一種生產(chǎn)血液來(lái)源蛋白質(zhì)注射制劑的方法，以及使用上述方法獲得的蛋白質(zhì)物料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)血液來(lái)源的蛋白物料的注射級(jí)藥用劑型產(chǎn)品的方法，包括以下步驟：將聚合物/鹽雙水相系統(tǒng)中的原物料在苯酚中分級(jí)，通過(guò)辛酸沉淀純化系統(tǒng)上層水相，然后通過(guò)熱凝法純化系統(tǒng)下層水相，通過(guò)層析增加雙相中物料純度，通過(guò)對(duì)兩種制備產(chǎn)物進(jìn)行納米過(guò)濾來(lái)去除病毒顆粒、成型、穩(wěn)定化和包裝獲得的物料。
【專利說(shuō)明】一種生產(chǎn)血液來(lái)源蛋白質(zhì)注射制劑的方法，以及使用上述方法獲得的蛋白質(zhì)物料
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對(duì)治療用蛋白純化領(lǐng)域，特別是生產(chǎn)血液來(lái)源的病毒載量降低的注射級(jí)蛋白產(chǎn)品劑型的方法，例如免疫球蛋白和/或白蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002]血漿來(lái)源制品，例如人白蛋白、人免疫球蛋白和異源抗蛇毒血清是治療許多疾病、事故和受傷的重要藥物。由于目前對(duì)這些制品的需求量增加，因此改進(jìn)生產(chǎn)方法效率以提供足夠的藥品來(lái)滿足需求是很重要的，這可避免這類藥物在短期內(nèi)的全球供應(yīng)短缺情況。
[0003]為獲得血液來(lái)源的蛋白制品，特別是血漿，目前已有一些方法。其中我們可看到一些方法:
[0004]1.血漿分級(jí)
[0005]Cohn血漿分級(jí)法(冷醇分級(jí))是血漿來(lái)源的生物制品行業(yè)使用的最常見方法(參見 see Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, MelinΜ.，Taylor HL1946."Preparation and properties of serum and plasma proteins.1V.A system for the separation into fractions of the protein and lipoproteincomponents of biological tissue and fluids' Journal of the American ChemicalSociety, 68:459-475).為改進(jìn)原始方法的生產(chǎn)成本和效能相關(guān)方面，一些研究人員已提出在工藝中采用反應(yīng)性較低或抑制性步驟的改進(jìn)方案(參見Hink J.，Hidalgo J.，Seeberg
V.,Johnson FF1957." Preparation and properties of a heat-treated human plasmaprotein fraction."VoxSanguinis2:174-186;Kistler, P, Nitschmann, H.1962."LargeScale Production of Human plasma Fractions，，，VoxSanguinis7:414-424，Schneider, W.,ffolter, D., McCarty, L.1976."Alternatives for PlasmaFractionation.^VoxSanguinis, (31)2:141-151)。而且，其它的改進(jìn)方案提示基于使用沉淀劑、一種或多種層析步驟或其組合將其并入純化方法。最常使用的沉淀劑為硫酸銨、聚乙二醇和辛酸。
[0006]2.使用雙水相系統(tǒng)(ATPS)的血漿分級(jí)
[0007]已有報(bào)道使用雙水相系統(tǒng)(ATPS)用于具有高商業(yè)價(jià)值化合物的初級(jí)回收和分級(jí)。ATPS由聚合物-聚合物、聚合物-鹽和鹽-醇混合物組成，并已用于生物制品(例如蛋白、基因材料)細(xì)胞或其細(xì)胞器、有機(jī)物，例如香料和染料、重金屬和某些藥物的初級(jí)回收和部分純化(參見 Benavides, J., Rito-Palomares, Μ.2008."Review:Practical experiencesfrom the development of two-phase Aqueous Processes for the recovery of highvalue biological products'J ChemTechnolBiotechnol3:133-142;Huddleston, J., A.Veide, K.Kohler, J.Flanagan, S-0.Enfors and A.Lyddiat.1991.〃The molecular basisof partitioning in Aqueous two-phase systems".Tibtech9:381-388))。
[0008]U.S.Patent4, 684，723公開了一種使用ATPS從血漿或培養(yǎng)基中存在的其它蛋白和核苷酸分離α-蛋白酶抑制劑的方法。同樣，在專利申請(qǐng)W02010/062244A1中，其提出了 ATPS提取二階段中治療用蛋白(特別是單克隆抗體)的回收和部分純化方法。在第一個(gè)階段中，抗體會(huì)分布在上相中，而在第二個(gè)階段中，其在該相中沉淀。然后將其回收，重新溶解以通過(guò)層析來(lái)進(jìn)一步純化。在另一發(fā)明(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010/0179252)中提出采用多相系統(tǒng)，包括兩種類型的聚合物，一種是酸性的，一種是醚類的，以及至少一種用于分離生物分子、細(xì)胞或顆粒的鹽。此外，專利申請(qǐng)W02010/080062提車了一種用ATPS聚合物-鹽分離生物分子的方法，其中目標(biāo)分子，例如一種單克隆抗體，分別在不富含聚合物的相中。此外，還有針對(duì)ATPS抗體分離條件、提取和純化方面的研究。(參見AndreWSj BA，Nielsen，S.