專利名稱：一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝。
背景技術(shù)：
莽草酸是羅氏生產(chǎn)達菲的關(guān)鍵原料。目前羅氏使用的莽草酸大多從八角中加工提取獲得。利用石油化工原料來合成莽草酸因其步驟復雜，因此，目前除科研工作外，實際生產(chǎn)和應用價值不大。此外，莽草酸還可以從另外一種天然產(chǎn)物奎寧酸中提取合成。奎寧酸來源于金雞納樹(cinchona tree)的樹皮,它可以像莽草酸一樣提取和大量供應。金雞納樹的產(chǎn)地主要在非洲國家扎伊爾(Zaire)，但由于扎伊爾的政局不穩(wěn)定，難以在商業(yè)上穩(wěn)定確保金雞納樹樹皮的供應。目前，也有以葡萄糖為原料，采用生物發(fā)酵的方法來制備莽草酸。近年來，隨著莽草酸國際市場需求的持續(xù)增大，莽草酸原料的獨一性和地域性決定了莽草酸的供應有可能面臨短缺的局面，因此，擺脫以八角為原料提取莽草酸的途徑，而采用微生物發(fā)酵法來提取莽草酸已成為共識。如中國專利ZL200610030985. 8公開了一種莽草酸生產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法，其利用生物基因工程技術(shù)構(gòu)建獲得了莽草酸生產(chǎn)菌株，該生產(chǎn)菌株能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過程中莽草酸的有效積累，為莽草酸生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。但是構(gòu)建成功的生產(chǎn)菌株經(jīng)發(fā)酵后，所得發(fā)酵液中莽草酸含量低，不能直接使用，需要進一步的后續(xù)提取純化處理才能獲得純度高的莽草酸成品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是在于提供一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，該生產(chǎn)工藝簡單、環(huán)保、廣品收率聞、廣品品質(zhì)穩(wěn)定。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案
一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，具體為將發(fā)酵液依次經(jīng)微濾和超濾后，所得濾液用陰離子交換樹脂交換吸附，接著用乙酸溶液洗脫，洗脫液再依次經(jīng)濃縮、脫色和結(jié)晶得到晶體，所得晶體經(jīng)洗滌和干燥后即得莽草酸成品。具體的，可以使用陶瓷膜進行微濾，微濾主要用以除去菌體和其它固形物。所用陶瓷膜可以為Al2O3質(zhì)量百分含量為99%的陶瓷膜，這樣可以解決陶瓷膜耐堿性差、強度不高等缺陷，由于膜支撐體材質(zhì)為99% Al2O3，在1800°C高溫下燒結(jié)時收縮性小，支撐體孔徑相對于Al203/Ti02/Zr02混合材料燒結(jié)而成的支撐體孔徑更大更均勻，膜元件孔徑的不對稱性更大，因此錯流過濾時膜的污染更低，更容易清洗。所用陶瓷膜孔徑優(yōu)選為0. I 0. 5 ii m。微濾的通量以10 50L/m2 h為宜。具體的，可以使用超濾膜進行超濾，超濾主要用以除去蛋白和色素。所用超濾膜材質(zhì)優(yōu)選為耐酸堿性強的聚偏氟乙烯(PVDF)。所用超濾膜優(yōu)選為卷式膜，截留分子量為5000 道爾頓。超濾通量以10 50L/m2 H為宜。較好的，所述陰離子交換樹脂優(yōu)選為強堿性的717陰離子交換樹脂；交換吸附時， 上柱流量為0. 5 lBV/h (批交換時間為8 10h)。離子交換樹脂的作用在于交換吸附產(chǎn)品，分離除去其它雜質(zhì)，即要有較大的交換容量，又要保證產(chǎn)品的純度。洗脫時所用乙酸溶液濃度以I I. 5mol/L為佳，此濃度范圍的乙酸溶液可以保證產(chǎn)品的洗脫速率最大，組分集中，后處理壓力低，洗脫流量為0. 5 lBV/h。洗脫液用濃縮鍋進行濃縮，濃縮時的優(yōu)選條件為壓強為-0. 09MPa，溫度為60 80°C，一般濃縮至濃縮液中莽草酸濃度為350 450g/L時即可進行下一步脫色處理。洗脫液濃縮后，所得濃縮液用粉末活性炭進行脫色，脫色溫度60 80°C，脫色時間30 60min， 每升濃縮液中以添加3 5g活性炭為宜。濃縮液脫色時用粉末活性炭除去色素，有利于下一步的結(jié)晶和保證產(chǎn)品外觀良好。