專利名稱：組合物、抗體、哮喘診斷方法和制備抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容涉及抗體的制備及其用途。公開(kāi)內(nèi)容的特定實(shí)施方案涉及對(duì)單鹵代酪氨酸具有親和性的抗體的制備和具有單鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)。背景哮喘是一種特征在于氣道短暫變窄的常見(jiàn)病。其是影響了美國(guó)約23百萬(wàn)成人的主要公眾健康問(wèn)題。認(rèn)為激活的嗜伊紅粒細(xì)胞浸潤(rùn)至支氣管中是哮喘的主要誘因。痰和肺活體樣本中的嗜伊紅粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和分泌的嗜伊紅粒細(xì)胞顆粒蛋白(如，嗜伊紅粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶(EPO))的存在表示哮喘的嚴(yán)重性。在哮喘病人中由于ΕΡ0，溴酪氨酸蛋白質(zhì)修飾增加，EPO催化次溴酸鹽的形 成，以及隨后溴酪氨酸的形成。之前使用氣相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)的研究發(fā)現(xiàn)了在來(lái)自哮喘患者的支氣管肺泡灌洗流體和痰樣本中，3-溴酪氨酸和3，5- 二溴酪氨酸各自顯著升高。對(duì)溴化蛋白質(zhì)在哮喘中的作用的研究受限于缺乏快速、簡(jiǎn)單的方法來(lái)監(jiān)控生物流體中的溴酪氨酸水平。公開(kāi)內(nèi)容概述如下將列出本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和新的特征，并且從在此所列的描述和證明是顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的以下描述應(yīng)當(dāng)看作是公開(kāi)內(nèi)容的說(shuō)明而不是以任何方式限制。溴酪氨酸修飾的蛋白質(zhì)可以用作用于氣道氧化應(yīng)激的穩(wěn)定的生物標(biāo)記。據(jù)信3-溴酪氨酸是體內(nèi)產(chǎn)生的主要溴酪氨酸；然而，之前的嘗試不能產(chǎn)生識(shí)別3-溴酪氨酸的有用抗體。例如,在1930年，Wormall報(bào)道了產(chǎn)生對(duì)抗3，5- 二溴酪氨酸的兔抗血清，但他的嘗試未能產(chǎn)生3-溴酪氨酸抗體。更近一些,Kambayashi等和Kato等產(chǎn)生了針對(duì)溴化蛋白質(zhì)的多克隆和單克隆抗體，但他們的抗體還是只能與3，5- 二溴酪氨酸反應(yīng)。這些產(chǎn)生識(shí)別3-溴酪氨酸的抗體的失敗可能源于用于產(chǎn)生抗原的條件。質(zhì)譜和核磁共振分析表明作為體外蛋白質(zhì)溴化的結(jié)果，相對(duì)于3-溴酪氨酸修飾，優(yōu)先產(chǎn)生二溴酪氨酸修飾。當(dāng)使用預(yù)期模擬體內(nèi)溴化的試劑時(shí)，可能難以產(chǎn)生良好的用于3-溴酪氨酸的抗原。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容描述了提供可以包括具有3-溴-4-羥基-苯甲酸部分的蛋白質(zhì)的抗原組合物。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還提供了生產(chǎn)這種抗原的方法。從這種抗原，可以鑒定出不僅顯示出識(shí)別單溴化的酪氨酸殘基并且還結(jié)合其他鹵化的酪氨酸殘基的對(duì)鹵代酪氨酸具有親和性的抗體。提供了生產(chǎn)這些對(duì)這種抗原以及鹵代酪氨酸(包括單鹵代酪氨酸)具有親和性的抗體的方法。提供了對(duì)具有鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)具有親和性的抗體以及包括結(jié)合鹵代酪氨酸的抗體的組合物。此外，公開(kāi)內(nèi)容證明了所公開(kāi)的抗體能夠區(qū)分來(lái)自健康對(duì)照和哮喘患者之間的人痰蛋白質(zhì)中的鹵代酪氨酸水平。提供了評(píng)價(jià)哮喘嚴(yán)重性的方法以及確定嗜伊紅粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。附圖簡(jiǎn)述以下將參照以下的附圖來(lái)描述公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案。