，AsenjojJA2007，^Partinioning and purification of monoclonalantibodies in Aqueous two-phase systems"，Bioseparation6(5):303-313;Azevedoj A.，Rosa, P.，F(xiàn)erreira, F.Aires-BarrosjM.2007，"Optimisation of Aqueous two-phaseextraction of human antibodies"，J.Biotechnologyl32(2):209-217，and Rosa, P., Azevedo, A., Sommerfeldj S., Mutter, Mj Aires-Barrosj M., Backer，W.2009，"Application ofAqueous two-phase systems to antibody purification:A mult1-phase approach"，J.Biotechnologyl39(4):306-313)。
[0009]而且，已有關(guān)于在這類系統(tǒng)中分離白蛋白的研究發(fā)表，研究參數(shù)包括pH、溫度、聚合物和鹽的類型。(參見 Giindiiz，U.2000."Partitioning of bovine serum albumin inan Aqueous two-phase system:optimization of partition coefficient"，Journal ofChromatography B:Biomedical Sciences and Applications，743(1-2):259-262.;Farruggia, B.，NerlijB.，StangjG.2003.〃Study of the serum albumin-polyethyleneglycoIinteraction to predict the protein partitioning in Aqueous two-phasesystems."Journal of Chromatography B，798 (I): 25-33，Lu，Y.，Yang, Y.，Zhao, X.，Xiaj C?2010〃Bovine serum albumin partitioning in polyethylene glycol(PEG)/potassiumcitrate Aqueous two-phase systems."Food and Bioproducts Processing.88 (I):40-46; Garza, Μ., Ritoj M.，Serna, S., Benavides, J.2010."Potential of Aqueous Two-PhaseSystems constructed on Flexible devices:Human serum albumin as proof ofconcept".Process Biochemistry45(7):1082-1087)
[0010]3.通過(guò)辛酸 沉淀來(lái)純化免疫球蛋白
[0011]Steinbuchj M.，Audranj R.在1969年首次通過(guò)辛酸沉淀法來(lái)純化免疫球蛋白("The isolation of IgG from mammalian be With The aid of caprylic acid〃.Arch Biochem.Biophysicsl34, 279-284)。之后，基于這一方法，發(fā)明了數(shù)種方法。例如，美國(guó)專利4，164，495 (Hansen, 1979)使用l-8%v/v PEG和0.1_5%ν/ν辛酸來(lái)沉淀蛋白。專利5，075，425 (Kotitschke et al.1991)使用2.5%辛酸沉淀污染蛋白，然后通過(guò)DEAE-S印hadex吸附。類似地，專利申請(qǐng)?zhí)朩02006064373 (Bloy et al.，2006)提出使用2.5%辛酸來(lái)沉淀蛋白污染物。同樣，專利US6955917(Alred et al., 2003)提出使用40%辛酸鹽(15-50mM，優(yōu)選20mM)溶液用于去除污染蛋白和對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行病毒滅活，然后通過(guò)離子交換層析。該工藝與專利申請(qǐng)?zhí)杻?cè)200508293(!^5111丨3(:七，6七al, 2005)中提出的類似，使用辛酸鹽或庚酸鹽溶液用于同一目的。
[0012]最后，有一些專利提出使用辛酸用于其它目的。美國(guó)專利5，164，487 (Kothe etal, 1992)中提出使用濃度為0.4-1.5%的辛酸用于去除血管活性物質(zhì)和蛋白水解酶,然后再進(jìn)行離子交換層析；美國(guó)專利20070244305 (Parkinnen，2007)提出使用PEG沉淀污染蛋
白，然后使用辛酸滅活病毒。
[0013]這些專利中提出的大多數(shù)方法產(chǎn)量約為60%，起始于冷醇分級(jí)的最初階段。
[0014]4.白蛋白鈍化
[0015]對(duì)于白蛋白，差別化的熱變性或選擇性熱凝是用于從血漿或包含蛋白的混合物中純化的方法。美國(guó)專利4，156，681提出將血漿在乙醇和辛酸鈉中加熱至68°C，然后加入PEG可回收沉淀的白蛋白。類似地，在美國(guó)專利3，992，367中，血漿加熱至60°C，然后用乙醇沉淀白蛋白。在另一發(fā)明(U.S.4，222，934)中，血漿加熱至60°C，然后加熱PEG去除變性的沉淀蛋白，用等電沉淀來(lái)回收白蛋白。而且，在美國(guó)專利4，177，188中，在熱處理前回收免疫球蛋白。
[0016]因此，目前有工藝從血漿、血清、部分Cohn法組分或其它包含白蛋白和/或免疫球蛋白的起始物料回收，然后采用選擇性熱凝或辛酸沉淀來(lái)分別純化白蛋白和免疫球蛋白。但是，到目前為止，尚無(wú)對(duì)從雙水相系統(tǒng)(ATPS)中獲得的組分應(yīng)用此類純化技術(shù)的報(bào)道。
