專利名稱：用模擬移動床色譜分離提純葡萄皮白藜蘆醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡萄皮白藜蘆醇的分離方法，特別是采用模擬移動床色譜分離提純葡萄皮白藜蘆醇的方法。
背景技術(shù)：
在1940年首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇，20世紀(jì)70年代首次發(fā)現(xiàn)葡萄中含有這種物質(zhì)，后來人們發(fā)現(xiàn)虎杖、花生、桑椹等植物中也含有這種成分。天然白藜蘆醇是一種天然活性成分， 它能以游離態(tài)(順式、反式)和糖苷結(jié)合態(tài)(順式、反式)2種形式在植物(如中藥材虎杖) 中分布及生物合成，且均具有抗氧化效能，其中反式異構(gòu)體的生物活性強(qiáng)于順式，是葡萄中的一種重要的植物抗毒素。人們對其自然資源進(jìn)行了廣泛的研究，目前至少在21個科、31 個屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，如葡萄科的葡萄屬、蛇葡萄屬，豆科的落花生屬、決明屬、槐屬，百合科的藜蘆屬，桃金娘科的桉屬，寥科的寥屬等。含白藜蘆醇的許多植物是常見的藥用植物，如決明、藜蘆、虎杖等，有的就是食物，如葡萄。葡萄皮中白藜蘆醇的含量最高，可達(dá)50 100mg/kg。白藜蘆醇(化學(xué)名為芪三酚)是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保護(hù)肝臟、保護(hù)心血管和抗心肌缺血等功能，其中，最令人矚目和最有發(fā)展前景的是抗腫瘤作用，被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物。進(jìn)行抗癌藥物類白藜蘆醇的開發(fā)與應(yīng)用研究，首先要獲得大量高純度的白藜蘆醇。目前報(bào)道的白藜蘆醇的提取純化方法有有機(jī)溶劑萃取法、雙水相萃取法、柱層析法、高速逆流色譜法。由于葡萄皮浸膏成分復(fù)雜，而其白藜蘆醇含量過低，所以浸取和萃取是白藜蘆醇分離的基礎(chǔ)步驟，要想得到高純度的白藜蘆醇，須進(jìn)一步純化。進(jìn)一步純化的方法常采用柱層析法、結(jié)晶法。無論是低壓正相柱層析還是高壓反相柱層析，層析柱色譜所固有的柱效低、不連續(xù)性、成本高等不足依然存在，而結(jié)晶法要求有較高的含量。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，中國專利公開(公告)號CN1351985名稱為“一種白藜蘆醇的生產(chǎn)工藝及其在食品飲料葡萄酒中的運(yùn)用”。此項(xiàng)公開是白藜蘆醇的生產(chǎn)工藝，特征在于將葡萄皮經(jīng)分選去雜、漂洗、粉碎、95 %乙醇提取、乙醇浸膏、酒石酸溶解、乙醚萃取酸溶液、乙醚萃取液減壓濃縮、乙醚提取物、硅膠柱層析、收集丙酮、氯仿洗脫液(I I)、洗脫液濃縮、 乙醇重結(jié)晶，生產(chǎn)出葡萄皮白藜蘆醇；中國專利公開(公告)號CN102304028A名稱為“一種分離純化虎杖中白藜蘆醇的方法”。此項(xiàng)公開的內(nèi)容特征在于用丙酮-水作為提取劑， 在提取液中所提液中加入親脂性溶劑，構(gòu)成丙酮-水-親脂性溶劑組成的三元兩相液-液萃取系統(tǒng)，富集了白藜蘆醇的親脂性溶劑減壓濃縮，放置析出白藜蘆醇；中國專利公開(公告)號CN102250969A名稱為“從虎杖中制備高純度白藜蘆醇的工藝”。此項(xiàng)公開的內(nèi)容特征在于用高溫酵母+糖化酶為專用微生物使虎杖白藜蘆醇的類似物轉(zhuǎn)化成虎杖甙或白藜蘆醇，再用低溫酵母使虎杖甙轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇，用乙酸乙酯或乙酸丁酯萃取，用氧化鋁柱層析純化，最后重結(jié)晶的99%白藜蘆醇；中國專利公開(公告)號CN102320934A名稱為“一種從虎杖根莖中提取白藜蘆醇的新方法”。此項(xiàng)公開內(nèi)容的特征在于虎杖根莖加醇回流提取，提取液濃縮至無醇，加酸和穩(wěn)定劑加熱水解，水解液調(diào)PH至中性，靜置析出晶體。以上四項(xiàng)公開的內(nèi)容是用有機(jī)溶劑萃取法、柱層析法、結(jié)晶法純化白藜蘆醇，有機(jī)溶劑萃取法、 柱層析法、結(jié)晶法自身固有的不足依然存在。模擬移動床色譜分離技術(shù)近年來發(fā)展非常迅速，很多專利文獻(xiàn)報(bào)道了模擬移動床色譜法分離手性藥物，如光學(xué)異構(gòu)體、外消旋物質(zhì)和對映體，以及二甲苯異構(gòu)體的分離。