圖1是用于生產(chǎn)根據(jù)公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案的抗原的合成圖解。圖2是根據(jù)公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案生產(chǎn)的抗體的試驗(yàn)描繪。圖3是利用根據(jù)公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案生產(chǎn)的抗體獲取的數(shù)據(jù)的描繪。圖4是蛋白質(zhì)的描繪部分，和利用根據(jù)公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案生產(chǎn)的抗體獲取的數(shù)據(jù)。圖5是利用根據(jù)公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案生產(chǎn)的抗體獲取的數(shù)據(jù)的描述。描述在此將描述本發(fā)明的各種優(yōu)點(diǎn)和新的特征，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言從以下的詳細(xì)描述將變得顯而易見(jiàn)。 在之前和之后的描述中，通過(guò)說(shuō)明和描述來(lái)提供公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案。如將會(huì)認(rèn)識(shí)到的，公開(kāi)內(nèi)容能夠在各個(gè)方面有所改變而沒(méi)有脫離公開(kāi)內(nèi)容。因此，下文中所列的附圖和實(shí)施方案的描述應(yīng)視為本質(zhì)上是說(shuō)明性的，而不是作為限制。本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容提供了組合物、抗體、抗原、生產(chǎn)抗原的方法、生產(chǎn)抗體的方法和評(píng)價(jià)哮喘的方法，以及確定嗜伊紅粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。提供了制備抗體的方法。該方法可以包括將鹵代酪氨酸類似物(如3-溴-4-羥基-苯甲酸)摻入蛋白質(zhì)中，以形成抗原。該方法可以進(jìn)一步包括用該抗原免疫哺乳動(dòng)物宿主，并且從宿主收集對(duì)抗原具有親和性的抗體。根據(jù)實(shí)施例實(shí)施，該蛋白質(zhì)可以是鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)。根據(jù)這種方法，組合物包括通過(guò)用模擬3-溴酪氨酸的化合物修飾KLH提供的抗原。因此，提供了一種包括具有3-溴-4-羥基-苯甲酸部分的蛋白質(zhì)的組合物，例如，該蛋白質(zhì)是KLH。根據(jù)該公開(kāi)內(nèi)容的各個(gè)方面，這可以避免與體外蛋白質(zhì)溴化和主要生產(chǎn)二溴酪氨酸相關(guān)的問(wèn)題。然后可以在優(yōu)化單溴化的條件下溴化牛血清白蛋白(BSA)，并且隨后用于篩選雜交瘤細(xì)胞系和鑒定可能對(duì)生理上相關(guān)的酪氨酸修飾具有親和性的克隆。這種所得到的BTK-94C抗體對(duì)3-溴酪氨酸和3，5- 二溴酪氨酸具有親和性，對(duì)3-氯酪氨酸和3，5- 二氯酪氨酸也具有親和性，但對(duì)未修飾的酪氨酸、3-硝基酪氨酸或3-羥基酪氨酸不具有親和性(參見(jiàn)，例如，圖2和4)。還提供了使用次氯酸鹽的蛋白質(zhì)的氯酪氨酸修飾，次氯酸鹽是髓過(guò)氧化物酶的產(chǎn)物，髓過(guò)氧化物酶是在嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種酶。因?yàn)檫@種抗體看來(lái)似乎結(jié)合所有四種生理上相關(guān)的鹵化蛋白質(zhì)酪氨酸殘基，因此BTK-94C可以認(rèn)為是一種通用鹵代酪氨酸抗體。
因此，該公開(kāi)內(nèi)容的方法提供了一種對(duì)蛋白質(zhì)鹵代酪氨酸(并且在特定的實(shí)施方案中，單鹵代酪氨酸)具有結(jié)合親和性的抗體。鹵代酪氨酸可以是單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸之一或兩者。單齒代酪氨酸可以是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸之一或兩者。單鹵代酪氨酸也可以是3-溴酪氨酸和/或3-氯酪氨酸之一或兩者。二鹵代酪氨酸也可以是3，5- 二溴酪氨酸和/或3，5- 二氯酪氨酸之一或兩者。還提供了包括與抗原結(jié)合的本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的抗體的組合物，所述抗原是鹵代酪氨酸和/或鹵代酪氨酸蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的抗體的實(shí)施例實(shí)施可以克服與之前所用方法相關(guān)的各種問(wèn)題。