[0017]本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)的局限，其展示了一條可獲得血液來(lái)源的病毒載量降低的人用注射級(jí)蛋白制品劑型的生產(chǎn)線，這是使用ATPS獲得免疫球蛋白和白蛋白相關(guān)的最重要的一個(gè)方面(在現(xiàn)有技術(shù)中未曾描述過(guò))。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明為一種生產(chǎn)血液來(lái)源的病毒載量降低的注射級(jí)蛋白產(chǎn)品劑型，該方法包括以下步驟(圖1和4):
[0019]a.通過(guò)加入一種聚合物和至少一種鹽使雙水相系統(tǒng)的起始物料分級(jí)；
[0020]b.向雙相系統(tǒng)中加入苯酚作為滅活病毒的第一步；
[0021]c.將雙水相系統(tǒng)的上下雙相分級(jí)為雙水相；
[0022]d.通過(guò)脂肪酸沉淀系統(tǒng)上層水相來(lái)純化產(chǎn)品；
[0023]e.通過(guò)熱凝方法來(lái)純化系統(tǒng)下層水相中的產(chǎn)品；
[0024]f.在系統(tǒng)上下雙相的純化步驟中用兩個(gè)步驟來(lái)去除形成的變性蛋白沉淀物；
[0025]g.通過(guò)層析增加從上下雙相中獲得 的產(chǎn)品純度；
[0026]h.將前一步驟中獲得的產(chǎn)物進(jìn)行納米純化以去除病毒顆粒；以及
[0027]1.對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行制劑、穩(wěn)定化和滅菌。
[0028]本發(fā)明方法所用起始物料可選自血漿、血清、通過(guò)Cohn法獲得的組分或任何其它含有血漿來(lái)源蛋白產(chǎn)品(特別是白蛋白和/或免疫球蛋白)的物料。
[0029]最初，進(jìn)行系統(tǒng)中的起始物料分離，包括雙水相。加入一種聚合物和一種鹽，其中所選聚合物為分子量為1000-6000Da的聚乙二醇，并優(yōu)選3350Da的聚乙二醇，其濃度范圍為 6-15%w/v，優(yōu)選 6-9%w/v。
[0030]在分級(jí)中所有鹽為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨和檸檬酸鈉，優(yōu)選使用磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，濃度為10-20%w/v，優(yōu)選為15-20%w/v。
[0031]此外，采用一種不參與雙相形成的鹽，但其可影響系統(tǒng)中溶液分級(jí)，優(yōu)選使用氯化鈉，濃度為5-20%w/v，優(yōu)選為12-15%w/v。
[0032]在ρΗ5.5-7.5進(jìn)行分級(jí)步驟，優(yōu)選pH約為6，并在室溫下進(jìn)行(20-25°C )。[0033]作為第一步的病毒滅活步驟，本發(fā)明采用苯酚濃度為0.05-0.3%v/v，在優(yōu)選的實(shí)施例中使用苯酚濃度為0.25%v/v。
[0034]病毒滅活后，我們進(jìn)行雙水相系統(tǒng)的上下水相分離，使用的工藝可選自靜置和分離、靜置和過(guò)濾、靜置和棄上清或簡(jiǎn)單離心的組合。
[0035]下一步是將從ATPS獲得的上相中的產(chǎn)物純化。該相富含免疫球蛋白，且其純化需要進(jìn)行辛酸沉淀，辛酸濃度為1-6%ν/ν，優(yōu)選濃度為1.5-2%v/v。
[0036]同時(shí)進(jìn)行熱凝來(lái)純化系統(tǒng)下相中富含白蛋白的產(chǎn)物。該工藝在60-70 V下進(jìn)行，優(yōu)選65°C。該操作在0.012M辛酸鈉和9%乙醇v/v中。
[0037]為增加系統(tǒng)中上相中產(chǎn)物的純度，采用的層析步驟包含離子交換層析、親和層析或疏水交換層析。系統(tǒng)下相中獲得產(chǎn)物的最終純化階段采用離子交換層析。
[0038]通過(guò)納米過(guò)濾從本發(fā)明工藝獲得的產(chǎn)物中去除病毒顆粒，采用20nm排除濾膜。該產(chǎn)物采用向免疫球蛋白和白蛋白溶液分別加入例如蔗糖辛酸鈉等物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定化。免疫球蛋白制劑可保持為溶液或凍干粉。對(duì)于白蛋白，最后一步為60 C巴氏消毒10小時(shí)。最后，通過(guò)0.22mm排除濾膜來(lái)對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行滅菌。
[0039]本發(fā)明的其它內(nèi)容為上述方法獲得的產(chǎn)物。通過(guò)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例獲得的白蛋白和免疫球蛋白為注射級(jí)溶液產(chǎn)品，病毒載量降低，符合相應(yīng)規(guī)格(WH0，2010.抗蛇毒免疫球蛋白的生產(chǎn)、控制和管理指南、WHO, 2004EC0G人血漿制品病毒安全性的病毒滅活和去除指南)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1.獲得無(wú)病毒的超 免疫馬血漿來(lái)源的蛋白制品的發(fā)明方法流程圖。其顯示了在該工藝每階段中獲得的產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度值。標(biāo)有星號(hào)的操作示病毒滅活或去除步驟。關(guān)鍵詞:Igs=免疫球蛋白；AV=抗蛇毒素
[0041]圖2.用于從超免疫馬血漿中生產(chǎn)抗蛇毒素的樣本凝膠過(guò)濾方法。使用Superdex20010/300GL 柱，用 150mM NaCl 緩沖液，20mMTris_HCl，pH7.5 進(jìn)行洗脫。A.超免疫馬血漿；B.ATPS重懸上相；C.經(jīng)辛酸沉淀后獲得的過(guò)濾產(chǎn)物。
[0042]圖3.用于獲得馬白蛋白的樣本凝膠過(guò)濾方法。使用Superdex20010/300GL柱，用150mM NaCl緩沖液，20mMTris-HCl，pH7.5進(jìn)行洗脫。A.超免疫馬血漿；B.ATPS下相；C.經(jīng)熱凝獲得的過(guò)濾產(chǎn)物的陽(yáng)離子交換層析。
