專利名稱：一種檢測adamts13酶活性的熒光底物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物及檢測方法。
背景技術(shù)：
IfiI^fiiil(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP) 微血管血栓-出血綜合癥，主要是由于微循環(huán)中形成了血小板血栓，血小板數(shù)因大量消耗而減少所形成的紫癜。該病典型臨床表現(xiàn)為五聯(lián)征發(fā)熱、微血管病性溶血性貧血、血小板減少、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和腎臟受累。由于小動脈與微血管的栓死，導致器官缺血性功能障礙乃至梗死，對微循環(huán)依賴性強的器官(腦、腎等)也易出現(xiàn)癥狀。由于TTP起病急，患者一旦出現(xiàn)癥狀需要及時進行血漿置換，若患者未及時進行血漿置換或輸注等有效的治療， 病死率可達90%以上，TTP緩解后復發(fā)率為30% 60%。臨床研究表明，在TTP的發(fā)病進程中，金屬蛋白酶ADAMTS13與底物VWF因子扮演著極為重要的角色。VWF基因，Gene Bank ID :7450，位于第12對常染色體的短臂末端 12pl3. 3，基因全長約1801Λ，有52個外顯子和51個內(nèi)含子。外顯子大小差別很大，從40個堿基到1379個堿基(外顯子觀)。外顯子觀特別大，編碼VWF中全部Al和A2同源區(qū)。WF cDNA 5’區(qū)啟動子前有250核苷酸的非翻譯區(qū)，1-2289位堿基編碼763個氨基酸的前-原肽，從2290堿基開始編碼血漿中存在的成熟VWF。成熟VWF單體相對分子量為250X IO3 道爾頓，共包含有2050個氨基酸，在血漿中以多聚體的形式存在，是一個具有多功能域的大分子糖蛋白，具有高凝血活性。在VWF的A2區(qū)包含了金屬蛋白酶ADAMTS13的酶切位點 (Y1605-M1606)，在正常機體中，血漿中的ADAMTS13會將VWF多聚體裂解為粘附活性較低的小分子量多聚體，由于有ADAMTS13酶解VWF，從而使VWF分子大小處于動態(tài)的生理平衡狀態(tài)。然而如果由于ADAMTS13酶基因的變異或存在針對抑制ADAMTS13酶活性的抗體，使機體內(nèi)ADAMTS13活性出現(xiàn)先天性或獲得性缺陷，ADAMTS13酶活性下降，導致超大分子量VWF 的出現(xiàn)，而超大分子量VWF可在正常血流情況下網(wǎng)羅血小板，引起血小板自發(fā)性聚集，在全身微血管部位形成富含血小板血栓，VffF多聚體越大，網(wǎng)羅血小板的能力越強，形成血栓的能力也就越大，就會從而造成TTP的發(fā)生。因此快速檢測ADAMTS13酶活性對于臨床預防和治療TTP起著極其重要的作用。目前為止，已有多種檢測ADAMTS13酶活性的方法，主要歸結(jié)為兩類第一類為流體動態(tài)條件下的檢測方法，如mini-vortex渦流所產(chǎn)生的高剪切率條件下的檢測方法。第二類為靜態(tài)條件下檢測，包括尿素或鹽酸胍變性條件下酶解全長VWF底物檢測方法；各種帶GST或His尾巴的VWFA2區(qū)短肽作為底物檢測方法，如GST-VWFl 15-His、GST-VWF73_His 等；熒光標記VWF73檢測方法等。其中熒光標記VWF73檢測方法由于具有實時、快速、高通量的特點，已在歐美國家臨床普及化。目前已有兩種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物，其原理各不同。一種是由日本人Kokame于2005年建立，基于不同熒光基團之間的供體-受體(donor-acceptor)法，另外一種是由美國人John Owen于2006年建立，基于相同熒光基團之間的自猝滅 (self-quenching)法，但這兩種方法都是基于VWF73片段。VWF73片段是Kokame等人發(fā)現(xiàn)的ADAMTS13酶在體外的最小底物片段，位于VWF的A2區(qū)域，包括D1596至R1668的73個氨基酸，VWF73片段具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。Kokame建立的供體-受體法熒光底物由化學合成，其修飾位點選為VWF蛋白的 Q1599與附611，其原理是在VWF蛋白Q1599位點引入一供體熒光基團Nma，在N1611位點引入一受體熒光基團Dnp，當一定波長激光照射該熒光底物時，在Q1599位供體熒光基團 Nma所發(fā)射的熒光能量被臨近的N1611位受體熒光基團Dnp所吸收。而當該熒光底物被 ADAMTS13所酶解后，Q1599位供體熒光基團Nma所發(fā)射的熒光能量無法被臨近的N1611位受體熒光基團Dnp所吸收，從而導致Q1599位供體熒光基團Nma所發(fā)射的熒光能量得以在檢測儀器上測出。然而由于該法熒光底物是化學合成，成本高。同時由于該底物需類似DMSO 之類的有機溶劑溶解，往往溶解不完全，從而影響檢測結(jié)果的準確性。