(參見例如W0/2006/015023，W0/2006/015024的催化這一轉(zhuǎn)變的方法)。亞甲基甲基丁內(nèi)酯可以用作單體或共聚物來增加在電子產(chǎn)品與汽車應(yīng)用中廣泛使用的聚甲基丙烯酸酯(PMMA)聚合物的熱耐受性，或一起制造聚合物(比如聚(MeMBL)，參見例如W0/2005/028529)。另外，可以使用化學(xué)催化將4-戊內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)槲焖嵋约傲硗獾奈焖狨?，以及同分異?gòu)丁烯、丁二烯以及其他烯烴，包括具有八個或更多碳原子的烯烴，如Bozell J., Connecting Biomassand petroleum Processingwith a chemical bridge (用ih學(xué)才喬>1#牛勿質(zhì)與石油力口31 聯(lián)系起來)，Science (《科學(xué)》)329:522-523 (2010)中所綜述的。乙酰丙酸(圖1中的化合物Pl)可以轉(zhuǎn)變?yōu)?，4戊二醇以及二酚酸，這兩者可以用以制造聚合物。δ-氨絡(luò)乙酰丙酸(自乙酰丙酸的衍生物)是一種每年具有超過300磅的預(yù)計市場的除草劑。再者，乙酰丙酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)橼啾瓤?pyrrolidones) (W0/2004/085048)、卩比咯燒酮(pyrrolidinone)(TO/2010/065833、TO/2004/085390、TO/2004/085349、W0/2004/084633)、當歸內(nèi)酯(W0/2005/097723)、4_戊內(nèi)酯以及2-甲基-THF，它們是終產(chǎn)物或可以進行進一步轉(zhuǎn)化成為其他的具有不同功用的化合物，比如陰離子液體(W0/2010/065833)、生物燃料以及燃料添加劑。乙酰丙酸可以另外地用作用于電池(例如JP09190820)、墨水(US5，769，929)、涂料(JP06280041)、抗腐蝕涂料(EP496555)的材料。乙酰丙酯(levulinic ester)(或乙酰丙酸酯(levulinate ester),圖1中的化合物P9)本身是聚合物構(gòu)造單元并且轉(zhuǎn)化后成為縮酮(US2008/0242721)并且還可以用作燃料添加劑(如美國專利7，153，996所描述的，通過引用以其全部結(jié)合于此)。另外，乙酰丙酯可以在個人護理產(chǎn)品(例如，日本專利JP05320023)、表面活性劑以及潤滑劑(EP882745)、吸收劑(參見W0/1998/9843684)中使用。提及的所有引用文件通過引用而結(jié)合于此。乙酰丙酸，乙酰丙酯以及圖2中列出的一些內(nèi)酯還可以用在藥物活性成分制造以及藥物應(yīng)用中，其中一些列于 Bozell T., Production of levulinic acidand use asa platform chemical for derived products (乙酉先丙酸的牛.產(chǎn)以及作為用于衍牛.產(chǎn)品的平臺化學(xué)物質(zhì)的用涂 ),Resources, Conservation and Recycling(《資源、轉(zhuǎn)化與再循環(huán)》)28:227-239 (2000)中。例如，W0/1995/022524報道了乙酰丙酸甲酯用于作為抗癌劑的新穎吲哚衍生物的合成的用途。乙酰丙酸以及4-羥基-戊酸還可以用作手性試劑，具有廣泛的潛在應(yīng)用(參見例如，Meyers等人，Stereoselective alkylations inrigid systems (岡丨I件系統(tǒng).中的立體選擇件掠化).Effect of remote substituents onp-facial additions to lactam enolates (玩距離耳又代基對內(nèi)酉先胺搖酉享化物的D_表面力口成的影口向).Stereoelectronic and steric effects (空間電子與立體效應(yīng))，T.Am.Chem.Soc (《美國化學(xué)學(xué)會雜志》).120:7429-7438 (1998)) 由本發(fā)明所產(chǎn)的C5的藥學(xué)應(yīng)用可以包括丁內(nèi)酯與戍內(nèi)酯衍生物通過干擾細菌中的群體感受分子機制(quorum sensingmolecular mechanism)作為抗生素以及抗生物膜劑的用途(參見例如EP1716131以及W0/2006/117113)。另外的用途可以衍生自具有生物活性的原-白頭翁素(圖2中的化合物L4)。最后，乙酰丙酸以及酯已經(jīng)在眾多消費產(chǎn)品中用于食品、香料、芳香劑(EP1533364)以及添加劑。例如，乙酰丙酸用作香煙中的添加劑(W0/2010/051076)。這一段落中的所有引用文件通過引用而結(jié)合于此。在本發(fā)明的某些實施例中，該方法包括將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-戊內(nèi)酯。在另一個實施例中，該方法包括將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴１?。在另一個實施例中，該方法包括將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴１?乙酰丙酸酯)，比如但不限于，乙酰丙酸乙酯以及乙酰丙酸丙酯。在本發(fā)明的另一個替代性實施例中，該方法包括將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫敋w內(nèi)酯、α -以及α ’ -當歸內(nèi)酯。在又其他實施例中，該方法包括將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)?，4- 二羥基-戊酸或其環(huán)化形式2-羥基-4-戊內(nèi)酯。在又另一個實施例中，該方法包括將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧代-4-羥基-戊酸或其環(huán)化形式2-氧代-4-戍內(nèi)酯。在本發(fā)明的一些實施例中，該方法包括在一種真核生物、原核生物或古細菌發(fā)酵宿主(包括但不限于酵母屬物種、畢赤酵母屬物種、假單胞菌屬物種、芽孢桿菌屬物種、金孢子菌屬物種、以及大腸桿菌)中 整合進入一個單一代謝途徑中的多個酶步驟。在這些或其他實施例中，該方法包括一個或多個酶步驟(在無細胞系統(tǒng)中進行)、或化學(xué)催化步驟、或其組合，如果必要可以將該途徑中的不同中間體可任選地分開和/或從發(fā)酵液中純化以完成該程序。本發(fā)明的某些實施例的優(yōu)點在于其建立在中心代謝之上。例如，真核生物、原核生物以及古細菌中的C5與C6代謝都可以采用產(chǎn)生糖酵解以丙酮酸。丙酮酸是中心代謝的最為重要的中間體之一，并且除了糖酵解之外還可以獲得自脂質(zhì)代謝以及氨基酸代謝。本發(fā)明的方法利用丙酮酸，并且將兩分子的丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€C5分子，比如乙酰丙酸以及4-戊內(nèi)酯。在C6糖的情況下，碳產(chǎn)率可以達到80%。在C5糖的情況下，碳產(chǎn)率理論上可以達到100%。如果該方法采用一種能夠同時發(fā)酵C5與C6的微生物菌株(比如但不限于，工程化的釀酒酵母以及樹干畢赤酵母)，則允許糖直接發(fā)酵為乙酰丙酸、4-戊內(nèi)酯或圖1與圖2中描述的任一 C5化合物。當與用于獲得乙酰丙酸或Y-戊內(nèi)酯的替代性方法(其典型地產(chǎn)生40%或更低的摩爾產(chǎn)率)相比時，這一可達到的高產(chǎn)率代表了一個決定性的工業(yè)優(yōu)勢。在本發(fā)明的一個實施例中，該方法將糖流轉(zhuǎn)變?yōu)閳D1與2中列出的一種或多種C5化合物。在另一個實施例中，使用淀粉作為用于該程序的原料。