其中US5，518，625專利文獻(xiàn)涉及了心得安，氨酰心安和3 —氯一苯一 I 一丙醇的手性分離。德國德雷斯頓藥品工業(yè)有限公司在中國專利局申請了用模擬移動床色譜分離法制取高純環(huán)苞菌素的專利。日本代科化學(xué)株式會社和日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會社開發(fā)了模擬移動床法分離甲羥戊酸內(nèi)酯類化合物技術(shù)。中國鞍山科技大學(xué)開發(fā)了模擬移動床色譜分離卡波前列腺甲酯和生物藥物替考拉寧技術(shù)以及富勒烯C6tl的模擬移動床色譜分離方法。但是，對于葡萄皮白藜蘆醇的模擬移動床色譜分離方法仍未見公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用模擬移動床色譜分離提純葡萄皮白藜蘆醇的方法，以提高白藜蘆醇產(chǎn)品純度和收率。本發(fā)明提供的用模擬移動床色譜分離提純葡萄皮白藜蘆醇的方法包括以下步驟I原料選擇用醇提法得到的葡萄皮浸膏，白藜蘆醇質(zhì)量百分比含量10%。2以甲醇水溶液為流動相，用模擬移動床進(jìn)行純化。2. I設(shè)備及條件選擇采用模擬移動床色譜系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括洗脫泵、進(jìn)樣泵、萃取泵、色譜柱、7通閥、 9通閥、4通和連接管組成。洗脫泵流量0-5mL/min，壓力O-IOMpa ;進(jìn)樣泵流量0_5mL/ min，壓力0-8Mpa ;萃取泵流量0_5mL/min，壓力O-IOMpa ;工作溫度25_30°C。色譜柱為 IOmmX200mm的半制備柱。2. 2色譜柱填料及流動相選擇
選用反相ODS填料，粒度為25-35um，流動相為甲醇水溶液。
2. 3分尚步驟
2. 3. I樣液的配制
以葡萄皮乙醇浸提膏為原料，其中含質(zhì)量百分比白藜蘆醇10%，用質(zhì)量百分比70%甲醇水溶液溶解、0. 45 um濾膜過濾，濾液濃度為50g/L。
2. 3. 2流動相的配制
甲醇水=I KV V)
2. 3. 3模擬移動床色譜參數(shù)
色譜柱分配方式解吸段I根柱、精制段I根柱、吸附段2根柱。
各泵參數(shù)進(jìn)樣泵流速Uf = 0. lmL/min,洗脫泵流速Ud = I. 5mL/min,萃取泵流速Ue = I.OmL/min,殘余液流速 Ur = I. 6mL/min。
操作溫度:25-30 0C o
切換時間切換時間ts = 18. 0 19. Omin，萃取液E為產(chǎn)品；
2. 3. 4濃縮
殘余液及萃取液分別用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至無液體，用甲醇洗出后在真空干燥箱轟干至恒重。3HPLC 法檢測檢測條件=Diamonsil色譜柱，ODS 填料，5 y m，4. 6 X 150mm，2SPD-10AVP UV 檢測器，流動相甲醇:水=50 50 (V/V)，流速I. OmL/min,檢測波長是308nm,進(jìn)樣量20uL,室
溫。由白藜蘆醇對照品來確定產(chǎn)品中的組分，并由外標(biāo)法標(biāo)定白藜蘆醇的純度為98%以上。本發(fā)明提供的用模擬移動床色譜分離提純葡萄皮白藜蘆醇的方法與柱色層法、高效液相色譜法(HPLC)相比，其顯著優(yōu)勢在于能連續(xù)高效的從葡萄皮浸膏(白藜蘆醇含量 10% )中分離提純出高純度的白藜蘆醇，白藜蘆醇產(chǎn)品純度達(dá)到98%，收率達(dá)到85%，白藜蘆醇的集中度高，節(jié)省大量的流動相，并且能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)，大大降低生產(chǎn)成本。


圖I葡萄皮95%乙醇浸提膏液的HPLC譜圖；圖2模擬移動床殘余液(R)的HPLC譜圖；圖3模擬移動床萃取液(E) HPLC譜圖；圖4模擬移動床色譜系統(tǒng)連續(xù)操作時相鄰兩次切換切換前狀態(tài)示意圖；圖5模擬移動床色譜系統(tǒng)連續(xù)操作時相鄰兩次切換切換后狀態(tài)示意圖。