John Owen建立的自猝滅法熒光底物是由原核細菌M15所表達，經(jīng)后期純化修飾后用于檢測ADAMTS13酶活性。該法熒光底物修飾位點選為VWF蛋白的Q1599與P1612位， 其原理是在Q1599位與P1612位均突變?yōu)榘腚装彼酑，并在半胱氨酸自由巰基處通過馬來酰亞胺(maleimide)共價結(jié)合熒光基團5-fluorescein，當一定波長激光照射該熒光底物時， Q1599位與P1612位熒光基團同時發(fā)射能量，但此發(fā)射能量又由于彼此位點的接近而被彼此所吸收，從而使此能量無法發(fā)射出來。而當該熒光底物被ADAMTS13酶酶解后，由于Q1599 位與P1612位相互分離，從而使熒光基團發(fā)射的能量得以發(fā)射，ADAMTS13酶被檢測出來。然而由于該法靈敏度較低，不適合于臨床檢測ADAMTS13酶活性。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、準確性好的檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物及檢測方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物，包括如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列， 并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巰基結(jié)合有熒光基團?，F(xiàn)有技術(shù)中John Owen建立的自猝滅法缺點是該熒光底物的檢測靈敏度低，導致的原因可能是由于該熒光底物所選擇的修飾位點未在理想位置，從而導致兩修飾位點距離偏遠，同時又由于在該熒光底物N端過多的引入了額外的氨基酸序列組成，可能會導致酶切效率的降低。本發(fā)明所述熒光底物選擇將SEQ ID NO :1所示氨基酸序列N末端第4位的谷氨酰胺和第15位天冬酰胺，即VWF73的Q1599與N1611位，分別突變?yōu)榘腚装彼?，即Q1599C與 meiic，得到如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，并在其N末端第4位和第15位的半胱氨酸，即Q1599C與N1611C，修飾有熒光基團。當一定波長激光照射該熒光底物時，Q1599C與 meiic位熒光基團同時發(fā)射能量，但此發(fā)射能量又由于彼此位點的接近而被彼此所吸收， 從而使此能量無法發(fā)射出來。而當該熒光底物被ADAMTS13所酶解后，由于Q1599C與附61 IC 位相互分離，從而使熒光基團發(fā)射的能量得以發(fā)射，可被檢測出來。相鄰兩熒光基團之間能量轉(zhuǎn)移檢測的效率對于兩相鄰熒光基團的距離選擇非常苛刻，其值的大小與兩熒光基團距離的IO6成反比。本發(fā)明所述熒光底物所選擇的位點為 VWF73的Q1599與N1611位點，兩修飾位點比John Owen法選擇的Q1599與P1612更為接近。同時本發(fā)明所述熒光底物N端序列不含Bam HI酶切位點序列所編碼的額外氨基酸GS， 可更有效的被ADAMTS13所酶解。因此可提高檢測ADAMTS13酶活性的靈敏度。熒光素染料的應(yīng)用非常廣泛，包括熒光顯微鏡，流式細胞技術(shù)和基于免疫熒光的分析等。本發(fā)明所述熒光底物其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巰基結(jié)合有熒光基團，激光照射時熒光底物中的熒光基團發(fā)射能量，用以熒光檢測。其中，能夠與半胱氨酸的自由巰基結(jié)合的熒光基團包括熒光素-5-馬來酰亞胺(Fluorescein-5-maleimide) 和5-吲哚乙酰氨基熒光素(5-IAF)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述熒光底物所述熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺。本發(fā)明還提供了上述熒光底物的制備方法。一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物的制備方法，為制備具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，然后用能與巰基結(jié)合的熒光基團修飾蛋白即得。優(yōu)選的，所述制備具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白的方法具體包括步驟1 制備編碼VWF73的核苷酸序列，與T載體連接，獲得重組T載體；步驟2 雙酶切步驟1所得的重組T載體，收集VWF73片段，與pQE30表達載體雙酶切所得的大片段重組，獲得PQE30-VWF73重組載體；步驟3 將步驟2所得的pQE30-VWF73重組載體中的VWF73片段N端第4位和第 15位的氨基酸定點突變?yōu)榘腚装彼幔缓笤賱h除PQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端額外氨基酸序列GS，獲得pQE30-VWF73突變重組載體；步驟4 將獲得的PQE30-VWF73突變重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，誘導蛋白表達，分離純化表達的蛋白即得。