盡管已經(jīng)存在幾種報(bào)道了與溴化蛋白質(zhì)反應(yīng)的多克隆和單克隆抗體，但那些抗體看來(lái)似乎只與二溴酪氨酸反應(yīng)，而不與3-溴酪氨酸反應(yīng)。因?yàn)?-溴酪氨酸是體內(nèi)觀察到的主要修飾，因此這是重要的限制。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)一步提供了可以包括將抗體暴露于體液以確定例如，一種或多種嗜伊紅粒細(xì)胞活性、炎癥和/或具有單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)的量的方法。還提供了評(píng)價(jià)哮喘嚴(yán)重性的方法。該方法可以包括使用對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性的抗體分析病人的痰，并且測(cè)量結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體的量。該方法可以是定性和/或定量中的一種或兩種。該方法可以包括關(guān)聯(lián)結(jié)合抗體的量，以確定炎癥的量。該方法可以分開(kāi)或一起包括使用結(jié)合抗體的量來(lái)監(jiān)控對(duì)哮喘發(fā)作的藥物反應(yīng)。還提供了確定體液中嗜伊紅粒細(xì)胞活性的方法。該方法可以包括將體液暴露于對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性的抗體，并且測(cè)量結(jié)合抗體的量來(lái)確定嗜伊紅粒細(xì)胞活性。體液可以是例如痰或灌洗流體。該方法還可以包括關(guān)聯(lián)結(jié)合抗體的量，例如以確定炎癥和/或藥物反應(yīng)。因此，用從哮喘患者和健康對(duì)照收集的人痰樣品測(cè)試了 BTK-94C。ELISA微矩陣分析證明了人痰樣品中的4種蛋白質(zhì)在哮喘患者中的鹵化水平提高。這些數(shù)據(jù)表明溴化是嗜伊紅粒細(xì)胞活性的特異性指示 并且這4種特異性蛋白質(zhì)響應(yīng)哮喘相關(guān)的嗜伊紅粒細(xì)胞活性而得到修飾。此外，這些蛋白質(zhì)的鹵化水平在監(jiān)控哮喘中是有用的。以下描述了一種新的單克隆抗體(BTK-94C)，其識(shí)別溴化和氯化蛋白質(zhì)。這些鹵代酪氨酸蛋白質(zhì)修飾是炎性細(xì)胞活性的表示。將這種抗體用作夾層ELISA中的檢測(cè)試劑來(lái)證明四種痰蛋白質(zhì)的鹵代酪氨酸水平在哮喘患者中是升高的。因此，BTK-94C抗體可以提供哮喘患者中炎癥的指示，并且這些ELISA可以證明對(duì)于預(yù)測(cè)或監(jiān)控哮喘或具有強(qiáng)烈炎性成分的其他疾病中的藥物反應(yīng)是有用的。實(shí)施例材料和方法牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Jackson ImmunoResearch實(shí)驗(yàn)室。3_漠_4_輕基苯甲酸購(gòu)自 Indofine Chemical Company Inc。3，5_ 二漠 _4_ 輕基苯甲醒、3，5_ 二氣 _4_ 輕基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、3-硝基酪氨酸和L-酪氨酸購(gòu)自Sigma-Aldrich。鑰孔鐵血藍(lán)蛋白(KLH)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、腹水調(diào)節(jié)試劑、Melon單克隆抗體純化試劑盒和生物素化試劑盒EZ-1ink硫-NHS-生物素購(gòu)自Pierce-Thermo Scientific(Rockford, IL)。次溴酸鈉溶液購(gòu)自Fisher-Thermo Scientific。如增補(bǔ)數(shù)據(jù)中所述的，購(gòu)買了用于23個(gè)ELISA的捕獲抗體。實(shí)施例溴化抗原和相關(guān)修飾蛋白質(zhì)的制備