[0043]圖4.獲得無(wú)病毒的人類血漿來(lái)源的靜脈注射用蛋白制品的發(fā)明方法流程圖。其顯示了在該工藝每階段中獲得的產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度值。標(biāo)有星號(hào)的操作示病毒滅活或去除步驟。關(guān)鍵詞:Igs=免疫球蛋白
[0044]圖5.用于從人類血漿中獲得Y免疫球蛋白的樣本凝膠過(guò)濾方法。使用Superdex20010/300GL 柱，用 150mM NaCl 緩沖液，20mMTris_HCl，pH7.5 進(jìn)行洗脫。A.人類血漿；B.ATPS重懸上相；C.經(jīng)辛酸沉淀后獲得的過(guò)濾產(chǎn)物的陰離子交換層析。
[0045]圖6.用于獲得人白蛋白的樣本凝膠過(guò)濾方法。使用Superdex20010/300GL柱,用150mM NaCl緩沖液，20mMTris-HCl, ρΗ7.5進(jìn)行洗脫。Α.人類血漿；B.ATPS下相；C.下相陽(yáng)離子交換層析。【具體實(shí)施方式】
[0046]本發(fā)明包括一種純化血漿(血液)來(lái)源的蛋白制品的方法，尤其適用于從含有多種蛋白質(zhì)的混合物中同時(shí)分級(jí)回收注射級(jí)品質(zhì)的免疫球蛋白和白蛋白。本方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，使用價(jià)格實(shí)惠的試劑，并且與科恩氏法(Cohn method)不同的是，不需要特殊的設(shè)備來(lái)滿足嚴(yán)格的溫度要求。使用本方法所獲得的產(chǎn)品，(主要是免疫球蛋白和白蛋白)呈現(xiàn)出高水平的品質(zhì)(>90%)和性能。除免疫球蛋白和白蛋白以外，本方法也適用于分級(jí)回收血液中的其他蛋白質(zhì)，如凝血因子等。還可應(yīng)用于從酶解后的血漿中或純化得到的免疫球蛋白中純化免疫球蛋白片段(F(ab’)2或Fab)。此外，在得到各產(chǎn)品的過(guò)程中有2次滅活和I次去除病毒的步驟，可以減少病毒載量以保證安全，符合相關(guān)條例的規(guī)定。本方法還適用于超免疫血漿中的抗體純化，例如抗蛇毒素血清和抗毒素的生產(chǎn)。
[0047]起始物料可以是血漿或者血清，經(jīng)過(guò)或不經(jīng)蛋白水解酶水解，血漿或血清的某些組分，其他含有人源或動(dòng)物來(lái)源的免疫球蛋白和/或白蛋白的混合物。
[0048]起始物料的分級(jí)是通過(guò)ATPS系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。在此種分級(jí)中，目的產(chǎn)物對(duì)組成該系統(tǒng)的雙水相之一具有親和力，這一點(diǎn)不同于目的產(chǎn)物所在混合物的其他組分。不同水相的形成，是通過(guò)混合兩種或兩種以上特定濃度的親水性物質(zhì)得到的。這些物質(zhì)由于各自水合作用相關(guān)的熱力學(xué)力的不同，在特定濃度下在水中不混溶。該系統(tǒng)中的水即原本存在于起始物料中的水。該系統(tǒng)包含一種水溶性聚合物，一種水溶性鹽，以及另一種涉及溶質(zhì)分級(jí)過(guò)程但不參與兩種水相形成的水溶性鹽。該聚合物為聚乙二醇(PEG)，分子量范圍在1000至6000Da之間，主要分級(jí)至上層水相；鹽為磷酸鉀，磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，主要分級(jí)至下層水相；不涉及水相形成的鹽為氯化鈉。磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的比例決定系統(tǒng)的酸堿度(pH);隨著磷酸二氫鉀的增加，系統(tǒng)pH降低。預(yù)期的蛋白質(zhì)分級(jí)所需的pH在5.5至7.5之間，溫度在20至25°C之間(室溫)。此外，加入苯酚以在分級(jí)過(guò)程中滅活起始物料中存在的病毒顆粒。苯酚的抗病毒能力在于其能夠?qū)Σ《镜牡鞍缀椭|(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理破壞。
[0049]將系統(tǒng)各組分按照以下濃度分別加入到起始物料中，同時(shí)持續(xù)攪拌:苯酚0.05-0.3%v/v,聚乙二醇6_15%w/v,磷酸鉀10_20%w/v,氯化鈉5_20%w/v ;更優(yōu)選的是,苯酹
0.25%v/v,聚乙二醇6-9%w/v,磷酸鉀15-20%w/v,氯化鈉15%w/v。各組分加入的順序可以改變，但建議等待前一組分完全溶解后再加入下一組分。當(dāng)所有組分加入后，混合物應(yīng)再持續(xù)攪拌一小時(shí)。然后靜置，以利于各相的形成。注意各組分濃度用w/v(質(zhì)量體積比)表示，因?yàn)槠鹗嘉锪咸峁┝私M成ATPS系統(tǒng)所需的水，因此有利于各組分以固體形式而非溶液形式添加。這是一項(xiàng)改進(jìn)，因?yàn)楫?dāng)放大本方法的生產(chǎn)規(guī)模時(shí)，無(wú)需準(zhǔn)備多種成分的溶液和各種不同的容器。
[0050]當(dāng)各相形成后，不同的環(huán)境特性和蛋白質(zhì)本身的特性，如蛋白質(zhì)分子量，蛋白濃度，酸堿度，離子強(qiáng)度和系統(tǒng)各組分的濃度，決定了各蛋白質(zhì)的分級(jí)。在此條件下，白蛋白和其他雜蛋白分配至富鹽的下層水相，免疫球蛋白和其他雜蛋白分配至上層水相。與保持懸浮的白蛋白不同，免疫球蛋白在上層水相中發(fā)生沉淀，從而使其在此相中的濃縮可以一步完成。這是另一項(xiàng)改進(jìn)，因?yàn)楸痉椒ò殉醪郊兓偷鞍诐饪s這兩組操作聯(lián)合了起來(lái)。
[0051]各相的分級(jí)可以通過(guò)過(guò)濾、離心或者傾析實(shí)現(xiàn)。從這一步驟往后，每一相進(jìn)入相互平行的純化路線。以下將分別描述每條純化路線(圖1和4):