目前利用基因工程技術(shù)獲得DNA分子的方法有很多種，包括利用限制性內(nèi)切酶酶切具有編碼所述VWF73的DNA分子的載體或以具有編碼所述VWF73多肽的DNA分子的cDNA 為模板PCR擴增。在一個具體實施方案中，本發(fā)明所述制備具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白步驟1所述獲取編碼VWF73片段的核苷酸序列具體為用具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的下游引物擴增。擴增所得的VWF73片段與T載體連接，獲得重組T載體。然后利用工程技術(shù)，所酶切獲得VWF73片段，與pQE30表達載體雙酶切所得的大片段重組，獲得pQE30_VWF73重組載體。在一個具體實施方案中，本發(fā)明所述制備方法，步驟3所述點突變具體包括以下步驟A:以pQE30-VWF73重組載體為模板，用具有SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得 PQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端的第4位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒；B 以pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端的第4位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得PQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端第 4位和第15位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒；C 以pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端第4位和第15位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得刪除VWF73片段N端額外氨基酸序列GS的pQE30-VWF73-突變重組載體。優(yōu)選的，步驟2所述雙酶切為Bam HI和HindIII雙酶切。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化宿主細胞為大腸桿菌表達菌株，包括M15系列、Rosetta系列和 BL21系列菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞為大腸桿菌M15菌株。優(yōu)選的，所述能與巰基結(jié)合的熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺。優(yōu)選的，本發(fā)明所述熒光底物的制備方法所述用能與巰基結(jié)合的熒光基團修飾蛋白為取具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，加入3倍摩爾量的磷酸三(β-氯乙基)酯和10倍摩爾量的熒光素-5-馬來酰亞胺，4°C暗室反應(yīng)過夜，之后裝入透析袋，用 pH7. 5 20mmol/L Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后用聚乙二醇-20000濃縮蛋白即得。本發(fā)明所述熒光底物的制備方法利用基因工程技術(shù)將VWF73的Q1599與N1611位突變?yōu)榘腚装彼?，即Q1599C與m611C，修飾位點更為接近，并在Q1599C與W611C進行熒光基團修飾，同時所述熒光底物N端序列不含Bam HI酶切位點序列所編碼的額外氨基酸GS， 可更有效的被ADAMTS13所酶解。實驗表明本發(fā)明熒光底物檢測ADAMTS13酶活性的靈敏度比現(xiàn)有的John Owen的建立的熒光底物提高約兩倍。因此本發(fā)明還提供了上述熒光底物在檢測ADAMTS13酶活性中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種檢測ADAMTS13酶活性的方法，為取待測血漿樣品與過量的上述熒光底物在反應(yīng)緩沖液中混合，然后在所述熒光底物所結(jié)合熒光基團相應(yīng)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長下，檢測反應(yīng)體系的熒光強度，按照標準曲線法計算待測血漿樣品中 ADAMTS13酶活性。