專利名稱：G蛋白偶聯(lián)受體的分離提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體是應(yīng)用超濾技術(shù)分離提純G蛋白偶聯(lián)受體的方法。
背景技術(shù)：
G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCRs)是具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜蛋白，它可以與激素、神經(jīng)遞質(zhì)、光、氣味等小分子物質(zhì)發(fā)生相互作用，在細(xì)胞信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用。人類重大疾病的發(fā)生(如自身免疫性、傳染性、過(guò)敏性疾病等)都與 GPCRs功能紊亂有關(guān)。目前，三分之二以上的藥物開發(fā)以及十分之一以上的世界前200種最暢銷藥物都是以 GPCRs 作為藥物靶點(diǎn)(Cell. Mol. Life Sci. 2006,63 :1149-1164)。盡管GPCRs作為藥物開發(fā)目標(biāo)蛋白的重要性已經(jīng)非常清楚，但是關(guān)于它們?cè)蛹?jí)精細(xì)結(jié)構(gòu)的了解卻相對(duì)較少(Nature 2008，453 :363-368 ；Science 2007，318 1266-1273)，這大大降低了結(jié)構(gòu)依賴性藥物設(shè)計(jì)的針對(duì)性。原因有二 ( 一)天然細(xì)胞或組織中GPCRs的含量很低，需要通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)獲得，然而將它們轉(zhuǎn)運(yùn)嵌入表達(dá)載體質(zhì)膜的效率較低，加之它們對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用，增加了重組表達(dá)的難度。(二)由于膜蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且穩(wěn)定性較差，所以在提純過(guò)程中需要添加去污劑以保持其結(jié)構(gòu)和活性，這對(duì) GPCRs的產(chǎn)量造成一定影響，加之傳統(tǒng)分離工藝的過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，導(dǎo)致最終獲得的高純度蛋白質(zhì)數(shù)量非常有限，僅達(dá)毫克級(jí)。近年來(lái)，隨著新型重組表達(dá)方法的建立，GPCRs的產(chǎn)量有了突破性增長(zhǎng)，表達(dá)量可達(dá)10mg/L以上，但經(jīng)傳統(tǒng)工藝提純后，GPCRs的損失極為嚴(yán)重，損失率高達(dá)90% (PLoS 0ne2009，doi :10. 1371/journal. pone. 0004509)。所以，GPCRs 的提純技術(shù)已經(jīng)成為研究其結(jié)構(gòu)的主要瓶頸之一(Bri. J. Pharmacol. 2006，147 :S27_S37)。目前，急需開發(fā)操作條件更為溫和的新型分離純化技術(shù)來(lái)替代或部分替代GPCRs傳統(tǒng)提純工藝，以滿足膜蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究發(fā)展的需要。超濾膜是指膜孔徑在I-IOOnm之間，具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。由于其孔徑尺寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化O^ood Chem. 2010，122 :747-752)。超濾分離是分子級(jí)的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，同時(shí)使小分子溶質(zhì)透過(guò)；有時(shí)也可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷，再通過(guò)蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達(dá)到分離的目的。目前，在生物加工領(lǐng)域，超濾技術(shù)常用于蛋白質(zhì)的純化與濃縮，在工業(yè)上已有較多應(yīng)用， 但由于自然體系中蛋白質(zhì)種類復(fù)雜，且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高純度的功能蛋白質(zhì)的實(shí)例極少，且這方面的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模(J. Membr. Sci. 2010,352 231-238)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體規(guī)模化制備的超濾提取方法。本發(fā)明采取的技術(shù)路線是(1)將細(xì)胞膜或G蛋白偶聯(lián)受體重組表達(dá)的工程菌菌體等，在表面活性劑濃度為 0-5% (w/v)的緩沖液下破碎、增溶，離心取上清液；(2)利用截留分子量為100_300kDa的超濾膜對(duì)步驟1得到的上清液進(jìn)行超濾分離，截留液即為高純度的G蛋白偶聯(lián)受體產(chǎn)品。超濾分離條件為表面活性劑濃度為0-5% (w/v)，溶液pH值2-10，離子強(qiáng)度O-IM0本發(fā)明提取方法中，步驟(1)中的增溶時(shí)間為30分鐘以上；步驟(1)中的離心條件為4°C，離心力大于1000g，離心時(shí)間大于10分鐘。