[0052]從上層ATPS相中純化免疫球蛋白[0053]當(dāng)各相分級(jí)之后，將上層相中回收的沉淀重懸于一定體積的水中。此一體積的水應(yīng)能使全部沉淀溶解，優(yōu)選的體積為少于或等于初始體積，以使產(chǎn)物具有恰當(dāng)?shù)臐舛?。攪拌懸液直至團(tuán)塊完全溶解。然后加入一種脂肪酸，以沉淀并變性雜蛋白，而使免疫球蛋白留在懸液中。該脂肪酸作用的濃度范圍是1_6%ν/ν，優(yōu)選的濃度介于1.5_2%v/v之間。該脂肪酸可以由6-8個(gè)碳原子組成，優(yōu)選的是8個(gè)碳原子(辛酸)。沉淀過(guò)程可以選擇在PH5-8之間進(jìn)行，不影響所獲結(jié)果。在沉淀過(guò)程中必須進(jìn)行劇烈的攪拌，并持續(xù)30-60分鐘。然后，所產(chǎn)生的沉淀通過(guò)微濾或離心去除。此外，這一步驟對(duì)有包膜病毒能夠起到滅活的作用。非電離形式的辛酸分子為親脂性，能夠破壞和穿透病毒的脂雙層以及膜上的蛋白質(zhì)。
[0054]然后，將含有免疫球蛋白的濾液或上清通過(guò)一種色譜柱，可選自陰離子交換、親和層析或疏水交換層析，以提高純度。
[0055]從下層ATPS相中純化白蛋白
[0056]通過(guò)透析或滲濾去除富含白蛋白的下層相(圖1和4)中來(lái)自ATPS系統(tǒng)的鹽。這一過(guò)程是利用具有分子大小孔徑的濾膜來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其孔徑小于或等于30kDa分子大小。然后，通過(guò)一種選擇性的熱凝固過(guò)程對(duì)溶液進(jìn)行處理，加熱至60-70°C之間，優(yōu)選的是65°C，持續(xù)
0.5至2小時(shí)。這一步驟將其余的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)而將白蛋白留在溶液中，因?yàn)槠溆嗟难獫{蛋白在這一溫度均發(fā)生變性。利用辛酸鈉和N-乙酰氨酸鈉等試劑來(lái)保持白蛋白在這一溫度的穩(wěn)定性，優(yōu)選的是0.02-0.1M的辛酸鈉，更優(yōu)選的濃度是0.012M。加熱時(shí)加入5_15%v/V的乙醇，更優(yōu)選的濃度是9%v/v，以促進(jìn)其余蛋白的沉淀。加熱后冷卻至室溫，并將pH值調(diào)整到5。產(chǎn)生的沉淀通過(guò)微濾或離心分級(jí)去除，并回收懸液中的白蛋白。產(chǎn)物純化過(guò)程的最后一步是將溶液通過(guò)一種層析柱，經(jīng)過(guò)一個(gè)特殊步驟，通過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂(磺酸或者羥甲基)。
[0057]兩種藥物制劑的納濾、制劑制備、穩(wěn)定化和包裝
[0058]白蛋白和免疫球蛋白的溶液均通過(guò)類似的方法進(jìn)行納米過(guò)濾、制劑、穩(wěn)定化和包裝(圖1和4)。納米過(guò)濾 是一個(gè)基于尺寸大小排阻的去除病毒步驟，使用20 μ m大小孔徑的濾器。在免疫球蛋白溶液中存在抗病毒抗體，因此病毒顆粒以抗體病毒復(fù)合物的形式被過(guò)濾去除，而在白蛋白制劑中則直接以病毒顆粒的形式被去除。各溶液經(jīng)納濾后，按照處方對(duì)相應(yīng)的藥物進(jìn)行制劑。免疫球蛋白的制劑包含:經(jīng)30kDa排阻濾膜超濾的蛋白溶液濃度
1.0至10.0g/dL ;pH值在5-7之間，優(yōu)選的是5 ；5%的蔗糖作為穩(wěn)定劑以及0.9%的氯化鈉。產(chǎn)品經(jīng)0.22 μ m排阻膜過(guò)濾消毒，然后進(jìn)行包裝。產(chǎn)品可凍干，也可保持液態(tài)。
[0059]經(jīng)過(guò)納濾后，白蛋白的制劑包含:經(jīng)IOkDa排阻濾膜超濾的蛋白溶液濃度20g/dL ；pH值在6.5-7.5之間，優(yōu)選的是7 ;辛酸鈉(%----)作為穩(wěn)定劑以及0.9%的氯化鈉。藥物經(jīng)消毒、包裝后在60°C進(jìn)行巴氏消毒10小時(shí)。巴氏消毒法利用較高的溫度能夠滅活有包膜和無(wú)包膜病毒。根據(jù) Kempf, C.，Stucki, M.，Boschetti, N.2007.“Pathogen inactivationand removal procedures used in the production of intravenous immunoglobulins，，，Bi0l0gicalS35:35-42，巴氏消毒法作用于包膜病毒的脂雙層，使脂質(zhì)由固態(tài)變成液態(tài)，從而穩(wěn)定病毒顆粒。
[0060]對(duì)以下各實(shí)施例的描述將有助于更好地理解本發(fā)明的方法。所提供的各實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明闡述本發(fā)明，而絕不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明應(yīng)用范圍的限制。
[0061]實(shí)施例[0062]實(shí)例1.從超免疫馬血漿中生產(chǎn)抗蛇毒血清和白蛋白。
[0063]為從同一批富含抗蛇毒抗體的超免疫馬血清中獲取免疫球蛋白和白蛋白，將IL上述血漿通過(guò)“水二相聚合物鹽系統(tǒng)”進(jìn)行分級(jí)。該血漿來(lái)自用三色矛頭蝮、中美巨蝮和中美響尾蛇毒素免疫的馬匹體內(nèi)。起始物料含有63%免疫球蛋白和27%白蛋白(圖1和2)。為形成二相系統(tǒng)，加入150g氯化鈉(15%w/v)，106g磷酸氫二鉀，74g磷酸二氫鉀(18%w/v)，90g聚乙二醇(9%w/v),以及作為抗病毒劑的苯酹2.5mL (0.25%v/v)。磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的比例是0.7，這樣系統(tǒng)pH值即為6.1。每個(gè)組分加入后應(yīng)持續(xù)攪拌至完全溶解，然后再加入下一組分。加入全部組分后，繼續(xù)劇烈攪拌系統(tǒng)I小時(shí)，然后靜置I小時(shí)以形成各相；上層相含有免疫球蛋白沉淀，下層相含懸浮狀態(tài)的白蛋白。接著，使混合物在重力作用下進(jìn)行微濾。這一步也可通過(guò)離心或傾析實(shí)現(xiàn)。過(guò)濾后，將沉淀(免疫球蛋白)和濾液(白蛋白)分別進(jìn)行處理。如圖1所示，各相分級(jí)后，血漿中68%的抗蛇毒免疫球蛋白從上層相中得到回收(圖2B)，血漿中100%的白蛋白從下層相中得到回收(圖3B)。產(chǎn)品純度經(jīng)凝膠過(guò)濾方法估算，分別為92%和62%。兩相之間總的蛋白產(chǎn)率是88%，剩余12%為纖維蛋白，來(lái)自上層相(圖1)。