所述結(jié)晶的優(yōu)選條件為于0 6°C攪拌條件下添加與濃縮液等體積的95%乙醇， 攪拌轉(zhuǎn)速40 60rpm,添加95%乙醇后以繼續(xù)保持攪拌48 96h為佳(必要時可視情況添加少量莽草酸晶種來誘導結(jié)晶)。此處添加體積濃度為95%乙醇目的在于降低溶液中莽草酸的溶解度，以利于莽草酸充分、完全析出，提高莽草酸的結(jié)晶析出率。結(jié)晶工序結(jié)束后，可通過固液分離(如離心分離)得到析出的莽草酸晶體，該晶體需經(jīng)洗滌工序進一步純化。具體的，所述晶體洗滌的條件為于0 5°C條件下用乙醇和乙酸乙酯的混合液作為洗滌劑(洗滌劑中乙醇和乙酸乙酯的體積比優(yōu)選為1:1)進行洗滌，每千克濕晶體優(yōu)選添加300 500mL洗滌劑。晶體洗滌后優(yōu)選于60 80°C干燥24 36h即可。本發(fā)明提取工藝的優(yōu)點如下
(I)發(fā)酵液絮凝后用陶瓷膜微濾可以除去菌體和其它固形物，得到澄清濾液，從而利于下一步的超濾工序。(2)超濾除蛋白和色素效果顯著，這樣在進行離子交換吸附時，既保持了較高的交換容量，又降低了洗脫液濃縮的工作量，提高了生產(chǎn)效率，且有利于產(chǎn)品純化。(3)由于工藝中使用微濾和超濾除雜，使得工藝整體簡潔高效，產(chǎn)品收率高。此外，本發(fā)明工藝過濾用水可循環(huán)利用，廢水排放量少；用超濾膜代替樹脂脫色，提高了生產(chǎn)效率，降低了廢水排放量，整個工藝環(huán)境綠色清潔。(4)產(chǎn)品處理量減少，避免了真空濃縮大體積處理的工藝瓶頸，能夠有效地保證莽草酸成品的品質(zhì)(純度達98. 5%以上，收率達75%以上)。


圖I為莽草酸對照品(購自Sigma公司，純度彡98. 0%)的HPLC (儀器型號安捷倫 1100)圖譜，出峰時間為2. 740min ；
圖2為實施例I制得的莽草酸成品的HPLC圖譜，出峰時間為2. 733min 圖3為實施例2制得的莽草酸成品的HPLC圖譜，出峰時間為2. 738min 圖4為實施例3制得的莽草酸成品的HPLC圖譜，出峰時間為2. 740min 圖5為實施例4制得的莽草酸成品的HPLC圖譜，出峰時間為2. 733min。
具體實施例方式以下通過優(yōu)選實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。
實施例I
一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，具體為
(1)發(fā)酵液IOOOml(發(fā)酵液比重0. 98，固形物質(zhì)量百分含量16%，其中莽草酸30g)通過Al2O3質(zhì)量百分含量為99%的陶瓷膜進行微濾，陶瓷膜孔徑為0. I y m，微濾通量為IOL/ m2 h0
(2)微濾后所得濾液用卷式超濾膜進行超濾，超濾膜材質(zhì)為聚偏氟乙烯，所用超濾膜截留分子量為5000道爾頓,超濾通量為10L/m2 ho(3)超濾后所得清夜用717陰離子交換樹脂柱交換吸附，上柱流量lBV/h，批吸附時間8h ;然后用lmol/L乙酸溶液進行洗脫，洗脫流量為I BV/h。(4)洗脫液用濃縮鍋于60°C減壓濃縮(壓強為-0. 09MPa)至莽草酸濃度約350g/ L時，在濃縮液中添加5g/L的粉末活性碳，60°C攪拌脫色約45min，過濾除去活性炭。所得濃縮液在0 3°C攪拌條件下添加與濃縮液等體積的95%乙醇，添加后以50rpm的轉(zhuǎn)速攪拌72h (必要時可加少量晶種誘導結(jié)晶)，然后離心得濕晶體。濕晶體用0 3°C的乙醇和乙酸乙酯混合液(ViS: V^m=I I)進行洗滌(洗滌液添加量為500mL/kg)。洗滌后晶體于60°C干燥36h得23. 4g白色粉末狀晶體，即為莽草酸成品(純度為98. 62%，收率76. 92%， 見圖2)。實施例2
與實施例I的不同之處在于洗脫液用濃縮鍋于60°C減壓濃縮至莽草酸濃度約450g/ L時，添加粉末活性炭進行脫色處理，其它同實施例I。最后得到24. Ig白色粉末狀晶體，即為莽草酸成品(純度為98. 68%，收率79. 27%，見圖3)。實施例3
一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，具體為
(1)發(fā)酵液IOOOml(發(fā)酵液比重0. 98，固形物質(zhì)量百分含量18%，其中莽草酸33g)通過Al2O3質(zhì)量百分含量為99%的陶瓷膜進行微濾，陶瓷膜孔徑為0. 5 y m，微濾通量為30L/ m2 h0