對(duì)于抗原的制備，使用了如“A Simple Modified Carbodiimide Method forConjugation of Small-Molecular-Weight Compounds to Immunoglobulin G withMinimal Protein Crosslinking”(使用最小蛋白質(zhì)交聯(lián)將小分子量化合物綴合免疫球蛋白 G 的簡(jiǎn)單改進(jìn)碳二亞胺方法)，Minh-Tam B.Davis and James F.Preston, AnalyticalBiochemistryll6,402-407 (1981)中所述的碳二亞胺方法的改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案，在此將該篇文獻(xiàn)引入作為參考。簡(jiǎn)而言之，將0.12mM3-Br-HBA溶解于2.5ml甲醇中，并且與2.5ml的20mM磷酸鉀緩沖液(pH5.0)中的0.75mM EDC在室溫下混合2分鐘。然后將該5ml溶液與8ml200mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中的2.5mg/ml KLH混合并且使其在室溫下孵育過(guò)夜。通過(guò)在4°C下相對(duì)120mM PBS的滲析來(lái)除去任何剩余的EDC和3_Br_HBA。滲析后，通過(guò)在4°C下在50，OOOg下離心2小時(shí)來(lái)除去沉淀物。通過(guò)測(cè)量吸光值來(lái)定量pH8.0的200mM磷酸鉀緩沖液中的修飾抗原，在280nm處測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，在310nm處測(cè)量溴化。將修飾的KLH 等分，并且存儲(chǔ)在-80 °C。在 Washington State University Monoclonal AntibodyCenter (Pullman)，將小鼠免疫，收集血清以及雜交瘤細(xì)胞系及其上清液，產(chǎn)生腹水和測(cè)定抗體同種型。根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案，使用EZ-Link硫-NHS-LC-生物素化試劑盒(Pierce,Rockford, IL)，將BTK-94C抗體生物素化。按照之前報(bào)道的，使用次溴酸鈉(Fisher Scientif ic, Pittsburg, PA)制備了溴化BSA。為了最大化3-溴酪氨酸相對(duì)于3，5- 二溴酪氨酸的含量，按照之前報(bào)道的，我們使用了優(yōu)化條件。即，將Iml的lOmgBSA/ml與200 μ I新鮮制備的20mM次溴酸鈉(在ρΗ7.2的PBS中)在25°C下反應(yīng)15小時(shí)。然后將溶液在4°C下相對(duì)PBS滲析，以除去未反應(yīng)的試劑。為了產(chǎn)生氯化BSA和硝基化BSA，按照之前所報(bào)道的，分別使用了 6%次氯酸鈉(The CloroxCompany)和過(guò)亞硝酸鹽(peroxynitrite) (Millipore Corporation, Boston, MAX實(shí)施例，ELISA微矩陣試驗(yàn)和使用修飾酪氨酸類似物的抑制研究按照之前所述的進(jìn)行了夾層ELISA微矩陣，除了通過(guò)綴合辣根過(guò)氧化物酶的山羊-抗-小鼠-1gM (Jackson ImmunoReasearch Laboratories)結(jié)合生物素釀胺(biotinyltyramide) 產(chǎn)生了最初的生物素信號(hào)。簡(jiǎn)而言之，在離心除去任何顆粒后，將痰樣品在PBS中的0.1%BSA中稀釋5倍。在三個(gè)芯片上分析了 25 μ I每種稀釋的樣品/芯片。對(duì)于每個(gè)捕獲抗體，每個(gè)芯片含有4個(gè)重復(fù)斑點(diǎn)，使得對(duì)于23個(gè)ELISA中的每一個(gè)，總共存在12個(gè)復(fù)制品/樣品(參見(jiàn)，例如，以下的表1)。表S1-選定的血漿生物標(biāo)記以及將這些蛋白質(zhì)與哮喘相關(guān)的參考
權(quán)利要求
1.一種抗體，其對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中單鹵代酪氨酸是氯酪氨酸。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中抗體還具有對(duì)二鹵代酪氨酸的結(jié)合親和性。
6.一種組合物，其包含與單鹵代酪氨酸結(jié)合的抗體。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
9.一種組合物，其包含具有3-溴-4-羥基苯甲酸部分的蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中蛋白質(zhì)是鑰孔A血藍(lán)蛋白(KLH)。
11.一種用于評(píng)價(jià)哮喘嚴(yán)重性的方法，其包括: 使用對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性的抗體分析病人的痰；和 測(cè)量與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的量。
12.權(quán)利要求11的方法，其中測(cè)量是定性和/或定量中的一種或兩種。