[0064]為制備抗毒素，將沉淀重懸于1400mL去離子水中，持續(xù)攪拌I小時(shí)。免疫球蛋白和其他殘留蛋白溶解后，加入辛酸。通常，在抗毒素的生產(chǎn)中辛酸的使用量為5-7%v/v。但在本實(shí)例中，因?yàn)楹庖咔虻鞍椎牟糠謥?lái)自ATPS系統(tǒng)，含有較少的雜蛋白，因而所需辛酸的量更少(1.75%v/v)。劇烈攪拌30分鐘以促進(jìn)沉淀。此步驟有雙重作用；一是沉淀雜蛋白，二是滅活包膜病毒。然后在重力作用下微濾，回收溶液中的免疫球蛋白。到這一步，血漿中60%的抗蛇毒免疫球蛋白得到回收，純度為99% (圖1和2)。由于產(chǎn)品純度很高，所以不需要額外的層析處理，將產(chǎn)品直接進(jìn)行制劑。
[0065]將濾液用15kDa排阻濾膜對(duì)去離子水進(jìn)行透析。也可通過(guò)超濾進(jìn)行滲濾處理，代替透析。用20 μ m排阻濾膜對(duì)抗毒素進(jìn)行納米過(guò)濾處理，作為第三個(gè)抗病毒步驟。然后，用30kDa排阻濾膜超濾產(chǎn)物，將產(chǎn)物濃縮到中和活性所需的濃度規(guī)格(例如，三色矛頭蝮為3mg毒素/mL抗毒素，中美巨蝮為3 mg毒素/mL抗毒素，中美響尾蛇為2mg毒素/mL抗毒素，中美珊瑚蛇為0.5mg毒素/mL抗毒素)。產(chǎn)物進(jìn)行制劑時(shí)，pH值為7，加入0.9%氯化鈉w/v和0.25%苯酹w/v,0.22 μ m濾膜過(guò)濾消毒(圖1)。按照IOmL每份,將產(chǎn)品分裝到無(wú)菌瓶?jī)?nèi)。
[0066]利用15kDa排阻膜將富含白蛋白的ATPS系統(tǒng)下層相對(duì)水透析，以除去來(lái)自系統(tǒng)的鹽。也可通過(guò)超濾進(jìn)行滲濾處理，代替透析。為除去雜蛋白，將白蛋白懸液進(jìn)行熱凝固處理，加入2.4g(0.012M)辛酸鈉作為穩(wěn)定劑，還需加入126mL95%乙醇v/v(9%v/v)。然后將混合物65°C水浴加熱I小時(shí)。冷卻至室溫后，用0.5M HCl調(diào)整pH至5。在重力作用下微濾去除蛋白沉淀。如圖1和3C所示，這一步產(chǎn)率為94%，純度為91%。
[0067]為進(jìn)一步提純所獲得的富白蛋白濾液，加入0.1%氯化鈉，用0.5M氫氧化鈉調(diào)整pH至8。然后將溶液通過(guò)帶磺酸樹脂的陽(yáng)離子交換膜?；厥沼坞x部分，用0.5M HCl調(diào)整pH至7ο作為第二個(gè)抗病毒步驟,將溶液通過(guò)20 μ m濾膜進(jìn)行納米過(guò)濾。用IOkDa濾膜超濾,將產(chǎn)物濃縮至20g/dL，加入辛酸鈉作為穩(wěn)定劑，調(diào)整pH至7。產(chǎn)物用0.22 μ m濾膜過(guò)濾消毒，分裝至無(wú)菌瓶?jī)?nèi)。然后60°C巴氏消毒法處理10小時(shí)以確保滅活病毒(圖1)。
[0068]實(shí)例2從人血漿中生產(chǎn)無(wú)病毒注射級(jí)品質(zhì)的免疫球蛋白和白蛋白
[0069]將IL人血漿通過(guò)ATPS系統(tǒng)分級(jí)以獲取免疫球蛋白和白蛋白。應(yīng)當(dāng)注意的是,人血漿所含白蛋白的比例(52%)要高于免疫球蛋白(16%)。為形成二相系統(tǒng)，需加入150g氯化納(15%w/v), 106g 憐酸氧二鐘,74g 憐酸二氧鐘(18%w/v)，60g 聚乙二醇(6%w/v)和 2.5mL抗病毒劑苯酚(0.25%v/v)。在本實(shí)例中，所用PEG的濃度要低于實(shí)例一中所使用的濃度，因?yàn)槠鹗嘉锪弦布慈搜獫{中免疫球蛋白比例較低，分級(jí)時(shí)所需的上層相也相對(duì)較少。分級(jí)步驟的其余操作均與實(shí)例一相同。如圖4和5B所示，上層相中回收的免疫球蛋白產(chǎn)率為85%，純度為42%，而下層相中白蛋白的產(chǎn)率為91%，純度為80% (圖4和6B)。系統(tǒng)總的蛋白產(chǎn)率為91%，其余部分為纖維蛋白。
[0070]兩相分級(jí)之后，富含免疫球蛋白沉淀的上層相重懸于1400mL去離子水中，持續(xù)攪拌I小時(shí)。免疫球蛋白和其他蛋白溶解后，加入2%v/v的辛酸?；厥盏臑V液中免疫球蛋白產(chǎn)率為70%，純度為82% (圖4)。
[0071]與實(shí)例一不同，辛酸沉淀后回收的濾液，需進(jìn)行陰離子交換層析以進(jìn)一步提純免疫球蛋白溶液(圖4)。為此需加入0.1%氯化鈉，用0.5M HCl調(diào)整pH至5，然后將混合物通過(guò)帶季銨樹脂的陰離子交換膜?；厥沼坞x部分，用0.5M氫氧化鈉調(diào)整pH至7。在這一部分中，起始物料中70%的免疫球蛋白得到回收，經(jīng)凝膠過(guò)濾方法測(cè)得純度為92% (圖4和5C)。應(yīng)當(dāng)注意的是，辛酸沉淀和層析均能有效去除IgA和IgM。對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行制劑、穩(wěn)定和消毒的方法與實(shí)例一中處理抗毒素溶液的方法相同。
[0072]富含白蛋白的ATPS下層相中，白蛋白純度為80%，回收產(chǎn)率為91% (圖6B)，因此，透析后沒(méi)有對(duì)溶液進(jìn)行選擇性熱凝固處理。白蛋白的提純是通過(guò)陽(yáng)離子交換層析實(shí)現(xiàn)的，方法與實(shí)例一中處理馬白蛋白的方法相同。此外，其余操作步驟同樣與實(shí)例一相同。最終的產(chǎn)物純度為90%，回收產(chǎn)率為91% (圖4和6C)。
[0073]實(shí)例3抗蛇毒免疫免疫球蛋白純度和產(chǎn)率的測(cè)定
[0074]對(duì)起始物料和純化過(guò)程中每一步采集樣品的純度分析是通過(guò)在FPLC中凝膠過(guò)濾層析實(shí)現(xiàn)的(圖 2 和 3)。使用 Superdex20010/300GL 層析柱，用 NaC1150mM，Tris-HC120mM，pH7.5的緩沖液進(jìn)行洗脫。保留時(shí)間為25±0.3分鐘(對(duì)應(yīng)免疫球蛋白分子量)的峰曲線下面積，與層析譜全部峰的曲線下總面積之比即為總免疫球蛋白的純度。