在另一個實施例中，該方法將木質(zhì)纖維素原料(包括但不限于，玉米秸桿、木屑、城市廢棄物、紙漿以及制造廠淤渣)轉(zhuǎn)變?yōu)閳D1與2中列出的至少一種C5化合物。在本發(fā)明的一個實施例中，該方法將C6糖轉(zhuǎn)變?yōu)閳D1與2中列出的一種或若干種C5化合物，優(yōu)選地是在高效吸收并發(fā)酵C6糖的發(fā)酵菌株中進行該轉(zhuǎn)變，這些菌株比如但不限于釀酒酵母、賈吉爾氏(Cargill’s)CBl菌株(如在W0/2007/106524中所描述的)、假單胞菌屬、金孢子菌屬以及大腸桿菌(E.coli)。在本發(fā)明的另一個實施例中，該方法將C5糖轉(zhuǎn)變?yōu)閳D1與2中列出的一種或若干種C5化合物，優(yōu)選地是在高效吸收并發(fā)酵C5糖的發(fā)酵菌株中進行該轉(zhuǎn)變，這些菌株比如但不限于工程化釀酒酵母以及樹干畢赤酵母。在本發(fā)明的一個實施例中，該方法同時將C5與C6糖轉(zhuǎn)變?yōu)镃5化合物，優(yōu)選地是在高效吸收并發(fā)酵C5與C6糖的發(fā)酵菌株(例如，釀酒酵母)中進行該轉(zhuǎn)變。在本發(fā)明的另一個實施例中，這些發(fā)酵菌株顯示出對生物質(zhì)水解物抑制劑(比如但不限于，呋喃)以及對低PH或高有機酸滴度培養(yǎng)基的高水平耐受性。在某些實施例中，該原料包括一種或多種選自以下各項的C6糖:阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、半乳糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖以及塔格糖。在這些或其他實施例中，該原料包括一種或多種選自以下各項的C5糖:木糖、阿拉伯糖、核糖、來蘇糖、木酮糖以及核酮糖。當本發(fā)明的方法用于將C5以及C6糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基-戊酸或4-戊內(nèi)酯時，將該途徑設(shè)計為還原氧化(還原作用-氧化作用)平衡的:在糖酵解中產(chǎn)生兩還原當量(NAD(P)H的形成)以給出丙酮酸(一個葡萄糖分子至兩個丙酮酸分子)并且下游的從丙酮酸至4-羥基-戊酸或4-戊內(nèi)酯(Y-戊內(nèi)酯)的程序消耗兩還原當量(NAD⑵的形成)。該反應(yīng)對于這兩種分子的產(chǎn)生是還原氧化平衡的這一事實將在發(fā)酵程序的情況下致使優(yōu)化的轉(zhuǎn)化，并且減少或消除對另外地工程化該發(fā)酵宿主以對抗失衡的需要。為了將糖直接發(fā)酵為所有其他的化合物或構(gòu)造單元(圖1)，該發(fā)酵宿主將依賴于分開的支反應(yīng)以平衡該途徑或依賴于一種外部的適合于平衡該途徑的還原氧化當量源。附圖簡述附圖1展示了乙酰丙酸的分子式(圖1中的化合物P1)，以及可以在于此描述的該途徑的不同步驟中以及這些程序的不同實施方案中產(chǎn)生的有價值的衍生物(圖1中的化合物 Pl 至 P16)。附圖2展示了不同C5內(nèi)酯的分子式，根據(jù)本方法的不同實施例它們可以在該途徑的不同步驟中產(chǎn)生(化合物LI至L10)。附圖3提供了將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)閳D1或圖2中的任何C5化合物的生物化學(xué)程序的概覽，高亮了某些步驟。一些可能的化學(xué)中間體以及子路徑?jīng)]有在此描述。對不同途徑可能性的更詳盡描述參見附圖5。圖4提供了根據(jù)本發(fā)明的某些實施例的生物化學(xué)途徑與程序的概覽，其中這些氧化/還原步驟(相應(yīng)于圖3中的步驟3與4)的次序是反向的。如在圖3中，一些可能的化學(xué)中間體與子路徑?jīng)]有在此 描述。對不同途徑可能性的更詳盡描述參見附圖6。圖5提供了圖3中的生物化學(xué)途徑/程序的概覽，其中使用氧化脫水酶將步驟4與步驟5縮并成了一個步驟。圖6提供了將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)閳D1或圖2中的任何C5化合物或構(gòu)造單元的生物化學(xué)途徑/程序的詳覽。除了圖3、4以及5中所描述的化學(xué)步驟外，還描述了可以從該核心途徑的中間體的環(huán)化反應(yīng)獲得的不同的環(huán)狀中間體，以及這些環(huán)狀內(nèi)酯中間體到這些不同的C5化合物或構(gòu)造單元的化學(xué)轉(zhuǎn)化。此外，還展示了可以從該核心途徑中的中間體獲得的不同的CoA中間體。該途徑可以用以生產(chǎn)乙酰丙基-CoA，從該乙酰丙基-CoA可以容易地獲得乙酰丙酸以及4-戊內(nèi)酯，或乙酰丙酸酯和/或其他戊酸酯，比如圖1中的4-氧代-戊酸酯(化合物P9)。圖7展示了通過硫酯酶或轉(zhuǎn)移酶的作用從該乙酰丙基-Cok中間體生產(chǎn)乙酰丙酯(乙酰丙酸酯)以及乙酰丙酸的原理。側(cè)鏈R可以是任何官能團，比如但不限于，甲基、乙基、丙基、芳基、苯基、萘基與其他芳族基團，以及具有氧與氮取代基的烷基基團，比如酮、伯醇、仲醇、叔醇、伯胺、仲胺與叔胺，等等。圖8展示了當將兩種烯醇化物還原酶(Genbank登錄號AAA64522以及AAD16106，在圖8中標記為6001以及6002)與底物4-氧代-2-戊酸(還稱作乙?；┧?，參見圖1中的化合物P2)與底物環(huán)已烯酮(作為對照)進行反應(yīng)時所得到的動力學(xué)軌跡。標記為“6001aceto”以及“6002aceto”的曲線顯示出這些蛋白在IOOuM NADPH以及該底物4-氧代-2-戊酸的存在下的活性。標記為“eOOlcyclo”以及“6002cyclo”的曲線顯示出這些蛋白在IOOuM NADPH以及該底物環(huán)已烯酮的存在下的活性。監(jiān)測到在340nm的吸收減少，這種減少測量了 NADPH向氧化形式NADP+的轉(zhuǎn)變。這一曲線顯示出該底物4-氧代-2-戊酸被兩種蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴１?圖1中的化合物PD。對照曲線(標記為“6001buffer”與“6002buffer”以及“buffer cyclo”與“buffer aceto”)顯示出這些底物單獨在緩沖液中或這些蛋白單獨在緩沖液中時的吸收減少。在這些條件下沒有檢測到顯著活性。所有曲線在緩沖磷酸鉀100mM、pH7.0以及室溫(25° C)條件下獲得。初始NADPH濃度100uM，4-氧代-2-戊酸初始濃度IOOmM,環(huán)已烯酮初始濃度50mM。蛋白濃度變化。圖9展示了 II類來自惡臭假單胞菌的醒縮酶HpaI醒縮酶(Genbank登錄號ADA63518)對底物乙醛以及丙酮酸的活性。測定條件如下:將該蛋白從E.Coli中表達并N1-純化并且在Tris緩沖液(pH8.0，補充有IOOmM MnCl2)中以100mg/ml的初始濃度與乙醛以及丙酮酸的混合物進行反應(yīng)。在用HCL淬滅并且利用EPIC極性柱運行HPLC之前，將該蛋白與這些底物在室溫孵 育30min。圖9展示了所得到的HPLC軌跡，其中相應(yīng)于這些底物與產(chǎn)物的峰在該圖中以黑色箭頭指示。產(chǎn)物4-羥基，2-氧代戊酸的化學(xué)鑒定通過LC/MS來確定(數(shù)據(jù)未展示)。發(fā)明的詳細說明在某些方面以及實施例中，本發(fā)明提供了用于將從糖或其他碳源獲得的丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛袃r值的C5材料(比如乙酰丙酸)的化學(xué)途徑。概念上地，本發(fā)明的方法提供了一種途徑，該途徑被組織為至少兩個步驟，并且在一些實施例中是從4至8個步驟，比如7至8個步驟(參見圖3中描述的核心的8個步驟)，伴有沿該途徑獲得的中間體的多達4個另外的環(huán)化步驟。中間體在多個階段至輔酶A(CoA)部分的附接允許途徑產(chǎn)生CoA中間體，比如乙酰丙基_CoA(參見圖6)。另外，四個可任選的步驟可以產(chǎn)生該途徑中關(guān)鍵中間體的環(huán)化變體(再次參見圖6)。