具體實(shí)施例方式以實(shí)驗(yàn)室提純葡萄皮白藜蘆醇為例，取10克葡萄皮浸膏(白藜蘆醇含量10% )， 用質(zhì)量百分比70%甲醇水溶液溶解、0. 45 um濾膜過濾，配制成200mL，作為模擬移動床的分離原料，原料液的HPLC譜圖如圖I所示。以甲醇水溶液為流動相，用模擬移動床進(jìn)行純化。模擬移動床實(shí)驗(yàn)操作將樣品原料液，以每小時6mL的流速進(jìn)入模擬移動床。如圖4、圖5所示，切換時間為19min，流動相為甲醇水=5 5 (V V)，III帶(吸附帶，殘余液)流速I. 6mL/min，I 帶(解吸帶，萃取液)流速I. OmL/min, II帶(精制帶)流速I. 5mL/min。得到了濃度較低的萃取液和萃余液，其中萃余液為模擬移動床分離純化白藜蘆醇所得的產(chǎn)品液。殘余液及萃取液分別用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至無液體，用甲醇洗出后在真空干燥箱轟干至恒重。產(chǎn)品液濃縮得到白藜蘆醇產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測純度為98 %，收率85 %。檢測條件=Diamonsil色譜柱，ODS 填料，5 y m，4. 6 X 150mm，2SPD-10AVP UV 檢測器，流動相甲醇:水=50 50 (V/V)，流速I. OmL/min,檢測波長是308nm,進(jìn)樣量20uL,室
溫。檢測結(jié)果見圖2、圖3。由白藜蘆醇對照品來確定產(chǎn)品中的組分，并由外標(biāo)法標(biāo)定白藜蘆醇的純度為98%以上。
權(quán)利要求
1.一種用模擬移動床色譜分離提純葡萄皮白藜蘆醇的方法，其特征在于該方法包括以下步驟I原料選擇用醇提法得到的葡萄皮浸膏，白藜蘆醇質(zhì)量百分比含量10% ；2以甲醇水溶液為流動相，用模擬移動床進(jìn)行純化；.2.I設(shè)備及條件選擇采用模擬移動床色譜系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括洗脫泵、進(jìn)樣泵、萃取泵、色譜柱、7通閥、9通閥、4通和連接管組成,洗脫泵流量0-5mL/min,壓力O-IOMpa ;進(jìn)樣泵流量0-5mL/min,壓力 0-8Mpa ;萃取泵流量0-5mL/min，壓力O-IOMpa ;工作溫度25_30°C，色譜柱為10_X200_ 的半制備柱；.2.2色譜柱填料及流動相選擇選用反相ODS填料，粒度為25-35um，流動相為甲醇水溶液；.2.3分尚步驟 2. 3. I樣液的配制以葡萄皮乙醇浸提膏為原料，其中含質(zhì)量百分比白藜蘆醇10%，用質(zhì)量百分比70%甲醇水溶液溶解、0. 45 um濾膜過濾，濾液濃度為50g/L ；.2.3. 2流動相的配制甲醇水=I KV V).2.3. 3模擬移動床色譜參數(shù)色譜柱分配方式解吸段I根柱、精制段I根柱、吸附段2根柱；各泵參數(shù)進(jìn)樣泵流速Uf = 0. lmL/min,洗脫泵流速Ud = I. 5mL/min,萃取泵流速Ue =I. OmL/min,殘余液流速 Ur = I. 6mL/min ；操作溫度25-30°C ；切換時間切換時間ts = 18. 0 19. Omin，萃取液E為產(chǎn)品；.2. 3. 4濃縮殘余液及萃取液分別用薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至無液體，用甲醇洗出后在真空干燥箱轟干至恒重；3HPLC法檢測檢測條件Diamonsil色譜柱，ODS填料，5 y m，4. 6 X 150mm, 2SPD-10AVPUV檢測器，流動相甲醇水=50 50 (V/V)，流速I. OmL/min,檢測波長是308nm,進(jìn)樣量20uL,室溫，由白藜蘆醇對照品來確定產(chǎn)品中的組分，并由外標(biāo)法標(biāo)定白藜蘆醇的純度為98%以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用模擬移動床色譜分離提純葡萄皮白藜蘆醇的方法，以提高白藜蘆醇產(chǎn)品純度和收率。該方法包括以下內(nèi)容原料選用醇提法得到的葡萄皮浸膏；以甲醇水溶液為流動相，用模擬移動床進(jìn)行純化；色譜柱填料及流動相選用反相ODS填料，粒度為25-35um，流動相為甲醇水溶液。分離步驟包括樣液的配制；流動相的配制；濃縮；HPLC法檢測。本發(fā)明與柱色層法、高效液相色譜法(HPLC)相比，能連續(xù)高效的從葡萄皮浸膏中分離提純出高純度的白藜蘆醇，白藜蘆醇產(chǎn)品純度達(dá)到98％，收率達(dá)到85％，白藜蘆醇的集中度高，節(jié)省大量的流動相，并且能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)，大大降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C07C39/21GK102603492SQ20121005183
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者叢景香, 張麗華, 李秋菊, 賴仕全, 趙雪飛, 高麗娟 申請人:遼寧科技大學(xué)