[0075]為測(cè)定蛋白產(chǎn)率，對(duì)起始物料和純化過(guò)程中每一步采集樣品的總蛋白濃度通過(guò)一種改進(jìn)的雙縮服法進(jìn)行定量(參見 Parvin, R., Pande, S.V., Venkitasubramanian, A.1965.“On the colorimetric Biuret Method of Protein Determination，，.AnalyticalBiochemistryl2:219-229)0利用蛋白質(zhì)測(cè)定獲取的數(shù)據(jù)，F(xiàn)PLC法測(cè)定的純度和每個(gè)樣品的體積，免疫球蛋白的總量可以通過(guò)計(jì)算得出并以克為單位表示。最后，樣品中總免疫球蛋白的量(g)，與起始物料中總免疫球蛋白的量(g)的比值即為蛋白產(chǎn)率。
[0076]此外，對(duì)起始物料和純化過(guò)程中每一步采集的樣品或在對(duì)三色矛頭蝮毒素特異性抗體的定量中，需進(jìn)行一項(xiàng)ELISA測(cè)定。為此，在96孔板每孔中加入100 μ L三色矛頭蝮毒素的磷酸鹽溶液(3yg/Well)，室溫孵育過(guò)夜。然后，按照100 μ L/孔加入不同稀釋度的待測(cè)樣品，每個(gè)稀釋度三個(gè)重復(fù)孔，室溫孵育I小時(shí)。洗板，然后每孔加入100μ L過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的馬抗IgG抗體溶液，孵育I小時(shí)。再次洗板后，加入底物(過(guò)氧化氫和鄰苯二胺)顯色。在酶標(biāo)分析儀上測(cè)定492nm波長(zhǎng)處的吸光度。通過(guò)根據(jù)已知濃度的抗毒素IgG制作的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，計(jì)算得出馬抗毒素IgG的濃度并以g/L為單位表示。上述標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)親和層析法獲得的，將初步純化的超免疫馬樣品通過(guò)偶聯(lián)三色矛頭蝮毒素的瓊脂糖層析柱純化。
[0077]根據(jù)ELISA測(cè)得的濃度，以及每個(gè)抗毒素免疫球蛋白樣品的體積，計(jì)算得出抗毒素免疫球蛋白的總量并以克為單位表示。最后，計(jì)算樣品中抗毒素免疫球蛋白的量(g)與起始物料中抗毒素免疫球蛋白的量(g)的比值即得出蛋白產(chǎn)率。
[0078]實(shí)例4人免疫球蛋白純度和產(chǎn)率的測(cè)定
[0079]對(duì)起始物料和純化過(guò)程中每一步采集樣品的產(chǎn)率測(cè)定方法與實(shí)例3相同。
[0080]利用一種放射免疫擴(kuò)散(RID)試劑盒(Cromatest,Linear ChemicalsSL, Barcelona, Spain)，來(lái)對(duì)IgG、IgA和IgM進(jìn)行定量。將待測(cè)樣品置于瓊脂糖凝膠的孔內(nèi)，使其擴(kuò)散48小時(shí)。根據(jù)每個(gè)樣品的濃度和體積，計(jì)算每種類型抗體的量并以克為單位表示。從以上數(shù)據(jù)中，根據(jù)RID測(cè)定的免疫球蛋白的量與樣品中總蛋白量的比值，計(jì)算得出每個(gè)樣品中IgG的純度。此外，計(jì)算樣品中IgG的量(g)與起始物料中IgG量(g)的比值即得出IgG的產(chǎn)率。
[0081]實(shí)例5白蛋白純度和產(chǎn)率的測(cè)定
[0082]馬白蛋白和人白蛋白的測(cè)定方法類似。通過(guò)在FPLC中凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定白蛋白的純度(圖3和6 )，詳見前述。保留時(shí)間為28 ± 0.3分鐘(對(duì)應(yīng)白蛋白分子量)的峰曲線下面積，與層析譜全部峰的曲線下總面積之比即為白蛋白的純度。
[00 83]蛋白產(chǎn)率的測(cè)定，詳見前述，為樣品中白蛋白的量(g)與起始物料中白蛋白的量(g)的比值。
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)原料為病毒載量降低的血漿來(lái)源蛋白產(chǎn)品的注射級(jí)劑型的方法，其中所述方法包括以下步驟: a.通過(guò)加入一種聚合物和至少一種鹽分使雙水相系統(tǒng)的起始物料分級(jí)； b.向雙相系統(tǒng)中加入苯酚作為滅活病毒的第一步； c.將系統(tǒng)的上下雙相分級(jí)為雙水相； d.通過(guò)脂肪酸沉淀系統(tǒng)上層水相來(lái)純化產(chǎn)品； e.通過(guò)熱凝方法來(lái)純化系統(tǒng)下層水相中的產(chǎn)品； f.在系統(tǒng)上下雙相的純化步驟中用兩個(gè)步驟來(lái)去除形成的變性蛋白沉淀物； ?.通過(guò)層析增加從上下雙相中獲得的產(chǎn)品純度； ii1.將前一步驟中獲得的產(chǎn)物進(jìn)行納米純化以去除病毒顆粒；以及 1.對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行制劑、穩(wěn)定化和滅菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中起始物料可選自由血漿、血清、通過(guò)Cohn法獲得的組分或任何其它含有血漿來(lái)源蛋白產(chǎn)品的物料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中起始物料組分中所用的聚合物為分子量在1000-6000Da范圍內(nèi)的聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中的方法，其中聚合物為分子量約為3350Da的聚乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4中的方法，其中聚乙二醇的濃度為6-15%w/v。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中的方法，其中聚乙二醇的濃度為6-9%w/v。