根據(jù)不同實施例，一個第一步驟是醣酵解，其將糖(比如來自生物質(zhì))轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，或者將糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬奶娲缘娜魏位瘜W(xué)轉(zhuǎn)變。一個第二步驟將兩分子的丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环葑拥?-羥基2-氧代-戊酸以及C02。一個可任選的環(huán)化步驟產(chǎn)生相應(yīng)的內(nèi)酯，2_氧代-4-戊內(nèi)酯。一個可任選的CoA附接步驟可以產(chǎn)生4-羥基-2-氧代戊酰-CoA。一個第三步驟將4-羥基-2-氧代-戊酸還原為2，4- 二羥基-戊酸，或?qū)?-羥基-2-氧代戊酰-CoA還原為2，4- 二輕基-戊酰-CoA,或?qū)?-氧代_4_戊內(nèi)酯還原為2-輕基_4_戊內(nèi)酯。一個可任選的環(huán)化步驟從2，4- 二羥基-戊酸或2，4- 二羥基-戊酰-CoA產(chǎn)生相應(yīng)的內(nèi)酯，2-羥基-4-戊內(nèi)酯。一個可任選的CoA附接步驟可以從2，4- 二羥基戊酸產(chǎn)生2，4- 二羥基戊酰-CoA。一個第四步驟將2，4- 二羥基-戊酸氧化為2-羥基-4-氧代-戊酸，或?qū)?，4- 二羥基-戊酰-CoA氧化為2-羥基-4-氧代-戊酰-CoA。一個可任選的CoA附接步驟將2-羥基-4-氧代-戊酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基-4-氧代戊酰-CoA。一個第五步驟將2-羥基-4-氧代-戊酸脫水為4-氧代-2-戊酸，將2-羥基-4-氧代-戊酰-CoA脫水為4-氧代-2-戊酰-CoA。一個可任選的CoA附接步驟將4-氧代-2-戊酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧代-2-戊酰-CoA。一個可任選的步驟進一步將4-氧代-2-戊酸還原為4-羥基-2-戊酸，或?qū)?-氧代-2-戊酸還原為4-羥基-2-戊酰-CoA，這兩者可以可任選地進行環(huán)化以產(chǎn)生當歸內(nèi)酯。另一個可任選的CoA附接步驟可以從4-羥基-2-戊酸產(chǎn)生4-羥基-2-戊酰-CoA，其再次可以可任選地進行環(huán)化以產(chǎn)生當歸內(nèi)酯。本發(fā)明的一個替代性實施例將該第四與第五步驟“縮并”為一個單一步驟。一個第六步驟通過以類似于以上的方式對4-氧代-2-戊酸進行還原而產(chǎn)出乙酰丙酸(4-羥基-戊酸)。一個可任選步驟將輔酶A (CoA)附接至乙酰丙酸而產(chǎn)生乙酰丙基-CoA。然后可以通過使用轉(zhuǎn)移酶與合適的醇進行反應(yīng)而使乙酰丙基-CoA轉(zhuǎn)化為多種乙酰丙酯。在一些實施例中，一個第七步驟進一步將乙酰丙酸還原產(chǎn)生4-羥基-戊酸。一個第八步驟將4-羥基-戊酸環(huán)化產(chǎn)生4-戊內(nèi)酯。在某些實施例中，步驟4以及5可以在一個單一轉(zhuǎn)化(氧化脫水)中進行。在本發(fā)明的另一個實施例中，步驟3以及4順序顛倒，如此使得2-羥基-4-氧代-戊酸首先被氧化為2，4- 二氧代-戊酸，并且進一步被還原為2-氧代-4-羥基-戊酸，這樣則圖3中的途徑變成了圖4中所表示的那個。在本發(fā)明的另一個實施例中，步驟3、5以及6(圖3)直接以各個內(nèi)酯L1、L2、L6、L7、L8、L9以及LlO進行，其中最初從丙酮酸以及乙醛而產(chǎn)生的線性中間體的分支化發(fā)生在圖6中描述的任一環(huán)化步驟中。本發(fā)明的這一實施例可以用以直接獲得內(nèi)酯，或在水解作用后用以獲得返回任何的Pl至P16化合物中(包括乙酰丙酸)。在本發(fā)明的又另一個方面中，步驟2、3、4、5以及6(圖3)以這些CoA中間體進行，其中最初從丙酮酸以及乙醛而產(chǎn)生的線性中間體的分支化發(fā)生在附圖6段落中描述的任一 CoA附接步驟中。本發(fā)明的這一實施例可以用以通過硫酯酶的使用而獲得任何的Pl至P16化合物中(包括乙酰丙酸)。乙酰丙 酯(P9)可以通過使用轉(zhuǎn)移酶而從乙酰丙基-CoA以及合適的醇獲得。步驟1:糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸崽窍虮岬霓D(zhuǎn)變是得以良好研究的代謝途徑糖酵解的一部分。在糖酵解中，多種酶的作用使得每一分子的C6糖(比如葡萄糖)轉(zhuǎn)變?yōu)閮煞肿拥谋?、兩分子的ATP以及以兩個NAD(P)H分子的兩還原當量。在本發(fā)明的一個實施例中，丙酮酸是從一種發(fā)酵生物體中的糖酵解獲得并且隨后用在該發(fā)酵宿主中的下游途徑中。在一個替代性實施例中，丙酮酸是從發(fā)酵液中分離并且隨后根據(jù)下游途徑進行加工。步驟2:丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基-2-氧代-戊酸4-羥基-2-氧代-戊酸可以通過乙醛(一種醛)至丙酮酸(一種α酮酸)的醛醇加成而產(chǎn)生。該加成使一當量的乙醛與一當量的丙酮酸反應(yīng)。乙醛可以從多種方式得到。例如，丙酮酸脫羧酶催化丙酮酸非氧化脫羧至乙醛。因此可以使用來自多種真核生物或原核生物來源(例如，釀酒酵母)的丙酮酸脫羧酶。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，利用酶丙酮酸脫羧酶從丙酮酸來產(chǎn)生乙醛。已經(jīng)分離了多種醛縮酶，它們顯示出催化丙酮酸與乙醛之間的醛醇加成。一種I類醛縮酶4-羥基-2-酮-戊酸醛縮酶(HKP醛縮酶)是一種利用希夫堿(Schiffbase)賴氨酸的醛縮酶并且催化正向與反向反應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施例中，丙酮酸與乙醛之間的醛醇加成可以由來自大腸桿菌的HKP醛縮酶(描述在Pollard，JR等人，Substrate selectivity and biochemical properties of4-hydroxy-2-keto-pentanoicacid aldolase from E.Coli (來自大腸桿菌的4_羥基_2_酮-戊酸醒縮酶的底物選擇件與牛.物化學(xué)特件)，Add 1.And Environ.Microbiology (《應(yīng)用以及環(huán)境微生物》)，64(10):4093-4094(1998)中)、或其同系物、或其突變體(那些突變體可任選地通過使用計算設(shè)計、定向進化技術(shù)或合理誘變、或其組合的蛋白工程化來獲得)進行催化。計算設(shè)計技術(shù)披露于US2009-0191607以及W02010/077470中，將其通過引用以其全文結(jié)合于此。已知存在至少兩種II類醛縮酶催化丙酮酸與乙醛之間的加成，并且在Wang W等人，Comparison of two metal-dependent pyruvate aldolases related by convergentevolution:substrate specificity.kinetic mechanism and substrate channeling(趨同進化相關(guān)的兩個金屬依賴性丙酮酸醛縮酶的比較:底物特異性、動力學(xué)機制以及底物通if), Biochemistry (《生物化學(xué)》)，49:3774-3782 (2010)中已經(jīng)在一定水平上詳細地表征了兩個(BphI以及HpaI)。這些酶采用一種金屬輔助因子(普遍是Zn或Mn)。BphI以及HpaI不具有可檢測的序列類似性。然而BphI是立體選擇性的并且產(chǎn)生4S加成物，HpaI由于其十分開放的活性位點而產(chǎn)生一種消旋混合物(4R以及4S加成物)。BphI是變構(gòu)地偶合至BphJ(—種乙醛脫氫酶)并且當單獨表達時是無活性且不穩(wěn)定的。然而，HpaI本身在大腸桿菌中是可表達的并且顯示出活性。在本發(fā)明的一個替代性實施例中，丙酮酸與乙醛之間的醒醇加成由HpaI或Bph1、或其突變體(那些突變體可任選地通過使用計算設(shè)計、定向進化技術(shù)或合理誘變、或這三種的組合的蛋白工程化來獲得)來催化。作為一種延伸，可以對任何合適的丙酮酸醛縮酶或其他類似的、催化醛與酮的醛醇加成的醛縮酶(例如，KDPG醛縮酶)可想象地進行再工程化以催化乙醛與丙酮酸的醛醇加成。該再設(shè)計可以包括但不 限于:達到對于丙酮酸與乙醛兩者而言所希望的底物特異性，控制所希望的立構(gòu)選擇性以產(chǎn)生消旋或?qū)τ臣兗映晌?(R) 4-羥基-2-氧代-戊酸以及
