專利名稱：楊梅醇和/或楊梅酮在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體涉及楊梅醇和/或楊梅酮在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
癌癥是嚴重威脅人類健康的疾病之一，是僅次于心血管疾病的人類第二大殺手， 也是世界各國面臨的重要社會問題之一。據統(tǒng)計2008全球新發(fā)病癌癥病人約1270多萬， 死亡病人約760多萬。而到2030，全球估計新發(fā)病癌癥病人約2100多萬，死亡病人約1320 多萬，其中60%以上在發(fā)展中國家。近年來，我國腫瘤每年新發(fā)病例約為220萬，死亡人數約為160萬。由于藥物是治療腫瘤的主要手段之一，所以抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)不僅是生命科學領域中富有挑戰(zhàn)性的課題，而且具有重大社會意義和經濟價值。目前已有手術、化療、放療及新興的生物療法等多種手段來控制腫瘤的生長和轉移，從而延長癌癥患者生命，改善其生活質量。癌癥的發(fā)病機理復雜，同時藥物固有的不良反應、療效的局限性和不斷出現的耐藥性等，促使科研人員不斷地尋找療效更好、毒性更小、作用機理新穎的新型抗癌藥物和方法。中藥抗腫瘤作用具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應的特點，可作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，同時其毒副作用低，能提高機體免疫力，不易產生耐藥性，因此中藥及其有效成分預防和治療腫瘤的作用具有一定的優(yōu)勢，從天然成分中尋找毒副作用小，作用獨特的抗腫瘤藥物，為近年來研究的熱點。而我國有豐富的中藥材資源以及數千年的中醫(yī)藥理論與實踐經驗，因此從傳統(tǒng)的中草藥中篩選抗癌作用強、毒副作用小的藥物成為目前開發(fā)新的抗癌藥物的方向之一。1 [Myrica ruba (Lour. ) Sieb. et Zucc. ](Myricae)(Myrica) 植物，常綠喬本，為我國特產水果，栽培面積占全球的99%以上，地理位置大致分布在北緯 18° 33°之間，但經濟栽培主要集中在東南沿海的浙江、江蘇、福建、廣東、江西等省，其中浙江省的栽培面積、產量、品種、品質均為全國之首，目前已超過6萬多公頃(hm2)，約占全國總面積的40%。楊梅樹皮味苦、性溫，具有散瘀止血、止痛之功效，民間用于治療跌打損傷、骨折、 痢疾、胃和十二指腸潰瘍、牙痛等。楊梅樹皮的水溶性乙醇提取液在體外表現出睪丸激素 5 α還原酶抑制活性，在體內具有抗雄性激素活性的作用，楊梅酮(myricanone)、楊梅醇 (myricanol)和楊梅素(myricetin) 3種成分是主要活性物質。楊梅樹皮提取物中楊梅醇、 楊梅酮抗腫瘤作用未見報道。中國專利2007100274M. 8本發(fā)明公開了一種新型天然抗腫瘤活性化合物，是一種具有全新分子骨架的化合物，結構新穎、抗腫瘤活性強，可來源于楊梅植物資源，安全性高；同時公開了其制備方法，浸提楊梅植株粗粉，減壓濃縮，用水分散后，用適宜的有機溶劑萃取，分離提純得到所述的化合物，所述化合物在制備抗腫瘤藥物領域應用前景廣闊，為醫(yī)學上開發(fā)攻克腫瘤的天然藥物打下了基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供楊梅醇和/或楊梅酮的一種新用途，具體為楊梅醇和/或楊梅酮在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述的楊梅醇的分子式為C21H26O5,結構式如下
OH
H3CO.
H3CO. HO.