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，分離濃縮同步進(jìn)行，且產(chǎn)品回收率高，可實(shí)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體規(guī)?；苽涞忍攸c(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1，從基因重組的大腸桿菌中提取G蛋白偶聯(lián)受體CCR3的方法，步驟(1)通過(guò)離心取250mL發(fā)酵液中的菌體，加入40mL的PBS緩沖溶液(50mM，pH8. 0， 表面活性 Fos choline-14(FC-14)濃度為 1. 0% (w/v))，超聲破碎 lh，IOOOOg 離心 30min， 取上清液35mL ；(2)利用PBS緩沖溶液(50mM，pH8. 0)將步驟(1)獲得的35mL上清液稀釋至面活性 choline-14(FC-14)濃度為 0. 02% (w/v)，得到 1. 75L 稀釋液；(3)利用截留分子量為300kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質(zhì)，0. 09m2)對(duì)步驟(2) 獲得的1. 75L稀釋液進(jìn)行分離濃縮至截留液體積為230mL。超濾膜進(jìn)料口和出料口的操作壓力分別為:0. 03MPa和0. 07MPa，流速為3. 8L/h ；(4)將步驟(3)獲得的230mL截留液凍干后，得到G蛋白偶聯(lián)受體CCR3約O.Mg， 產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，G蛋白偶聯(lián)受體CCR3純度高于84. 3%。實(shí)施例2，從基因重組的大腸桿菌中提取G蛋白偶聯(lián)受體CXCR4的方法，步驟(1)通過(guò)離心取200mL發(fā)酵液中的菌體，加入30mL的PBS緩沖溶液(100mM，pH7. 8， 表面活性 N-dodecyl- β -D-maltoside (DM)濃度為 0. 5 % (w/v))，超聲破碎 40min，IOOOOg 離心30min，取上清液^mL ；(2)利用PBS緩沖溶液(lOOmM，pH7. 8)將步驟(1)獲得的^mL上清液稀釋至面活性DM濃度為0.01% (w/v)，得到1. 3L稀釋液；(3)利用截留分子量為IOOkDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質(zhì)，0. 09m2)對(duì)步驟(2) 獲得的1. 3L稀釋液進(jìn)行分離濃縮至截留液體積為200mL。超濾膜進(jìn)料口和出料口的操作壓力分別為:0. 03MPa和0. 07MPa，流速為3. 6L/h ；(4)將步驟(3)獲得的200mL截留液凍干后，得到G蛋白偶聯(lián)受體CXCR4約 0. 414g，產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，G蛋白偶聯(lián)受體CXCR4的純度為85. 6%。
權(quán)利要求
1.G蛋白偶聯(lián)受體的分離提取方法，是以截留分子量為100-300kDa的超濾膜超濾處理G蛋白偶聯(lián)受體的粗酶液，最終獲得高純度的G蛋白偶聯(lián)受體；所述G蛋白偶聯(lián)受體的粗酶液是將細(xì)胞膜或G蛋白偶聯(lián)受體重組表達(dá)的工程菌菌體破碎、表面活性劑增溶、離心后獲得上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取G蛋白偶聯(lián)受體的方法，其特征在于所述用截留分子量為100-300kDa的超濾膜處理時(shí)，表面活性劑濃度為0_5% (w/v)，溶液pH值2_10，離子強(qiáng)度 0-1M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取G蛋白偶聯(lián)受體的方法，其特征在于所述表面活性劑為離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑或兩親性肽分子表面活性劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的G蛋白偶聯(lián)受體的提取方法，其特征在于所述用截留分子量為100-300kDa的超濾膜的組件形式為中空纖維素膜、平板膜或卷式膜。
5.權(quán)利要求1-4所述的提取G蛋白偶聯(lián)受體的方法，經(jīng)操作條件改進(jìn)及超濾膜優(yōu)化，可用于分離和純化其它膜蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提涉及G蛋白偶聯(lián)受體的分離提純方法。其特點(diǎn)是關(guān)鍵工藝確定使用超濾技術(shù)從不同原料中分離提純G蛋白偶聯(lián)受體。本發(fā)明的分離提純方法可獲得純度在80％以上的提取物，得率大于87％。本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單，提取周期短，易于過(guò)程放大等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體的規(guī)?；苽洌哂辛己玫膽?yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K14/72GK102558344SQ20121006071
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者劉建國(guó), 呂建仁, 崔占峰, 葛保勝 申請(qǐng)人:中國(guó)石油大學(xué)(華東)