(S)4-羥基-3-氧代-戊酸)，穩(wěn)定該酶以在實施本發(fā)明的工業(yè)條件下(例如，熱穩(wěn)定或在較高有機滴度下穩(wěn)定)獲得所希望的催化活性，和/或改進該酶在實施本發(fā)明的工業(yè)背景(例如，在釀酒酵母的代謝途徑中)下的可表達性與可溶性。在本發(fā)明的另一個實施例中，丙酮酸與乙醛之間的醛醇加成由丙酮酸醛縮酶、或其同系物以及突變體(那些突變體可任選地通過使用計算設(shè)計、定向進化技術(shù)或合理誘變、或這三種的組合的蛋白工程化來獲得)來催化。最后，使用酶從頭設(shè)計技術(shù)，例如描述于Zanghellini, A等人，Algorithmsand an in silico Benchmark for Computational Enzyme Design(計算酶設(shè)計的新算法以及計算機內(nèi)樽擬某準)，Protein Science (《蛋白質(zhì)科學(xué)》)15:2785-2794(2006)中的，可能來設(shè)計針對存在或不存在于自然界中的底物的新穎醛縮酶。已經(jīng)從頭設(shè)計了高達70中這類醛縮酶，如US2009-0191607中所描述的，將其通過引用以全文結(jié)合于此。將這一方法論應(yīng)用至底物丙酮酸以及乙醛可以產(chǎn)生具有所希望活性的醛縮酶。在本發(fā)明的另一個實施例中，丙酮酸與乙醛之間的醛醇加成由一種從頭設(shè)計的醛縮酶來催化。步驟2’:4-羥基-2-氧代-戊酸環(huán)化為2-氧代_4_戊內(nèi)酯4-羥基-2-氧代-戊酸環(huán)化為2-羥基-4-戊內(nèi)酯(圖1中的化合物L7)。在酸性至中性溶液中，熱力學(xué)平衡關(guān)系到至內(nèi)酯的環(huán)化。至內(nèi)酯的環(huán)化可以通過使用化學(xué)或生物化學(xué)催化劑在動力學(xué)上進行強化。用于內(nèi)酯化的均相或非均相催化劑包括強酸(例如，硫酸)條件、金屬催化劑(例如，鈀、銣)。生物化學(xué)催化可以通過在有利于正向內(nèi)酯化反應(yīng)的條件下(低至中性PH/高有機溶劑滴度)的脂肪酶、酯酶、蛋白酶以及內(nèi)酯酶的作用來獲得，如例如Martin CH,等人，Integrated bioprocessing for pH~dependent of4-valerolactonefrom levulinate in Pseudomonas Putida KT2440 (從惡臭假單胞菌KT2440 中的乙酉先丙酸整合地加工pH依賴件的4-戍內(nèi)酷),Appl.and Environ, Microbiology (《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》)76 (2): 417-424中所展示的。在本發(fā)明的一個實施例中，在一種催化劑存在下，在將4-羥基-2-氧代-戊酸從發(fā)酵液或無細胞溶液分離之后，從4-羥基-2-氧代-戊酸生產(chǎn)2-氧代-4-戊內(nèi)酯。在本發(fā)明的另一個實施例中，4-羥基-2-氧代-戊酸至2-氧代-4-戊內(nèi)酯的內(nèi)酯化直接由脂肪酶或酯酶或蛋白酶或內(nèi)酯酶、或其突變體(那些突變體可任選地通過使用計算設(shè)計、定向進化技術(shù)、合理誘變、或這三者的組合的蛋白工程化來獲得)來催化。步驟3:4-羥基-2-氧代-戊酸還原為2，4_ 二羥基-戊酸在廣泛種類的天然脫氫酶中，計算機模擬(in silico)和/或?qū)嶒灪Y選可以選擇具有耐受4-羥基-2-氧代-戊酸以及2，4- 二羥基-戊酸的底物專一性的脫氫酶。另外，計算設(shè)計、定向進化技術(shù)、或合理誘變、或這三者的組合可以用以改變或增加現(xiàn)有脫氫酶針對4-羥基-2-氧代-戊酸以及2，4- 二羥基-戊酸的底物專一性。合適的脫氫酶起點的實例包括L-以及D-乳酸脫氫酶(NAD(P)H-或亞鐵原卟啉-依賴性，來自真核生物或細菌來源)、蘋果酸脫氫酶、天冬氨酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶(NAD(P)H依賴性，來自真核生物或細菌來源)、以及醇脫氫酶(比如NAD (P) H依賴性的烷基或苯基醇脫氫酶)。此類脫氫酶的實例列于實例部分中。

在本發(fā)明的一個實施例中，使用均相或非均相化學(xué)催化將4-羥基-2-氧代-戊酸選擇性地還原為2，4- 二羥基-戊酸。2，4- 二羥基-戊酸可以從或不從發(fā)酵或無細胞溶液中進行分離/純化以完成這一步驟。優(yōu)選地，在隨后經(jīng)受所述還原之前，將2，4- 二羥基-戊酸從該溶液或發(fā)酵液中分尚。在本發(fā)明的一個實施例中，使用一種NAD (P) H依賴性脫氫酶來催化4_輕基_2_氧代-戊酸的2位上的酮的還原。在另一個實施例中，所述脫氫酶以針對4-羥基-2-氧代-戊酸的高度底物專一性以及針對2位上的酮的高度區(qū)位選擇性而還原該酮。在本發(fā)明的一個實施例中，所述脫氫酶不是立體選擇性的并且可以接受4R與4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述脫氫酶選擇性地還原4-羥基-2-氧代-戊酸的4R或4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用一種FAD依賴性脫氫酶替代NAD (P) H依賴性脫氫酶，優(yōu)選地是該FAD依賴性脫氫酶具有高度的底物與區(qū)位選擇性。在本發(fā)明的一個實施例中，所述脫氫酶不是立體選擇性的并且可以接受4R與4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述脫氫酶選擇性地還原4-羥基-2-氧代-戊酸的4R或4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用一種FMN依賴性脫氫酶替代NAD(P)H依賴性脫氫酶，優(yōu)選地是該FMN依賴性脫氫酶具有高度的底物與區(qū)位選擇性。在本發(fā)明的一個實施例中，所述脫氫酶不是立體選擇性的并且可以接受4R與4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述脫氫酶選擇性地還原4-羥基-2-氧代-戊酸的4R或4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用一種高鐵細胞色素依賴性脫氫酶替代NAD(P)H依賴性脫氫酶，優(yōu)選地是該高鐵細胞色素依賴性脫氫酶具有高度的底物與區(qū)位選擇性。在本發(fā)明的一個實施例中，所述脫氫酶不是立體選擇性的并且可以接受4R與4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述脫氫酶選擇性地還原4-羥基-2-氧代-戊酸的4R或4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用一種醌依賴性脫氫酶替代NAD(P)H依賴性脫氫酶，優(yōu)選地是該醌依賴性脫氫酶具有高度的底物與區(qū)位選擇性。在本發(fā)明的一個實施例中，所述脫氫酶不是立體選擇性的并且可以接受4R與4S對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述脫氫酶選擇性地還原4-羥基-2-氧代-戊酸的4R或4S對映異構(gòu)體。