本發(fā)明所述檢測方法是利用兩個相鄰熒光基團能量轉(zhuǎn)移檢測待測血漿樣品中 ADAMTS13酶活性，用一定波長激光照射含有待測血漿樣品和熒光底物時，如果血漿樣品中 ADAMTS13酶活性很低，無法酶解熒光底物，熒光底物Q1599C與m611C位熒光基團同時發(fā)射能量，但此發(fā)射能量又由于彼此位點的接近而被彼此所吸收，從而使此能量無法發(fā)射出來。而當血漿樣品中ADAMTS13酶活性很強時，熒光底物被ADAMTS13所酶解，其Q1599C與 meiic位相互分離，從而使熒光基團發(fā)射的能量得以發(fā)射，ADAMTS13酶活性被檢測出來。ADAMTS13酶在正常血漿中的濃度約為1 μ g/mL,其分子量約為200kD，即ADAMTS13 酶在血漿中的摩爾濃度約為5nmol/L。為了保證檢測結(jié)果的準確性，本發(fā)明所述檢測 ADAMTS13酶活性的方法中加入過量的熒光底物，以保證待測血漿樣品中ADAMTS13酶充分反應(yīng)。在具體實施方案中，所述熒光底物的用量為2. Ιμπιο ，遠遠大于ADAMTS13酶用量。本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶活性的方法，操作簡便，檢測結(jié)果準確，靈敏度高。在一個具體實施方案中，本發(fā)明所述熒光底物所結(jié)合熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺，所述激發(fā)光波長為485nm，發(fā)射光波長為530nm。優(yōu)選的，所述反應(yīng)緩沖液包括pH6. 3的5mM Bis_Tris、25mMCaC12和0. 005v/v% Tween20o
本發(fā)明所述檢測方法計算待測血漿樣品中ADAMTS13酶活性的方法為根據(jù)不同體積量正常血漿檢測結(jié)果描繪出標準曲線，并計算不同體積量正常血漿酶解底物時的速率， 即斜率，然后將不同體積量正常血漿不同的體積以及相應(yīng)的斜率換算成對應(yīng)的以10為底的對數(shù)，根據(jù)以上的對數(shù)描出曲線，得出標準對數(shù)曲線；根據(jù)待測血漿樣品檢測結(jié)果，計算出待測血漿樣品酶解底物的速率，即斜率，并將該斜率進行對數(shù)化；以標準對數(shù)曲線為依據(jù)，將待測血漿樣品對數(shù)化的斜率通過對數(shù)曲線進行計算，將所得結(jié)果為冪、10為底得出待測血漿樣品中ADAMTS13酶活性。本發(fā)明還提供了一種檢測ADAMTS13酶的試劑盒，包括上述熒光底物。優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包括反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包括pH6. 3的5mM Bis-Tris、25mMCaCl2 和 0. 005v/v% Tween20。本發(fā)明所述試劑盒穩(wěn)定性好、保存期長，檢測ADAMTS13酶活性結(jié)果準確性高、靈敏度高，便于推廣使用，可應(yīng)用于各級醫(yī)院、衛(wèi)生部門和醫(yī)學生物科研單位快速檢測血漿中 ADAMTS13酶活性。


圖1示本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2示本發(fā)明實施例3制備的質(zhì)粒pQE30-VWF73^!1599C、m611C、Bam HI Del)的測序結(jié)果圖；圖 3 示本發(fā)明實施例 4pQE30-VWF73^!1599C、N1611C、Bam HI Del)在大腸桿菌中表達所得蛋白以及純化修飾后所得蛋白的Western Blot檢測結(jié)果圖，其中，泳道1為 pQE30-VWF73(Q1599C, N1611C、Bam HI Del)未誘導產(chǎn)物，泳道 2 為 pQE30_VWF73 ^!1599C、 N1611C,Bam HI Del)在大腸桿菌中誘導表達所得蛋白，泳道3為John Owen所建未修飾熒光底物，泳道4為pQE30-VWF73^!1599C、m611C、Bam HI Del)在大腸桿菌中誘導表達后純化修飾的蛋白，泳道5為John Owen所建修飾后的熒光底物；圖4示本發(fā)明實施例5本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶的熒光底物和John Owen建立的熒光底物檢測靈敏度比較圖，其中1、2和3分別代表利用4、2、1 μ L正常枸櫞酸鈉抗凝混合血漿酶解本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶的熒光底物，4、5和6分別代表利用4、2、luL正常枸櫞酸鈉抗凝混合血漿酶解JohnOwen建立的熒光底物，橫坐標為時間min，縱坐標為相對熒光單位ARFU。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物及檢測方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品和方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。