專利名稱：一種黃曲霉素M₁人工抗原及其制備的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃曲霉素M1人工抗原及其制備的抗體。
背景技術(shù)：
黃曲霉素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，為二氫呋喃香豆素的衍生物，是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的代謝物。天然污染的食品中以黃曲霉素B1 (AFB1)最為多見，其毒性和致癌性也最強。哺乳動物攝入被AFB1污染的飼料或者食品后，一部分蓄積于動物的可食部位，另一部分經(jīng)過體內(nèi)一系列代謝，末端呋喃環(huán)C-IO被羥化(即黃曲霉素M1，又稱AMF1),存于動物分泌的乳汁和產(chǎn)生的尿液中。已有的研究表明，反芻動物對大多數(shù)霉菌毒素的敏感性較弱，但是一次性攝入大量的霉菌毒素或長期小劑量攝入也會給奶牛帶來營養(yǎng)不良、生產(chǎn)緩慢、免疫力下降等危害。AMF1的毒性主要表現(xiàn)在致癌性和致突變性，能夠造成DNA的某些損傷，引起DNA結(jié)構(gòu)和功能的改變，因此動物乳中AMFi的存在會對人類的健康造成危害。AMF1相對穩(wěn)定，缺乏行之有效的防治和去毒方法，所以必須對食品中特別是乳及乳制品制定嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，一方面能控制人體對AMF1的攝入量，另一方面也能加強對乳及乳制品生產(chǎn)企業(yè)品質(zhì)的管理，從而向消費者提供放心食品。1995年，世界衛(wèi)生組織制定的食品黃曲霉素最高允許濃度為15 μ g/kg。我國今年發(fā)布的《GB 2761-2011食品中真菌毒素限量》國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定食品中AMF1在乳及乳制品中的限量為O. 5yg/kg。美國聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費的牛奶中的含量不能超過O. 5 μ g/kg，其他動物飼料中的含量不能300yg/kg。而歐盟國家規(guī)定更加嚴(yán)格，原奶、熱處理奶及加工奶產(chǎn)品中AMF1限量為
O.05 μ g/kg,嬰兒食品(包括嬰幼兒奶)中AMF1限量為O. 025 μ g/kg。因此建立特異、敏感的黃曲霉素M1的檢測方法是當(dāng)務(wù)之急?，F(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)和文獻中對AMF1的檢測方法約有四種，分別為免疫親和柱法、HPLC法、TLC法和ELISA法。前三種方法需要提取凈化的前處理操作煩瑣，復(fù)雜，費時費力。迫切需要靈敏度高、特異性強、親和力好的單克隆抗體，以建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的ELISA檢測方法，為鮮奶及奶粉中黃曲霉素污染的快速篩選提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黃曲霉素M1人工抗原及其制備的抗體。本發(fā)明提供了一種化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物為將黃曲霉素札進行結(jié)構(gòu)改造得到的化合物，既最大程度保留了黃曲霉素M1的特征結(jié)構(gòu)，又具有可以與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)的活性基團。本發(fā)明還保護式(I)所示化合物的制備方法，包括如下步驟將黃曲霉素M1和對肼基苯甲酸反應(yīng)，獲得所述化合物。所述反應(yīng)具體可在無水吡啶中進行。所述黃曲霉素M1和所述對肼基苯甲酸的質(zhì)量比具體可為I : I。所述制備方法還包括如下步驟將完成所述反應(yīng)的體系旋蒸除去吡啶，將殘留物用甲醇溶解，以二氯甲烷甲醇(體積比9 I)為展開劑，通過薄層層析分離純化，收集比移值(&值)為O. 35的樣本，即為式(I)所示化合物。本發(fā)明還保護一種黃曲霉素M1人工抗原，為將式(I)所示化合物與載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。式(I)所示化合物與載體蛋白的偶聯(lián)比具體可為(8-10) I。所述偶聯(lián)比指的是摩爾比。式(I)所示化合物與所述載體蛋白具體可通過活性酯法偶聯(lián)。所述黃曲霉素M1人工抗原如式(II)所示。所述黃曲霉素札人工抗原可以作為免疫原也可以作為包被原。將所述黃曲霉素人工抗原免疫動物，可獲得高特異性的單克隆抗體和多克隆抗體，方法簡便、易行。將所述黃曲霉素M1人工抗原包被酶標(biāo)板，也可以用于黃曲霉素抗血清的檢測。包被原與免疫原結(jié)構(gòu)上的差異可以進一步提高檢測的靈敏度和特異性。
權(quán)利要求
1.式⑴所示化合物；
2.權(quán)利要求I所述化合物的制備方法，包括如下步驟將黃曲霉素Ml和對肼基苯甲酸反應(yīng)，獲得所述化合物。
3.權(quán)利要求I所述化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
5.權(quán)利要求3或4所述偶聯(lián)物在制備黃曲霉素特異性抗體中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
7.以權(quán)利要求3或4所述偶聯(lián)物為免疫原制備得到的單克隆抗體。
8.抗黃曲霉毒素單克隆抗體雜交瘤細胞2A1，它的保藏編號為CGMCCNo. 5779。
9.權(quán)利要求8所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求3或4所述偶聯(lián)物，或，權(quán)利要求7或9所述單克隆抗體在檢測黃曲霉素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃曲霉素M1人工抗原及其制備的抗體。本發(fā)明提供了一種化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物為將黃曲霉素M1進行結(jié)構(gòu)改造得到的化合物，既最大程度保留了黃曲霉素M1的特征結(jié)構(gòu)，又具有可以與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)的活性基團。本發(fā)明還保護一種黃曲霉素人工抗原，為將式(I)所示化合物與載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。將所述黃曲霉素人工抗原免疫動物，可獲得高特異性的單克隆抗體和多克隆抗體，方法簡便、易行。所述人工抗原可用于檢測黃曲霉素。所述抗體可用于檢測黃曲霉素。式(I)
文檔編號C07K14/77GK102617589SQ201210044659
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者丁雙陽, 史為民, 吳聰明, 李建成, 江海洋, 沈建忠, 溫凱, 王戰(zhàn)輝 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)