步驟3’:2，4- 二羥基-戊酸環(huán)化為2-羥基_4_戊內(nèi)酯2，4- 二羥基-戊酸環(huán)化為2-羥基-4-戊內(nèi)酯(圖1中的化合物L6)。在酸性至中性溶液中，熱力學(xué)平衡關(guān)系到至4-戊內(nèi)酯的環(huán)化。有關(guān)熱力學(xué)平衡以及化學(xué)與生物化學(xué)催化的相同說明如以上所述而適用。在本發(fā)明的一個實施例中，在一種催化劑存在下，在將2，4- 二羥基-戊酸從發(fā)酵液或無細胞溶液分離之后，從2，4- 二羥基-戊酸生產(chǎn)2-羥基-4-戊內(nèi)酯。在本發(fā)明的另一個實施例中，2，4- 二羥基-戊酸至2-羥基-4-戊內(nèi)酯的內(nèi)酯化直接由一種脂肪酶或酯酶或蛋白酶或內(nèi)酯酶、或其突變體(那些突變體通過使用計算設(shè)計、定向進化技術(shù)、或合理誘變、或這三者的組合的蛋白工程化來獲得)來催化。步驟4:2，4-二羥基-戊酸氧化為4-氧代-2-輕基-戍酸在本發(fā)明的一個實施例中，使用均相或非均相化學(xué)催化將2，4-二羥基-戊酸選擇性地氧化為4-氧代-2-羥基-戊酸。2，4- 二羥基-戊酸可以從或不從發(fā)酵或無細胞溶液中進行分離/純化以完成這一步驟。優(yōu)選地，在隨后經(jīng)受所述氧化之前，將4-氧代-2-羥基-戊酸從該溶液或發(fā)酵液中分離。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，使用一種NAD (P) H依賴性脫氫酶來催化2，4_ 二羥基-戊酸的4位上的羥基的氧化。在一個優(yōu)選的實施例中，所述脫氫酶以針對2，4- 二羥基戊酸的高度底物專一性以及針對4位上的羥基的高度區(qū)位選擇性而氧化該羥基。優(yōu)選地，所述脫氫酶接受2， 4-二羥基-戊酸的四種不同的對映異構(gòu)體(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一個替代性實施例中，所述脫氫酶選擇性地氧化2，4- 二羥基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)對映異構(gòu)體，任何一個都是從前面4-羥基-2-氧代-戊酸還原而得到的最豐富的對映異構(gòu)體。此類脫氫酶的實例列于實例部分中。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用一種FAD依賴性脫氫酶來催化2，4_ 二羥基-戊酸的4位上的羥基的氧化。在一個優(yōu)選的實施例中，所述脫氫酶以針對2，4- 二羥基-戊酸的高度底物專一性以及針對4位上的羥基的高度區(qū)位選擇性而氧化該羥基。優(yōu)選地，所述脫氫酶接受2，4-二羥基-戊酸的四種不同的對映異構(gòu)體(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一個替代性實施例中，所述脫氫酶選擇性地氧化2，4- 二羥基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)對映異構(gòu)體，任何一個都是從4-羥基-2-氧代-戊酸還原而得到的最豐富的對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個實施例中，使用一種FMN依賴性脫氫酶來催化2，4- 二羥基-戊酸的4位上的羥基的氧化。在一個優(yōu)選的實施例中，所述脫氫酶以針對2，4- 二羥基-戊酸的高度底物專一性以及針對4位上的羥基的高度區(qū)位選擇性而氧化該羥基。優(yōu)選地，所述脫氫酶接受2，4-二羥基-戊酸的四種不同的對映異構(gòu)體(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一個替代性實施例中，所述脫氫酶選擇性地氧化2，4- 二羥基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)對映異構(gòu)體，任何一個都是從4-羥基-2-氧代-戊酸還原而得到的最豐富的對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的又另一個實施例中，使用一種高鐵細胞色素依賴性脫氫酶來催化2，4- 二羥基-戊酸的4位上的羥基的氧化。在一個優(yōu)選的實施例中，所述脫氫酶以針對2，4- 二羥基-戊酸的高度底物專一性以及針對4位上的羥基的高度區(qū)位選擇性而氧化該羥基。優(yōu)選地，所述脫氫酶接受2，4-二羥基-戊酸的四種不同的對映異構(gòu)體(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一個替代性實施例中，所述脫氫酶選擇性地氧化2，4- 二羥基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)對映異構(gòu)體，任何一個都是從4-羥基-2-氧代-戊酸還原而得到的最豐富的對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的又另一個實施例中，使用一種醌依賴性脫氫酶來催化2，4- 二羥基-戊酸的4位上的羥基的氧化。在一個優(yōu)選的實施例中，所述脫氫酶以針對2，4- 二羥基-戊酸的高度底物專一性以及針對4位上的羥基的高度區(qū)位選擇性而氧化該羥基。優(yōu)選地，所述脫氫酶接受2，4-二羥基-戊酸的四種不同的對映異構(gòu)體(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一個替代性實施例中，所述脫氫酶選擇性地氧化2，4- 二羥基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)對映異構(gòu)體，任何一個都是從4-羥基-2-氧代-戊酸還原而得到的最豐富的對映異構(gòu)體。步驟5:4-氧代-2-羥基-戊酸脫水為4-氧代_2_戊酸經(jīng)典地，使用均相或非均相催化(比如溫度>100°C，濃酸(4.0M硫酸)和/或金屬氧化物催化劑(氧化鋅或氧化鋁))來達到化學(xué)脫水。在本發(fā)明的一個實施例中，將這些還原與氧化步驟之后得到的4-氧代-2-羥基-戊酸通過均相或非均相催化而化學(xué)地脫水至4-氧代-2-戊酸。4-氧代-2-羥基-戊酸可以從或可以不從發(fā)酵或無細胞溶液中進行分離/純化以完成這一步驟。優(yōu)選地，在經(jīng)受所述脫水之前，將4-氧代-2-羥基-戊酸從該溶液或發(fā)酵液中分離。有機化合物的脫水可以可替代地通過脫水酶進行催化。一些類別的脫水酶已經(jīng)得以表征并且依賴于不同的機制:基于自由基的機制，比如在維生素B12依賴性或SAM依賴性的脫水酶(例如二醇脫水酶、甘油脫水酶)中，路易斯酸機理，比如含有鐵-硫的脫水酶(例如，二羥酸脫水酶、烏頭酸酶)，以及烯醇化物離子中間體機理，比如二酸脫水酶(比如，酒石酸脫水酶)。雖然所有機理都適用于4-氧代-2-羥基-戊酸的脫水，但依賴于烯醇化物中間體的機理是優(yōu)選的，因為羰基上的烯醇陰離子形成要消除的羥基降低了 α-質(zhì)子的pKa，由此允許其容易地被一種廣義酸/堿基團吸引。利用另外的廣義酸/堿基團使離去的水分子質(zhì)子化。這一機理被廣泛多種的天然脫水酶利用:來自烯醇酶超家族的鎂依賴性脫水酶，比如酒石酸脫水酶、葡萄糖酸脫水酶，使用這一機制用于以高底物專一性進行結(jié)構(gòu)多樣的二酸的脫水，如例如在Gerlt等人，Divergent evolution in the enolasesuperfamily:the interplay of mechanism and specificity(搖酉享酶超家族的趨異講化:坑制與專一,牛的相互作用)，Biochemistry (《生物化學(xué)》)，433:59-70 (2005)中所描述的。延胡索酸酶(還稱作延胡索酸水合酶)催化蘋果酸基于烯醇化物地可逆脫水至延胡索酸。