其中質(zhì)粒 pSVHVWFl由美國華盛頓大學醫(yī)學院Midler JE教授惠贈，包含人VWF的全長cDNA序列； PQE30質(zhì)粒購自Qiagen公司；pREP4質(zhì)粒來自M15大腸桿菌；大腸桿菌DH5a、M15和TGl購自Qiagen公司。熒光素_5_馬來酰亞胺購自加拿大TRC公司，磷酸三(β-氯乙基)酯購自Sigma公司，透析袋(MWC0:1000)購自美國Spectrum Laboratories公司，限制性內(nèi)切酶 Bam HI 和 Hind III 為 Fermentas 公司產(chǎn)品，Hot-start Phusion, DpnI 酶購自 NEB 公司，鼠源性Anti-His-Tag及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(HRP-GAM-IgG)均購自 Beckman-Coulter公司，質(zhì)粒抽提試劑盒和Ni-NTA瓊脂糖購自Qiagen公司，硝酸纖維素膜為PALL公司產(chǎn)品，ECL顯影試劑盒購自上海普飛生物技術(shù)有限公司。實施例1 :VWF73片段的獲得以質(zhì)粒pSVHVWFl為模板，具有SEQ ID NO 3示的核苷酸序列的上游引物V73F和具有SEQ ID NO :4示的核苷酸序列的下游引物V7!3B進行PCR擴增。兩條引物分別帶有Bam HI和HindIII的酶切位點。PCR擴增反應(yīng)體系為
10xbuffer(with 1.5mM Mg2, dNTP(5mM)
上游引物V73F (100ng/4) 下游引物V73B (IOOng^L) 模板(5-50ng L) Taq 酶(2U/pL)加入滅菌蒸餾水補足體系總量25 μ L0PCR反應(yīng)程序為94°C 預變性 5min
94°C變性 58°C退火
72°C延伸72°C 延伸7min將PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳回收，用Bam HI和Hind III雙酶切，將酶切后的片段與經(jīng)Bam HI和Hind III雙酶切的pMD19T (simple)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒后進行酶切鑒定，選取符合目的片段大小的克隆測序。實施例2 :VWF73片段與表達載體pQE30的重組經(jīng)Bam HI和Hind III雙酶切，將VWF73目的基因片段從DNA測序正確的克隆載體中切下，應(yīng)用T4DNA連接酶連接到已用相同酶酶切的表達載體pQE30中，轉(zhuǎn)化宿主菌TG1， 酶切鑒定重組子，命名為PQE30-VWF73。實施例3 表達載體pQE30-VWF73的改造1、含 Q1599C 突變的質(zhì)粒 pQE30_VWF73 (Q1599C)的制備以鑒定正確的PQE30-VWF73質(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO 5示的核苷酸序列的上游引物Q1599CF和具有SEQ ID NO 6示的核苷酸序列的下游引物Q1599CB進行PCR擴
2.5\\L
IpL IpL IpL 0.25pL
30s
30s丨33個循環(huán) 30s .+曰οPCR擴增反應(yīng)體系為
IOxbuffer dNTP(5mM)
上游引物 Q1599CF(100ng/p) 下游引物 Q1599CB( 1 OOng/μΙ^) 模板(5-50ng/pI^) Phusion 酶(2υ/μΙ^) DMSO加入滅菌蒸餾水補足體系總量20 μ L0PCR反應(yīng)程序為98°C 預變性 40 s
98°C變性 60°C退火
72°C延伸72°C 延伸7minPCR反應(yīng)結(jié)束后，加入IOU甲基化酶DpnI消化模板。取消化后PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Dffia菌(含pREP4質(zhì)粒)，抽提質(zhì)粒，測序鑒定，從而獲得含Q1599C突變的質(zhì)粒 pQE30-VWF73(Q1599C)。2、含 N1611C 突變的質(zhì)粒 pQE30-VWF73(N1611C)的制備以pQE30-VWF73^!1599C)質(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO :7示的核苷酸序列的上游引物N1611CF和具有SEQ ID NO 8示的核苷酸序列的下游引物N1611CB進行PCR擴增， PCR擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同前。PCR反應(yīng)結(jié)束后，加入IOU甲基化酶DpnI消化模板。取消化后PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Dffia菌(含pREP4質(zhì)粒)，抽提質(zhì)粒，測序鑒定，獲得同時含Q1599C、 N1611C 的質(zhì)粒 pQE30-VffF73 (Q1599C, N1611C)。