OH所述的楊梅酮的分子式為C21H24O5,結構式如下所述的楊梅醇或楊梅酮可采用市售的藥用級楊梅醇或楊梅酮，也可按照如下方法制備用體積百分濃度為50% 95%的乙醇水溶液作為提取劑，從楊梅樹皮中提取得到楊梅樹皮醇提取物，濃縮揮干乙醇后加水混勻，用萃取劑氯仿或者二氯甲烷萃取，得到萃取物，再用硅膠柱或制備液相分離，分別得到楊梅醇和楊梅酮。為了達到更好的提取效果，優(yōu)選所述的提取的條件為在50°C 100°C至少提取二次，每次提取時間為1小時 4 小時，進一步優(yōu)選回流提取。每次提取所述的楊梅樹皮與乙醇水溶液的重量比為1 1.0 6. O。所述的楊梅樹皮醇提取物一般濃縮至濃度為0. 2g 3. Og生藥/ml。每次萃取濃縮后楊梅樹皮醇提取物與萃取劑的重量比為1 0. 5 4. O。所述的萃取的次數為至少二次，每次萃取的時間為1小時 4小時。所述的萃取物一般回收萃取劑后再經硅膠柱或制備液相分離，回收萃取劑的溫度為 50°C 100°C。所述的硅膠柱的條件為硅膠為200目 300目，硅膠填料體積為上樣量體積的 30倍 70倍，洗脫劑為石油醚乙酸乙酯=10 4(體積比)。所述的抗腫瘤藥物包括用于預防和/或治療肝癌的藥物、用于預防和/或治療肺癌的藥物、用于預防和/或治療白血病的藥物、用于預防和/或治療胃癌的藥物或用于預防和/或治療其他腫瘤的藥物?？赏ㄟ^注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體，如肌肉、皮內、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質混合或包裹后導入機體。需要的時候，所述的抗腫瘤藥物中還可以包含一種或多種藥學上可以接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體等。所述的抗腫瘤藥物可制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種劑型。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。所述的楊梅醇和/或楊梅酮的用量一般為5mg 200mg/kg體重/天，療程為10 至15天。本發(fā)明制備楊梅樹皮提取物(楊梅醇和/或楊梅酮)方法簡單、成本低廉。實驗證明，本發(fā)明的楊梅醇和/或楊梅酮能夠有效的抑制人腫瘤細胞的生長，如人肝癌、肺癌、 白血病或胃癌等。因此本發(fā)明所提供的楊梅樹皮提取物對制備抗腫瘤藥物，尤其是抗肝癌、 肺癌、白血病藥物具有重要意義。


圖1為實施例1中氯仿萃取物的HPLC譜圖，橫坐標為分鐘(Minutes)；圖2為楊梅酮的HPLC譜圖，橫坐標為分鐘(Minutes)；圖3為楊梅醇的HPLC譜圖，橫坐標為分鐘(Minutes)；圖4為楊梅酮樣品液質聯(lián)用分析圖譜，其中，a和c為質譜圖，b為液相譜圖；圖5為楊梅醇樣品液質聯(lián)用分析圖譜，其中，d和f為質譜圖，e為液相譜圖；圖6為RPMI1640培養(yǎng)液對照對H印G_2細胞體外增殖的影響的顯微鏡下圖片；圖7為12. 5 μ g/ml楊梅酮對H印G_2細胞體外增殖的影響的顯微鏡下圖片；圖8為12. 5 μ g/ml楊梅醇對H印G_2細胞體外增殖的影響的顯微鏡下圖片。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、楊梅醇及楊梅酮的制備取干燥清潔的楊梅樹皮藥材lOOOg，剪碎，置于蒸餾燒瓶中，加3000ml (2496g)體積百分濃度為80%的乙醇水溶液，80°C水浴回流提取2次，每次2小時，合并2次提取液，過濾，濾液減壓濃縮至濃度為0. 2g生藥/ml，回收乙醇，干燥，得楊梅樹皮醇提物300g。楊梅樹皮醇提物加水熱溶后，每次萃取用楊梅樹皮醇提物重量1. 6倍量氯仿，萃取二次，合并各萃取液，分別于旋轉蒸發(fā)儀上80°C回收溶劑，真空減壓干燥至恒重，得氯仿萃取物26. 6g。氯仿萃取物用200 300目硅膠柱層析分離，硅膠填料體積為上樣量體積的50倍，洗脫劑為石油醚乙酸乙酯=10 4 (體積比)，每30ml收集一次，結合薄層色譜(TLC)分別收集與楊梅醇標準品TLC 一致的洗脫液以及與楊梅酮標準品TLC 一致的洗脫液，純化分別得到楊梅醇、楊梅酮。所得的氯仿萃取物、楊梅酮、楊梅醇在HPLC上進行分析，譜圖分別如圖1-圖3 楊梅醇、楊梅酮樣品在HPLC上的峰值均與氯仿萃取物上的峰值相對應，可見特征性峰值。HPLC的條件為檢測波長250nm，流動相為體積百分濃度為55%的甲醇水溶液， YMC-pack ODS-A (C18 柱)色譜柱(250 X 46讓，5 μ m)，柱溫25°C，進樣量1 μ 1。所得的楊梅酮、楊梅醇在液質聯(lián)用(LS/MS)上進行分析，譜圖分別如圖4-圖5 楊梅醇、楊梅酮樣品在LS/MS測得分子量分別為358與356。LS/MS的條件為檢測波長為DAD 190 400nm，流動相為體積百分濃度為45% 的乙腈-水溶液，ACQUITY UPLC BEH C18 柱(10(toimX2. 1 讓，1. 7 μ m)，柱溫;35°C，進樣量 1 μ 1。楊梅醇鑒別如下=C21H26O5,為白色粉末，(CHCl3)mpl93.5 °C 194. 8 °C, [a] 20D :-65. 5 ° (c 0. 