烯酰脫水酶(還稱作巴豆酸酶)使用CoA硫酯的烯醇陰離子來催化不同CoA底物的可逆脫/K (參見例如 Holden 等人，The Crotonase Superfamily: divergently related enzymesthat catalyze different reactions involving acyl Coenzyme A thioesters ( P,曰酸酶超家族:催化不同反應(yīng)的包括酰基輔酶A硫酯的趨異相關(guān)的酶)，Acc.Chem.Res (《化學(xué)研究報道》).34:145-157.(2001))。在本發(fā)明的一個實施例中，由一種脫水酶來催化4-氧代-2-羥基-戊酸脫水為4-氧代-2-戊酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脫水酶使用一種烯醇化物中間體來催化該脫水。優(yōu)選地，所述脫水酶是烯醇酶超家族、延胡索酸脫水酶超家族或烯酰-CoA脫水酶超家族、或其通過蛋白工程化而得到的突變體中的一個成員。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脫水酶顯示出針對4-氧代-2-羥基-戊酸的高水平的底物專一性。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，所述脫水酶相等地使4-氧代-2-羥基-戊酸的2R與2S對映異構(gòu)體脫水。在本發(fā)明的一個替代性實施例中，所述脫水酶選擇性地使4-氧代-2-羥基-戊酸的2R或2S對映異構(gòu)體脫水。步驟4以及5的替代方案:對于將2，4-二羥基-戊酸2步轉(zhuǎn)變至4-氧代-2-戊酸而言，可替代地，可以使用一種氧化脫水來達到I步轉(zhuǎn)化。氧化脫水在糖代謝中是常見的。所謂的4，6脫水酶，比如UDP-GlcNAc-轉(zhuǎn)化用4，6-脫水酶，其結(jié)構(gòu)細節(jié)描述于Ishiyama等人，Structural studies of FlaAlfrom helicobacter pylori reveal the mechanism forinverting4, 6-dehydratase activity ()(寸I傘I 門電累旋本干Iif FlaAl 的結(jié)構(gòu)石開究揭示了
4.6-脫水酶活件的機制),J.Bi0.Chem.(《生物化學(xué)雜志》)別1 CM): 24489_244昍(2OO6)中。在本發(fā)明的一個實施例中，使用這樣一種4，6-脫水酶來催化2，4- 二羥基-戊酸氧化脫水至4-氧代-2-戊酸。在本發(fā)明的一個方面中，所述4，6-脫水酶是對映選擇性的并且優(yōu)選地使2，4-二羥基-戊酸的其中一種對映異構(gòu)體(2R4R、2R4S、2S4R或2S4S)脫水。在本發(fā)明的另一個方面中，所述4，6-脫水酶不是對映選擇性的并且以類似催化效率地使2，4- 二羥基-戊酸的兩種或更多種對映異構(gòu)體脫水。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，對2，4- 二羥基-戊酸具有高活性的4，6-脫水酶是從天然4，6-脫水酶通過使用計算設(shè)計、定向進化技術(shù)或合理誘變、或其組合 的蛋白工程化而獲得。步驟6:4-氧代-2-戊酸還原為4-氧代-戊酸(乙酰丙酸)經(jīng)取代的烯烴上的雙鍵可以被還原(氫化)以獲得相應(yīng)的飽和烷烴?？梢允褂没瘜W(xué)催化或通常不對稱地使用生物催化劑來還原經(jīng)取代的烯烴，這些生物催化劑比如烯醇化物還原酶，如綜述于 Stuermer 等人，Asvmmetri c bioreduction of activated C=C bondsusing enoate reductases from the old yellow enzyme family(使用來自老黃酶家族的烯醇化物還原酶對活化的C=C化學(xué)鍵進行不對稱生物還原I, Curr.0pin.1n Chem.Bio (《化學(xué)生物學(xué)現(xiàn)行觀點》).11:203-213(2007)中。烯醇化物還原酶已經(jīng)從真核生物(比如釀酒酵母以及地錢屬)以及原核生物(例如梭菌屬)中得以表征。烯醇化物還原酶家族依賴于黃素輔助因子(FMN)，該FMN在該酶的每次周轉(zhuǎn)都被氧化。除了一個已知的情況(其是煙酰胺獨立性的)外，該黃素輔助因子反過來也被結(jié)合在該活性位點的煙酰胺輔助因子(NADH或NADPH)進行還原。一次周轉(zhuǎn)完成后，底物已經(jīng)被還原，而輔助因子NAD(P)H已經(jīng)被氧化為NAD(P)+。各烯醇化物還原酶在它們的底物專一性方面不同。然而，一些烯醇化物還原酶(比如酵母以及梭菌屬的烯醇化物還原酶)具有廣譜的底物專一性并且可以容納線性的經(jīng)取代的烯烴(具有酸或酮官能團)以及經(jīng)取代的內(nèi)酯(比如4-戊內(nèi)酯)。 在本發(fā)明的一個實施例中，將4-羥基-2-氧代-戊酸從分離培養(yǎng)液或無細胞溶液中分離并且使用均相或非均相催化將雙鍵選擇性地還原。
在本發(fā)明的另一個實施例中，使用一種烯醇化物還原酶來將4-羥基-2-氧代-戊酸還原為乙酰丙酸。在一個優(yōu)選實施例中，所述烯醇化物還原酶依賴于FMNH2與NAD (P) H輔助因子，所述NAD (P) H輔助因子在該活性位點使用以在催化前將FMNH2再生為其氧化還原狀態(tài)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述烯醇化物還原酶在該發(fā)酵宿主中克隆并表達。在一個替代性實施例中，所述烯醇化物還原酶在細胞外使用，或在具有足夠的輔助因子再生系統(tǒng)的無細胞系統(tǒng)中使用。在另一個替代性實施例中，所述還原由一個表達一種或多種烯醇化物還原酶的全細胞催化劑進行催化，如此使得所述細胞不同于其中該途徑的部分或全部被使用的該(這些)發(fā)酵宿主細胞。步驟7:4-氧代-戊酸(乙酰丙酸)還原為4-羥基-戊酸類似于步驟3(段落
至
)，可以通過化學(xué)催化手段或通過使用一種脫氫酶生物催化劑來達到對乙酰丙酸的4位處的酮的還原。在代謝途徑的背景中，這一最后的還原(以及相應(yīng)的一還原當量的氧化)確保了 C5和/或C6糖的整個途徑的還原氧化平衡。在本發(fā)明的一個實施例中，將乙酰丙酸從培養(yǎng)液或無細胞溶液中分離并且使用均相或非均相催化將4位處的酮進行選擇性地還原以產(chǎn)生4-羥基-戊酸。在本發(fā)明的一個替代性實施例中，使用一種NAD(P)依賴性脫氫酶來催化乙酰丙酸的4位上的酮還原為相應(yīng)的羥基以產(chǎn)生4-羥基-戊酸。在一個優(yōu)選的實施例中，所述脫氫酶以針對乙酰丙酸的高度底物專一性以及針對4位上的酮的高度區(qū)位選擇性而還原該銅。優(yōu)選地，所述脫氫酶是如對于4-氧代-2-羥基-戊酸或其突變體(該突變體通過計算設(shè)計或?qū)嶒炚T變或兩者的組合而得到)的4 位處的羥基的氧化而言相同的酶。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脫氫酶選擇性地產(chǎn)生4-羥基-戊酸的對映異構(gòu)體(4R或4S)之一。在一個替代性實施例中，所述脫氫酶產(chǎn)生4-羥基-戊酸的4R與4S對映異構(gòu)體的消旋混合物。步驟8:4-羥基-戊酸環(huán)化為4-戊內(nèi)酯4-羥基-戊酸環(huán)化為4-戊內(nèi)酯(也稱作Y-戊內(nèi)酯，圖1中的化合物LI)。在酸性溶液中，熱力學(xué)平衡關(guān)系到至4-戊內(nèi)酯的環(huán)化。有關(guān)熱力學(xué)平衡以及化學(xué)與生物化學(xué)催化的相同說明如在段落