3、刪除 BamHI 位點的質(zhì)粒 pQE30_VWF73 (Q1599C, N1611C、Bam HI Del)的制備以質(zhì)粒pQE30-VWF73^!1599C、m611C)為模板，用具有SEQ ID NO :9示的核苷酸序列的上游引物BamF和具有SEQ ID NO :10示的核苷酸序列的下游引物BamB進行PCR擴增， PCR擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同前。PCR反應(yīng)結(jié)束后，加入IOU甲基化酶DpnI消化模板。取消化后PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Dffia菌(含pREP4質(zhì)粒)，抽提質(zhì)粒，測序鑒定，獲得刪除Bam HI酶切位點序列所編碼的額外氨基酸GS的質(zhì)粒pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)。測序結(jié)果見圖2。實施例4 :pQE30-VWF73 (Q1599C,N1611C,Bam HI Del)在大腸桿菌中的表達、純化
與修飾將經(jīng)鑒定的表達質(zhì)粒pQE30-VWF73 1599C、N1611C、BamHI Del)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細
IpL IpL
0.2μL 0.6μ!ν
IOs〕
20s丨33個循環(huán) 100s .
10CN 102533937 A菌M15。取單個PQE系列菌落接種于含有氨芐青霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的 LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4 0.6時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，IPTG誘導濃度為lmmol/L，37°C誘導表達4h。收集菌體加入SDS-PAGE上樣還原loading buffer,煮沸后離心，取上清進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素(NC)膜， 以鼠源性Anti-His單抗為一抗，HRP-GAM-IgG為二抗，ECL放射自顯影，Western Blot鑒定目的蛋白表達，結(jié)果見圖3。對于符合理論大小的表達蛋白進行大量擴增表達，收集菌體加入超聲緩沖液 O % 甘油，IXProtease inhibitor Cocktail (EDTA-free), 20mmol/L Tris-HCl, PH8. O, 0. 15mol/L NaCl)，超聲裂解細菌后離心，取上清上樣于Ni-NTA瓊脂糖柱，用含不同濃度咪唑緩沖液(PH 8.0)從低至高濃度淋洗，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，收集目的蛋白所在緩沖液。BCA法初步定量，加入3倍目的蛋白摩爾量的磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)以及10倍目的蛋白摩爾量的熒光素-5-馬來酰亞胺 (Fluorescein-5-Maleimide)，4°C暗室反應(yīng)過夜。裝入透析袋，用 20mmol/L Tris-HCl (PH 7.5)緩沖液透析過夜，然后用聚乙二醇-20000濃縮蛋白，得到熒光基團修飾的蛋白。取純化修飾蛋白進行SDS-PAGE電泳，按上述步驟進RWfestern blot鑒定，結(jié)果見圖3。同時以 Ellman法鑒定純化修飾蛋白是否存在自由巰基。由圖3結(jié)果可見，經(jīng)IPTG誘導表達、Western Blot鑒定，只存在單一目的條帶。表達的蛋白以可溶性形式存在于M15菌中。經(jīng)過一系列的純化修飾后，最終所獲得的修飾后的蛋白在整個操作過程中未發(fā)生降解，為單一目的條帶。同時Ellman法鑒定純化修飾蛋白肽段未發(fā)現(xiàn)存在自由巰基，說明最終所獲得的修飾肽段巰基修飾率可達到100%。實施例5 本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶的熒光底物的靈敏度的檢測取本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶的熒光底物和John Owen建立的熒光底物，分別加入4、2或1 μ L的正常枸櫞酸鈉抗凝混合血漿，然后加入反應(yīng)緩沖液。本發(fā)明所述檢測 ADAMTS13酶的熒光底物和John Owen建立的熒光底物的用量均為2. Iymol0在激發(fā)波長 485nm和發(fā)射光波長530nm條件下，每隔3分鐘速率法檢測ADAMTS13酶解本發(fā)明所述檢測 ADAMTS13酶的熒光底物和John Owen建立的熒光底物情況，結(jié)果見圖4。