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中鹽分可選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸銨和檸檬酸鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中的方法，其中鹽分為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中的方法，其中磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀濃度為10-20%w/v。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中的方法，其中磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀濃度為15-20%w/v。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中的方法，其中磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的應(yīng)用比例取決于所需的pH值。
12.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中一種鹽分會(huì)對(duì)溶劑組分產(chǎn)生影響，但不會(huì)對(duì)雙相形成產(chǎn)生影響。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中的方法，其中鹽分為氯化鈉。
14.根據(jù)權(quán)利要求13中的方法，其中氯化鈉的濃度為5-20%w/v。
15.根據(jù)權(quán)利要求14中的方法，其中氯化鈉的濃度為12-15%w/v。
16.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中分級(jí)步驟在pH值為5.5-7.5時(shí)進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中的方法，其中分級(jí)步驟在pH值為6時(shí)進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中首次病毒分級(jí)步驟使用的苯酚濃度為0.05-0.3v/Vo
19.根據(jù)權(quán)利要求18中的方法，其中苯酚濃度為0.25%v/v。
20.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中雙水相系統(tǒng)的上下雙相分級(jí)是通過(guò)從安裝和分級(jí)、安裝和過(guò)濾、安裝和棄上清或離心等工藝中選擇一個(gè)組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中雙水相系統(tǒng)的上層水相中包含產(chǎn)物的純化是通過(guò)辛酸沉淀完成。
22.根據(jù)權(quán)利要求21中的方法，其中辛酸的濃度為1_6%ν/ν。
23.根據(jù)權(quán)利要求22中的方法，其中辛酸的濃度為1.5-2%v/v。
24.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中熱凝在60°-70°C之間進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求24中的方法，其中熱凝在65°C下進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中下層水相的選擇性熱凝在存在辛酸鈉和乙醇時(shí)進(jìn)行。
27.根據(jù)權(quán)利要求26中的方法，其中使用的辛酸鈉混合物為0.012M,乙醇濃度為9%v/Vo
28.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中雙水相系統(tǒng)中上層水相中獲得的產(chǎn)物純化的最后一步中的層析步驟可選擇離子交換層析、親和層析、疏水交換層析。
29.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中雙水相系統(tǒng)中上層水相中獲得的產(chǎn)物純化的最后一步中的層析步驟為離子交換層析。
30.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中納米過(guò)濾步驟采用20μ m的排除濾膜進(jìn)行。
31.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中產(chǎn)物過(guò)濾采用22μ m的排除濾膜進(jìn)行。
32.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中免疫球蛋白可冷凍干燥或在制劑期間保持液體狀態(tài)。
33.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中免疫球蛋白經(jīng)60°C下巴氏消毒10小時(shí)，作為包裝后的病毒滅活步驟。
34.采用權(quán)利要求1-33的方法獲得產(chǎn)物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34中的方法獲得的產(chǎn)物為病毒載量降低的注射級(jí)免疫球蛋白劑型。
36.根據(jù)權(quán)利要求34中的方法獲得的產(chǎn)為病毒載量降低的注射級(jí)白蛋白劑型。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103476786SQ201180070045
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】阿爾瓦羅·塞古拉·魯伊斯, 瑪瑞安吉拉·瓦爾加斯·阿羅約, 吉列爾摩·利昂·蒙特羅, 毛倫·維爾拉塔·阿列塔, 瑪利亞·埃雷拉·唯加, 亞米勒絲·安古洛·阿高德 申請(qǐng)人:哥斯達(dá)黎加大學(xué)