中而適用。在本發(fā)明的一個實施例中，在一種催化劑存在下，在將4-羥基-戊酸從發(fā)酵液或無細胞溶液分離之后，從4-羥基-戊酸生產(chǎn)4-戊內(nèi)酯。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，通過所述催化劑將對映純4-羥基-戊酸(4R或4S對映異構(gòu)體)轉(zhuǎn)變?yōu)閷τ臣?-戊內(nèi)酯。在一個替代性實施例中，通過所述催化劑將4-羥基-戊酸的兩種對映異構(gòu)體(4R以及4S)的消旋混合物轉(zhuǎn)變?yōu)?-戊內(nèi)酯的消旋混合物。在本發(fā)明的另一個實施例中，4-羥基-戊酸至4-戊內(nèi)酯的內(nèi)酯化直接由一種脂肪酶或酯酶或蛋白酶或內(nèi)酯酶、或其突變體(那些突變體通過使用計算設(shè)計、定向進化技術(shù)、或合理誘變、或這三者的組合的蛋白工程化來獲得)在細胞之內(nèi)或細胞之外進行催化。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶或酯酶或蛋白酶或內(nèi)酯酶作用于對映純4-羥基-戊酸底物以產(chǎn)生對映純4-戊內(nèi)酯。在一個替代性實施例中，所述脂肪酶或酯酶或蛋白酶或內(nèi)酯酶作用于4-羥基-戊酸的4R以及4S對映異構(gòu)體的消旋混合物以產(chǎn)生4-戊內(nèi)酯的4R以及4S對映異構(gòu)體的消旋混合物。
實例丙酮酸脫羧酶的實例:可以使用丙酮酸脫羧酶家族的一種酶(EC編號EC4.1.1.1)比如丙酮酸脫羧酶來催化該途徑的第一步驟，即丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?。下表I列出了這類酶的實例(連同它們的來源生物體)，它們在文獻中已經(jīng)得以研究與表征，列出了它們的公共數(shù)據(jù)庫GenBank(NCBI)登錄號。還可以使用同源酶，例如使用比對軟件(比如但不限于Blast、PS1-Blast或HMMER3)并以〈0.1的比對e_值從表I中的序列(或它們的逆翻譯)獲得的蛋白以及DNA序列。表I
GenBank(蛋白質(zhì))登錄號生物體
CAA39398釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)
AAM21208巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)
NP—195033擬南芥(Arabidopsis thaliana)
AAA20440寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)` EEQ44875白色念珠菌(Candida albicans)
AAN77243光滑念珠菌(Candida glabrata)
XP 002549529熱帶念珠菌(Candida tropicalis)
XP—001703530萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)
AAZ05069甜授(Citrus Sinensis)
ADZ22807Clostridium acetobytulicun
YP—003531827梨火疫病菌(Erwinia amylovora)
AAG13131草毒(Fragaria x ananassa)
AAA85103葡萄汁有抱漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)
CAA59953產(chǎn)乳糖酶酵母(Kluyveromyces Iactis)
AAA35267馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)
AAP75899Lachancea kluyveri
AAS49166乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)化合物的方法，該化合物是C5酮酸或酯、或C5羥酸或酯、或其環(huán)狀衍生物，該方法包括:通過醛醇加成將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环NC5中間體，并且通過化學(xué)或酶步驟或其結(jié)合將該C5中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樗龌衔铩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該丙酮酸是產(chǎn)自包含一個或多個C6糖的碳源。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該或這些C6糖是阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、半乳糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖以及塔格糖中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該丙酮酸是產(chǎn)自包含一種或多種C5糖的碳源。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該C5糖是木糖、阿拉伯糖、核糖、來蘇糖、木酮糖以及核酮糖中的一種或多種。
6.如權(quán)利要求2至5中任一項所述的方法，其中該碳源包含甘油、脂肪酸、以及氨基酸中的一種或多種。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中該丙酮酸是產(chǎn)自一種原料的發(fā)酵，該原料包含生物質(zhì)、淀粉、纖維素和/或木質(zhì)纖維素原料中的一種或多種。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該木質(zhì)纖維素原料包含谷類、木材、城市廢棄物、以及紙漿與制造廠淤渣中的一種或多種。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中該丙酮酸是至少部分地通過微生物系統(tǒng)中的糖酵解來生產(chǎn)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中對丙酮酸的醛醇加成發(fā)生在真核、原核或古生菌發(fā)酵宿主中。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中該發(fā)酵宿主是酵母屬物種、畢赤酵母屬物種、假單胞菌屬物種、芽孢桿菌屬物種、金孢子菌屬物種、或大腸桿菌。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該丙酮酸或醛醇加成產(chǎn)物是從該發(fā)酵宿主中回收并且在一種無細胞系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)變?yōu)橐韵禄衔?，即一種C5酮酸或酯、或C5羥酸或酯、或其環(huán)狀衍生物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該醛醇加成產(chǎn)物是通過選自還原、氧化、脫水、基團轉(zhuǎn)移、水解與內(nèi)酯化的一個或多個酶步驟在一種無細胞系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)變?yōu)樗龌衔铩?br> 14.如權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中該C5中間體是4-羥基2-氧代-戊酸。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該C5中間體是從丙酮酸通過乙醛的醛醇加成來生產(chǎn)。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中該4-羥基2-氧代-戊酸被還原為2，4-二羥基-戊酸。
17.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中該4-羥基2-氧代-戊酸被氧化為2，4-二氧代-戊酸。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該2，4-二羥基-戊酸被氧化為2-羥基4-氧代戊酸。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中該2，4-二氧代-戊酸被還原為2-羥基4-氧代戊酸。