37，MeOH) ;UV(MeOH) λ max nm (log ε ) :256 (3· 24)，354 (2· 38)； IRYmax(KBr)CnT1 :3391, 2943, 2867, 1637，1468，1386，1362，1179，1134，1054，1080， 1028,1003,865,813,691 ；ESIMS (positive)m/ζ :358. 9[Μ+Η]+ ；1H-NMR (600MHz, CDCl3) δ 7. 69 (1Η, s, 17-0Η)，7. 18 (1Η, s, Η-19)，7. 10 (1Η, dd, J = 8. 2，1. 5Ηζ, Η-15)，6. 91 (1Η, d, J = 8. 2Ηζ, Η-16)，6. 90 (1Η, d, J = 1. 9Ηζ, Η-18)，4. 10 (1Η, d, J = 9. 8Ηζ, Η-11)，4. 00 (3Η, s，3-0CH3)，3· 88 (3Η, s，4_0CH3)，2· 91 (2Η, m, 11—0Η，Η-13)，2· 88 (1Η, d, J = 18. 4Ηζ, H-7a)，2. 55 (1Η, m, H_7b)，2. 34 (1H, m, H_12b)，1. 93 (3H, m, H_8，10b)，1. 6 (3H, m, H_9，10a, 12a) ； 13C-NMR(150MHz, CDCl3) δ 151. 4(C-17)，147. 7 (C_5)，145. 9(C_3)，138. 7 (C_4)， 133. 1 (C-18) , 130. 7 (C-14) , 129. 9(C_15) , 129. 4(C_19) , 124. 7 (C-I) , 123. 4 (C_2)， 122. 6 (C-6) ,116. 9 (C-16)，68. 6 (C-Il) ,61. 4 (3_0CH3，4_0CH3)，39. 4 (C-IO)，34. 8 (C-12)， 26. 9 (C-13)，25. 8 (C_8)，25. 4 (C_7)，22. 9 (C_9)。與楊梅醇 Myricanol (C21H26O5)標準品的物化性質、光譜數據一致，為楊梅醇。楊梅酮鑒別如下=C21H24O5,為白色粉末，(CHCl3)mpl81.2°C 182. 1°C, UV(MeOH) λ max nm(log ε ) :259(3. 62) ,298 (2. 89) ； IR y max (KBr) cm-1 :3382,3028,2938,2915, 1735，1702，1610，1508，1492，1455，1438，1436，1427，1405，1347，1263，1244，1223，1192， 1142,1113,1092,1069,1043,984,950,819,615 ；ESIMS(positive)m/z :357. 1 [M+H]+； 1H-WR (600MHz，CDCl3) δ 7. 67 (1H，s，5-0H)，7. 10(lH，dd，J = 8. 0,2. 0Hz，H_15)，6. 88 (1H, d, J = 8.0Hz，H-16) ,6. 90 (1H, d, J = 2.0Hz，H—18)，6. 61 (1H，s, H—19)，5. 88 (1H，s, 17-0H)，3. 99 (3H, s，4_0CH3)，3. 81 (3H, s, 3-0CH3)，3. 02 (2H, m, Η-13) ,2. 81 (3H, m, H-12)， 2. 78 (2H, m, H_10)，2. 72 (2H, m, H-7)，1. 93 (1H, q, J = 6. 7Hz, H_8)，1. 85 (1H, q, J = 7. 3Hz, H-9)，1. 6(1H, s，11-0H) ； 13C-NMR(150MHz, CDCl3) δ 213. 6(C-11)，151. 7(C_17)， 147. 8 (C-3)，146. 0 (C_5)，138. 7 (C_4)，132. 4 (C-14)，132. 3 (C-18)，128. 9 (C—15，19)， 125. 5 (C-I)，123. 2 (C-2)，123. 1 (C-6) ,116. 9 (C-16)，61. 5 (3-0CHs) ,61. 3 (4_0CH3)， 46. 2(C-10)，42. 6(C-12)，28. 8(C-13)，26. 8(C-8)，24. 5(C-7)，21. 9(C-9)。與楊梅酮 Myricanone (C21H24O5)標準品的物化性質、光譜數據一致，為楊梅酮。實施例2、楊梅醇及楊梅酮的體外抗腫瘤作用
1、實驗材料(1) RPMI1640培養(yǎng)液250ml/瓶，吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司生產，批號 20110720。(2)0. 25% (質量百分比)Trypsin (胰蛋白酶)含0.02% (質量百分比)乙二胺四乙酸(EDTA)，IOOml/瓶，吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司生產，批號11090901。(3)超級新生牛血清200ml/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司生產，批號 080304。(4)氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)中國科學院上海應用物理研究所生產，濃度 lmci/ml，比度 4ci/mM，批號 100430，使用前用 Hank' s 液配成 20 μ ci/ml。