其中，反應(yīng)緩沖液包括 pH6. 3 的 5mMBis-Tris、25mMCaCl2 和 0. 005v/v% Tween20。由圖4結(jié)果可見，以一系列稀釋的正常枸櫞酸鈉抗凝混合血漿酶解本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶的熒光底物和John Owen建立的熒光底物，兩種底物對相同酶量酶解反應(yīng)存在差異，經(jīng)過酶解后，本發(fā)明所述熒光底物所釋放的激光能量ARFU約為John Owen所建熒光底物的兩倍，從而導致本發(fā)明所述熒光底物檢測靈敏度至少比John Owen建立的熒光底物提高約兩倍。實施例6 血漿ADAMTS13酶活性的檢測取4份不同血漿樣品，1號為遺傳性TTP患者血漿，2 4號為非TTP患者血漿， 各取每份血漿ι μ L,加入2. 1 μ mol本發(fā)明所述熒光底物混合，然后加入反應(yīng)緩沖液至 100 μ L0在激發(fā)光波長485nm和發(fā)射光波長530nm條件下，檢測反應(yīng)體系的熒光強度，按照標準曲線法計算待測血漿中ADAMTS13酶活性；其中，所述反應(yīng)緩沖液包括pH6. 3的5mM Bis-Tris、25mMCaCl2 和 0. 005v/v% Tween2。檢測方法為根據(jù)不同體積量正常血漿檢測結(jié)果計算得出標準對數(shù)曲線；根據(jù)4份不同血漿樣品熒光檢測結(jié)果，每份血漿樣品重復一次，計算出4份不同血漿樣品酶解底物的速率，并將該速率進行對數(shù)化，然后以標準對數(shù)曲線為依據(jù)，將4份不同血漿樣品對數(shù)化的斜率通過對數(shù)曲線進行計算，將所得結(jié)果為冪、10為底得出4份不同血漿樣品相應(yīng)斜率下所對應(yīng)的標準血漿體積，每份不同血漿樣品兩次計算結(jié)果除以2得到平均值，即不同血漿樣品中ADAMTS13酶活性，結(jié)果見表1。表1待測血漿ADAMTS13酶活性的檢測
權(quán)利要求
1.一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物，其特征在于，包括如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巰基結(jié)合有熒光基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述熒光底物，其特征在于，所述熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺。
3.—種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物的制備方法，其特征在于，制備具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，然后用能與巰基結(jié)合的熒光基團修飾蛋白即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，所述制備具有編碼SEQID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白的方法具體包括步驟1 制備編碼VWF73的核苷酸序列，與T載體連接，獲得重組T載體； 步驟2 雙酶切步驟1所得的重組T載體，收集VWF73片段，與pQE30表達載體雙酶切所得的大片段重組，獲得PQE30-VWF73重組載體；步驟3 將步驟2所得的pQE30-VWF73重組載體中的VWF73片段N端第4位和第15位的氨基酸定點突變?yōu)榘腚装彼?，然后再刪除PQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端額外氨基酸序列GS，獲得pQE30-VWF73突變重組載體；步驟4 將獲得的pQE30-VWF73突變重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，誘導蛋白表達，分離純化表達的蛋白即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟1所述制備編碼VWF73片段的核苷酸序列具體為用具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的下游引物擴增。