20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中該2-羥基4-氧代戊酸通過脫水酶反應(yīng)被轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧代-2-戊酸。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該4-氧代-2-戊酸被還原為乙酰丙酸。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中該乙酰丙酸被還原為4-羥基戊酸。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中該4-羥基戊酸被環(huán)化為4-戊內(nèi)酯。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該2，4-二羥基-戊酸通過氧化脫水被轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧代-2-戊酸。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該4-氧代-2-戊酸被還原為乙酰丙酸。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中該乙酰丙酸被還原為4-羥基戊酸。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中該4-羥基戊酸被環(huán)化為4-戊內(nèi)酯。
28.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該4-羥基2-氧代-戊酸被環(huán)化為2-氧代4-戊內(nèi)酯，并且可任選地轉(zhuǎn)變?yōu)?-戊內(nèi)酯。
29.根據(jù)權(quán)利要求14至28中任一項所述的方法，其中至少一個中間體的酸基團被轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N輔酶A硫酯。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，另外包含:該輔酶A硫酯轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N酯。
31.如權(quán)利要求15所述的方法，其中該乙醛是通過在一種微生物宿主中的丙酮酸脫羧來制備。
32.如權(quán)利要求1至31中任一項所述的方法，其中該醛醇加成是通過I類醛縮酶。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中該醛縮酶是大腸桿菌HKP醛縮酶，或其同系物或突變體。
34.如權(quán)利要求1至31中任一項所述的方法，其中該醛醇加成是通過II類醛縮酶。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該醛縮酶是惡臭假單胞菌HpaI醛縮酶，或其同系物或突變體。
36.如權(quán)利要求34所述的方法,其中該醒縮酶是BurkholderiaXenovorans BphI醒縮酶，或其同系物或突變體。
37.如權(quán)利要求32至36中任一項所述的方法，其中該醛縮酶是表達在該宿主發(fā)酵生物體中。
38.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該化合物是乙酰丙酸或其酯。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該乙酰丙酸被轉(zhuǎn)變?yōu)?，4戊二醇或二酚酸，其可以可任選地與其他聚合物構(gòu)造單元聚合或共聚。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該乙酰丙酸或其酯被轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆臍溥秽颚?-氨基乙酰丙酸，其可以可任選地結(jié)合進入一種除草劑組合物中。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該乙酰丙酸或其酯被進一步聚合，可任選地與其他聚合構(gòu)造單元聚合為一種共聚物。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該乙酰丙酸或其酯被轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N縮酮，該縮酮被用作燃料添加劑或者用于塑料和其他聚合物生產(chǎn)的單體/共聚物。
43.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該化合物是一種內(nèi)酯。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該內(nèi)酯是4-戊內(nèi)酯。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中該4-戊內(nèi)酯被轉(zhuǎn)變?yōu)槔i草酸或纈草酸酯、同分異構(gòu)丁烯、丁二烯、或具有至少5個碳的烯烴中的一種或多種。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中該戊酸、戊酸酯或烯烴被進一步化學(xué)地或生物學(xué)地還原為烷烴。
47.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該內(nèi)酯是當歸-內(nèi)酯。
48.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該內(nèi)酯是2-氧代-戊內(nèi)酯。
49.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該內(nèi)酯是2-羥基-戊內(nèi)酯。
50.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該內(nèi)酯是5-羥基-5-甲基二氫呋喃_2(3H)-酮。
51.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該內(nèi)酯是5-羥基-5-甲基呋喃-2(5H)_酮。
52.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該內(nèi)酯被氧化為α’-當歸內(nèi)酯或α-當歸內(nèi)酯。
53.如權(quán)利要求47所述的方法，其中該內(nèi)酯被氧化為原-白頭翁素。
54.如權(quán)利要求44所述的方法，其中4-戊內(nèi)酯與甲醛反應(yīng)以產(chǎn)生亞甲基甲基丁內(nèi)酯。
55.如權(quán)利要求5至54中任一項所述的方法，其中該丁內(nèi)酯被進一步聚合化，可任選地與其他聚合構(gòu)造單元聚合為一種共聚物。
56.一種用于生產(chǎn)聚合材料或含有聚合物的產(chǎn)品的方法，包含如權(quán)利要求41或權(quán)利要求55所述的方法。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該聚合材料是尼龍、橡膠、聚丙烯酸酯或塑料。
58.一種用于制 造除草劑或燃料添加劑的方法，包含如權(quán)利要求40或42所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于將從糖或其他碳源獲得的丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛袃r值的C5材料，比如乙酰丙酸、乙酰丙酸酯、戊內(nèi)酯、以及其衍生物的程序。
文檔編號C07C53/00GK103180279SQ201180051824
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者A.L.贊格赫里尼 申請人:阿澤達公司