(5)96孔平底培養(yǎng)板上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司生產；(6)!1印6-2(人肝癌細胞)、1_60細胞株(人白血病細胞)中國科學院上海藥物研究所引進，液氮保存。A549細胞株(人肺腺癌細胞)浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤所提供，液氮保存。2、實驗儀器(1) 二氧化碳培養(yǎng)箱型號3165型，美國R)rma公司生產。(2)液閃儀型號2050型，PACKARD公司生產。(3) XS-M細胞收集儀浙江紹興坡壙醫(yī)療器械廠生產。(4) GS-6R 離心機Beckman 公司生產。(5)HR40-II-A2醫(yī)用凈化工作臺A2型，30%外排，70循環(huán)，青島海爾特種電器有
限公司生產。(6)BS210S 電子天平Sartorius 公司生產。(7) CK40-F200倒置顯微鏡日本OLYMPUS公司生產。(8)YXQ-208SD電熱蒸汽滅菌器嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司生產。3、實驗方法及結果取3種對數生長期腫瘤細胞株(HL_60、A549及H印G_2等)，按腫瘤藥敏試驗方法制成5X104個細胞/ml濃度單細胞懸液(貼壁細胞株用質量百分比0. 胰蛋白酶消化后配置)，取IOOul分別加至96孔平底培養(yǎng)板中，37°C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后分別加入不同濃度(1. 56 50 μ g/ml)的實施例1中的氯仿萃取物、楊梅醇及楊梅酮100 μ 1 (溶劑為含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液)，每一藥物濃度做3個復孔，同時作含10% (質量百分比) FCS (胎牛血清)的培養(yǎng)液對照，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 后分別加入含0. 3 μ Ci3H-TdR 的培養(yǎng)液50 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)16h，常規(guī)收集細胞，測定每個樣品脈沖數(cpm)，用三孔的平均 cpm計算出不同濃度氯仿萃取物、楊梅醇及楊梅酮對3種腫瘤細胞株的抑制率。結果見表 1 表3和圖6 圖8。表1 楊梅醇及楊梅酮對HL-60細胞的抑制作用SI )
權利要求
1.一種楊梅醇和/或楊梅酮在制備抗腫瘤藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物包括用于預防和/或治療肝癌的藥物、用于預防和/或治療肺癌的藥物、用于預防和/或治療白血病的藥物、用于預防和/或治療胃癌的藥物或用于預防和/或治療其他腫瘤的藥物。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的楊梅醇或楊梅酮的制備方法包括 用體積百分濃度為50% 95%的乙醇水溶液作為提取劑，從楊梅樹皮中提取得到楊梅樹皮醇提取物，濃縮揮干乙醇后加水混勻，用萃取劑氯仿或者二氯甲烷萃取，得到萃取物，再用硅膠柱或制備液相分離，分別得到楊梅醇和楊梅酮。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的提取的條件為在50°C 100°C至少提取二次，每次提取時間為1小時 4小時。
5.根據權利要求3或4所述的應用，其特征在于，所述的提取為回流提取。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，每次提取所述的楊梅樹皮與乙醇水溶液的重量比為1 1.0 6.0。
7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，濃縮至濃度為0.2g 3. Og生藥/ml。
8.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，每次萃取濃縮后楊梅樹皮醇提取物與萃取劑的重量比為1 0.5 4.0。
9.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的萃取的次數為至少二次，每次萃取的時間為1小時 4小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種楊梅醇和/或楊梅酮在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述的抗腫瘤藥物包括用于預防和/或治療肝癌的藥物、用于預防和/或治療肺癌的藥物、用于預防和/或治療白血病的藥物、用于預防和/或治療胃癌的藥物或用于預防和/或治療其他腫瘤的藥物。本發(fā)明證實楊梅醇及楊梅酮具有較好的抗腫瘤作用，且楊梅醇及楊梅酮對正常細胞毒性低，應用于制備抗腫瘤藥物，高效低毒，符合藥物發(fā)展的要求。
文檔編號C07D311/30GK102552243SQ201210050218
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權日2012年2月29日
發(fā)明者任澤明, 戴關海, 楊鋒, 童曄玲, 陳宇 申請人:浙江省中醫(yī)藥研究院