(2)微濾后所得濾液用卷式超濾膜進行超濾，超濾膜材質(zhì)為聚偏氟乙烯，所用超濾膜截留分子量為5000道爾頓,超濾通量為30L/m2 h。(3)超濾后所得清夜用717陰離子交換樹脂柱交換吸附，上柱流量0. 5BV/h，批吸附時間IOh ;然后用I. 5mol/L乙酸溶液進行洗脫，洗脫流量為0. 5 BV/h。(4)洗脫液用濃縮鍋于60°C減壓濃縮至莽草酸濃度約350g/L時，在濃縮液中添加 5g/L的粉末活性碳，60°C攪拌脫色約lh，過濾除去活性炭后，所得濃縮液在3 5°C攪拌條件下添加與濃縮液等體積的95%乙醇，添加后以60rpm的轉(zhuǎn)速攪拌96h，然后離心得濕晶體。 濕晶體用3飛。C的乙醇和乙酸乙酯混合液(Vis =Viig^i=I: I)進行洗滌(洗滌液添加量為 400mL/kg)。洗滌后晶體于80°C干燥24h得26. Ig白色粉末狀晶體，即為莽草酸成品(純度為98. 5%，收率77. 9%，見圖4)。實施例4
與實施例3的不同之處在于洗脫液用濃縮鍋于60°C減壓濃縮至莽草酸濃度約450g/ L時，添加粉末活性炭進行脫色處理，其它同實施例3。最后得到27. 4g白色粉末狀晶體，即為莽草酸成品(純度為98. 57%，收率81. 84%，見圖5)。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，將發(fā)酵液依次經(jīng)微濾和超濾后，所得濾液用陰離子交換樹脂交換吸附，接著用乙酸溶液洗脫，洗脫液再依次經(jīng)濃縮、脫色、結(jié)晶、 晶體洗滌和干燥后即得莽草酸成品。
2.如權(quán)利要求I所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，使用陶瓷膜進行微濾。
3.如權(quán)利要求2所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，所用陶瓷膜孔徑為O.I O. 5 μ m。
4.如權(quán)利要求I所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，使用超濾膜進行超濾。
5.如權(quán)利要求4所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，所用超濾膜材質(zhì)為聚偏氟乙烯，所用超濾膜為卷式膜，截留分子量為5000道爾頓。
6.如權(quán)利要求I所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，所述陰離子交換樹脂為717陰離子交換樹脂；交換吸附時，上柱流量為O. 5 lBV/h。
7.如權(quán)利要求I所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，洗脫時所用乙酸溶液濃度為I I. 5mol/L，洗脫流量為O. 5 lBV/h。
8.如權(quán)利要求I所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，洗脫液的濃縮條件為壓強-O. 09MPa，溫度60 80°C;洗脫液濃縮后，所得濃縮液用粉末活性炭進行脫色，脫色溫度60 80°C，脫色時間30 60min，粉末活性炭用量為3 5g/L。
9.如權(quán)利要求I所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，所述結(jié)晶的條件為于 O 6°C攪拌條件下添加與濃縮液等體積的95%乙醇,攪拌轉(zhuǎn)速40 60rpm,添加95%乙醇后繼續(xù)攪拌48 96h。
10.如權(quán)利要求I所述發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，其特征在于，所述晶體洗滌的條件為于O 5°C條件下用乙醇和乙酸乙酯的混合液作為洗滌劑進行洗滌，每千克濕晶體添加 300 500mL洗滌劑；晶體洗滌后于60 80°C干燥24 36h即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵液中莽草酸的提取工藝，具體為發(fā)酵液通過陶瓷膜微濾，超濾膜超濾后，所得濾液用陰離子交換樹脂交換吸附，接著用乙酸溶液洗脫，洗脫液再依次經(jīng)濃縮、脫色、結(jié)晶、晶體洗滌和干燥后即得莽草酸成品。該工藝簡單且綠色環(huán)保，提取得到的莽草酸成品品質(zhì)穩(wěn)定，純度達98.5%以上，收率達75%以上。
文檔編號C07C51/42GK102584571SQ20121001358
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者喬娟平, 任存邦, 葉曉沖, 孟軍虎, 崔琳瑯, 張?zhí)N才, 徐靈芝, 李曉霞, 武廣君, 王春陽, 石玲瓏, 翟嬌琳, 董建輝, 郭丹丹 申請人:河南孟成生物藥業(yè)股份有限公司