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟3具體包括以下步驟A:以pQE30-VWF73重組載體為模板，用具有SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得 PQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端的第4位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒；B 以PQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端的第4位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得PQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端第4 位和第15位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒；C 以pQE30-VWF73重組載體中VWF73片段N端第4位和第15位突變?yōu)榘腚装彼岬馁|(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列的下游引物擴增，甲基酶消化模板，獲得刪除VWF73片段N端額外氨基酸序列 GS的pQE30-VWF73-突變重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于，步驟2所述雙酶切為BamHI和Hind III雙酶切。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4所述宿主細胞為大腸桿菌M15菌株。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，所述能與巰基結(jié)合的熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述制備方法，其特征在于，所述用能與巰基結(jié)合的熒光基團修飾蛋白為取具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，加入3倍摩爾量的磷酸三(β-氯乙基)酯和10倍摩爾量的熒光素-5-馬來酰亞胺，4°C暗室反應(yīng)過夜，之后裝入透析袋，用 pH7. 520mmol/L Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后用聚乙二醇-20000濃縮蛋白即得。
11.權(quán)利要求1所述熒光底物在檢測ADAMTS13酶活性中的應(yīng)用。
12.—種檢測ADAMTS13酶活性的方法，其特征在于，取待測血漿樣品與過量的權(quán)利要求1所述熒光底物在反應(yīng)緩沖液中混合，然后在所述熒光底物所結(jié)合熒光基團相應(yīng)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長下，檢測反應(yīng)體系的熒光強度，按照標準曲線法計算待測血漿樣品中 ADAMTS13酶活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述檢測方法，其特征在于，所述熒光底物用量為2.lymol。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述檢測方法，其特征在于，所述熒光底物所結(jié)合熒光基團為熒光素-5-馬來酰亞胺，所述激發(fā)光波長為485nm，發(fā)射光波長為530nm。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述檢測方法，其特征在于，所述反應(yīng)緩沖液包括pH6.3的5mM Bis-Tris,25mMCaC12 和 0. 005v/v% Tween20。
16.一種檢測ADAMTS13酶活性的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的熒光底物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述試劑盒，其特征在于，還包括反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包括 pH6. 3 的 5mM Bis_Tris、25mMCaCl2 和 0. 005v/v% Tween20。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物及檢測方法。一種檢測ADAMTS13酶活性的熒光底物，包括如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巰基結(jié)合有熒光素-5-馬來酰亞胺。本發(fā)明所述熒光底物的Q1599C與N1611C修飾位點更為接近，同時所述熒光底物N端序列不含額外氨基酸GS，可更有效的被ADAMTS13所酶解。因此可提高檢測ADAMTS13酶活性的靈敏度。本發(fā)明所述檢測ADAMTS13酶活性的方法，操作簡便，檢測結(jié)果準確，靈敏度高，適用于各級醫(yī)院、衛(wèi)生部門和醫(yī)學科研單位快速檢測血漿中ADAMTS13酶活性。
文檔編號C07K1/107GK102533937SQ20121002443
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日
發(fā)明者白霞, 蘇健, 阮長耿 申請人:蘇州大學附屬第一醫(yī)院