13.權(quán)利要求11的方法，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
14.權(quán)利要求11的方法，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
15.權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括關(guān)聯(lián)結(jié)合的抗體的量，以確定炎癥的量。
16.權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括使用結(jié)合的抗體的量來(lái)監(jiān)控對(duì)哮喘發(fā)作的藥物反應(yīng)。
17.一種用于確定體液中嗜伊紅粒細(xì)胞活性的方法，該方法包括: 將體液暴露于對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性的抗體；和 測(cè)量結(jié)合的抗體的量，以確定嗜伊紅粒細(xì)胞活性。
18.權(quán)利要求17的方法，其中體液是痰。
19.權(quán)利要求17的方法，其中單鹵代酪氨酸是蛋白質(zhì)的一部分。
20.權(quán)利要求17的方法，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
21.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括關(guān)聯(lián)結(jié)合的抗體的量，以確定炎癥和/或藥物反應(yīng)。
22.—種用于制備抗體的方法,該方法包括: 將3-溴-4-羥基-苯甲酸摻入蛋白質(zhì)中，以形成抗原； 用該抗原免疫哺乳動(dòng)物宿主；和 從宿主收集對(duì)抗原具有親和性的抗體。
23.權(quán)利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)是鑰孔鐵血藍(lán)蛋白(KLH)。
24.權(quán)利要求22的方法，其中抗體對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中單鹵代酪氨酸是溴酪氨酸和/或氯酪氨酸中的一種或兩種。
26.權(quán)利要求22的方法，其中抗體對(duì)蛋白質(zhì)鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性。
27.權(quán)利要求26的方法,其中鹵代酪氨酸是單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸中的一種或兩種。
28.權(quán)利要求27的方法，其中單鹵代酪氨酸是3-溴酪氨酸和/或3-氯酪氨酸中的一種或兩種。
29.權(quán)利要求27的方法，其中二鹵代酪氨酸是3，5-二溴酪氨酸和/或3，5-二氯酪氨酸中的一種或兩種。
30.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括將抗體暴露于體液，以確定嗜伊紅粒細(xì)胞活性。
31.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括將抗體暴露于體液，以確定炎癥。
32.權(quán)利要求22的方法,進(jìn)一步包括將抗體暴露于體液，以確定具有單鹵代酪氨酸和/或二鹵代酪氨酸部分的蛋白質(zhì)的量。`
全文摘要
本發(fā)明提供了用于制備抗體的方法，該方法包括將3-溴-4-羥基-苯甲酸摻入蛋白質(zhì)中，以形成抗原，用該抗原免疫哺乳動(dòng)物宿主，和從宿主收集對(duì)抗原具有親和性的抗體。提供了對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性的抗體，以及包含與單鹵代酪氨酸結(jié)合的抗體的組合物。還提供了包含具有3-溴-4-羥基-苯甲酸部分的蛋白質(zhì)的組合物。提供了用于評(píng)價(jià)哮喘嚴(yán)重性的方法，該方法包括使用對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性的抗體分析病人的痰，并測(cè)量與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的量。還提供了測(cè)定體液中嗜伊紅粒細(xì)胞活性的方法，該方法包括將體液暴露于對(duì)單鹵代酪氨酸具有結(jié)合親和性的抗體，并測(cè)量結(jié)合的抗體的量，以確定嗜伊紅粒細(xì)胞活性。
文檔編號(hào)C07K16/44GK103228675SQ201180057478
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者H·金, R·C·贊伽 申請(qǐng)人:巴特勒紀(jì)念研究院